一种表达L. mesenteroides来源的蔗糖磷酸化酶重组枯草芽孢杆菌

摘要

本发明公开了一种表达L.mesenteroides来源的蔗糖磷酸化酶重组枯草芽孢杆菌，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明通过人工合成SPase基因、设计引物、PCR获得Leuconostoc mesenteroides来源蔗糖磷酸化酶目的基因，构建重组质粒pBSMuL3‑SP，并转化至枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(CCTCC M2016536)，得到重组枯草芽孢杆菌。以此枯草芽孢杆菌为菌种，发酵生产SPase。将重组蔗糖磷酸化酶应用于制备α‑熊果苷具有比较好的效果。本发明以食品安全的枯草芽孢杆菌为表达宿主重组表达蔗糖磷酸化酶，产酶水平高，便于分离纯化，且发酵原料来源广泛，生产成本较低。

说明书

技术领域

本发明涉及一种表达L.mesenteroides来源的蔗糖磷酸化酶重组枯草芽孢杆菌，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7，Sucrose Phosphorylase,SPase)，是GH13家族中的一员，是催化转移葡萄糖苷键的特异性酶。主要催化2种类型的反应：一是将1-磷酸葡萄糖中的葡萄糖基转移至受体；二是将蔗糖中的葡萄糖基转移至受体，受体包括无机磷酸、水、含酚羟基、醇羟基及羧基的物质。当以酚羟基作为受体时转化产物为α-熊果苷。α-熊果苷作为一种国际上正在极力推广的高功效医药、化妆品添加剂，在国内外有巨大的需求，在化妆品美白祛斑领域占据重要的地位。据调研α-熊果苷的市场价值约每公斤3800元，而其原料对苯二酚的市场价值约66元每公斤，所以α-熊果苷是一种高附加值的产物，如果能够实现产业化生产将会带来非常大的经济收益。蔗糖磷酸化酶还可催化合成某些不稳定物质的衍生物，提高其稳定性。因此，蔗糖磷酸化酶在食品、化妆品及医药方面有广泛的应用价值。

蔗糖磷酸化酶属胞内酶，酶的基因主要来源于肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、嗜糖假单胞菌(Pseudomonassaccharophila)、长双歧杆菌(Bidifobacterium longum)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)。目前L.mesenteroides来源的蔗糖磷酸化酶只在大肠杆菌中获得异源表达，但是大肠杆菌容易产生内毒素，不适合应用于医药、化妆品等行业。

发明内容

为解决上述问题，本发明首次以适于食品使用的枯草芽孢杆菌为宿主菌构建了重组表达L.mesenteroides来源的蔗糖磷酸化酶菌株，电泳结果显示蔗糖磷酸化酶获得了高水平表达，为α-熊果苷的工业化制备奠定了基础。

本发明的第一个目的是提供一种重组表达L.mesenteroides来源蔗糖磷酸化酶的重组枯草芽孢杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以保藏编号为CCTCC M2016536的枯草芽孢杆菌为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)168为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pBSMuL3。

本发明的第二个目的是提供所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖磷酸化酶的基因与表达载体连接，转入枯草芽孢杆菌中。

在本发明的一种实施方式中，所述编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖磷酸化酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌包括保藏编号为CCTCC M2016536的枯草芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌168。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pBSMuL3。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法具体如下：

1)扩增编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖磷酸化酶的基因；

2)将克隆出的目的基因连接到pMD-18T，构建成为重组载体pMD-18T-sp，转化至E.coliJM109进一步克隆，酶切后将目的基因连接到表达载体pBSMuL3，命名为pBSMuL3-sp。

3)将重组质粒pBSMuL3-sp通过电转化进入枯草芽孢杆菌表达宿主，获得重组表达蔗糖磷酸化酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌。

本发明的第三个目的是提供所述枯草芽孢杆菌在生产蔗糖磷酸化酶中的应用，所述应用是将所述枯草芽孢杆菌接种至发酵培养基中，于30～35℃，200～250rpm培养24～72h。

本发明的第四个目的是提供所述枯草芽孢杆菌在生产α-熊果苷中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是将所述的枯草芽孢杆菌培养24～48h后的发酵液离心得到粗酶液；以摩尔比为1:1～8的对苯二酚和蔗糖为底物，按5000～10000U/g底物的添加量加入酶液，于30～35℃，pH 6.8～7.2反应12～48h。

本发明的第五个目的是提供一种蔗糖磷酸化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供所述基因工程菌在食品、医药、化工领域的应用。

有益效果：本发明以食品准入的枯草芽孢杆菌为宿主构建了表达L.mesenteroides来源的蔗糖磷酸化酶的重组枯草芽孢杆菌，酶活达162.19U/mL，应用该重组酶生产α-熊果苷，其在30℃下反应24小时，然后在40℃下用糖化酶处理3小时时底物转化率达83.6％，为α-熊果苷的工业化制备奠定了基础。

附图说明

图1重组质粒pBSMuL3-sp的构建过程图；

图2pMD18T-sp双酶切验证图；从左至右，泳道1为5000Marker，2-3为蔗糖磷酸化酶连接表达载体酶切验证；

图3pBSMuL3-sp重组质粒的双酶切验证图；从左至右，泳道1为10000bp Marker，泳道2～3为蔗糖磷酸化酶连接表达载体酶切验证；

图4pBSMuL3-sp重组菌摇瓶发酵SDS-PAGE电泳图，泳道1～3为13h胞外上清、13h破壁上清、13h破壁沉淀；泳道4为中分子量蛋白marker，泳道5～7为24h胞外上清、24h破壁上清、24h破壁沉淀；泳道8～10为43h胞外上清、43h破壁上清、43h破壁沉淀；

图5最高转化率的酶转化HPLC色谱图。

具体实施方式

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(保藏编号为CCTCC M 2016536)已在申请号为201611025858.9的专利申请中公开。

酶活的测定方法：将1mL 5％的蔗糖溶液和0.9mL的50mmol/L，pH 6.7的磷酸缓冲液充分混匀，在30℃预热10min，加入100ul的酶液，反应10min后加入3mLDNS，煮沸7min迅速冷却，加蒸馏水定容至15ml，540nm下测吸光度(以灭活的酶液为催化剂同样操作作为空白对照)。

酶活定义：将每分钟水解蔗糖生成1μmol的果糖所需酶量定义为蔗糖磷酸化酶的一个单位的酶活力(U)。

产物的HPLC检测：最终反应体系中的α-熊果苷的量采用HPLC来确定。色谱条件为：采用HPLC(高效液相色谱法)进行产物分析具体色谱条件是:Agilent 1200 HPLC色谱仪器，Agilent自动进样器，Agilent SB-Aq 5μm(4.6mm×250mm)，Agilent LC-9A紫外检测器系统；流动相按照80％(体积分数)的10mM的稀磷酸-20％甲醇溶液的配方配置，流动相的流速为0.6mL·min^-1；紫外检测波长为281nm，用C-18柱和糖柱分别测定样品中α-熊果苷和单糖和多糖的含量，柱温35℃。

α-熊果苷的转苷效率D的计算公式为：

D(％)＝M₁/M₂*100％

其中：

D：对苯二酚转化为α-熊果苷的摩尔转化率(％)；

M₁：酶转化反应中生成的α-熊果苷的摩尔数(mol)；

M₂：投入到反应液中的对苯二酚的摩尔数(mol)。

实施例1：肠膜明串珠菌蔗糖磷酸化酶编码基因的克隆及表达载体的构建

按图1的流程进行表达载体的构建，根据合成的蔗糖磷酸化酶基因设计引物F、R：

F：5’-GCGAAGCTTAAGGAGGATATTATGGAAATTCAGAACAAGGC-3’

R：5’-GCGGGATCCTTAATTCTGGGTCAGATTATCGC-3’

所述限制性酶切位点加下划线的字母表示。PCR体系为：20μM引物F和R各0.5μL，dNTPMix 4μL，5×PS Buffer 10μL，2.5U/μL的PrimeStar聚合酶0.5uL，模板0.5μL，加双蒸水补齐50μL。PCR条件：94℃预变性4min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸1min50s，30个循环。将PCR产物进行胶回收、加A纯化后与克隆载体pMD-18T连接，酶切回收目的基因将其与表达载体pBSMuL3进行双酶切，并于16℃连接过夜，转化E.coli JM109，涂布含有氨苄(100μg/mL)抗性的LB平板，37℃培养10-12h，挑取转化子，提取重组质粒并双酶切验证。如图3所示，酶切后有两条片段，大小分别为7000bp左右(表达载体pBSMuL3)和1473bp(蔗糖磷酸化酶)即连接成功。然后对验证正确的重组质粒测定DNA序列，阳性克隆子即pBSMuL3-sp。

实施例2：重组质粒pBSMuL3-sp的转化

1)新鲜LB平板(LB固体培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，0.2g/L琼脂粉)挑枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(保藏编号为CCTCC M 2016536)单菌落接种于5mlLB液体培养基中，37℃，200rpm培养10h。

2)取2.5mL转接入40mL加0.5M的山梨醇LB培养基，37℃，200rpm震荡培养四个小时。

3)取全部菌液冰水浴10min，然后5000rpm，4℃，离心5min收集菌体。

4)用40ml预冷的电转缓冲液(山梨醇0.5M，甘露醇0.5M，葡萄糖10％)洗涤菌体，5000rpm，4℃，离心5min去上清，如此漂洗4次。

5)将洗涤后的菌体重悬于1mL电转培养基中，分装到1.5mL EP管中，每管装300μl感受态细胞。

6)将300μL感受态细胞中加入10μL重组质粒，冰浴孵育15min，加入预冷的电转杯(2mm)中，电击一次。电转仪设置：2.4kv，25uF，200Ω，电击1次。

7)电击完毕立即加入1mL复苏培养基RM(山梨醇0.5M，甘露醇0.38M，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L)吹吸，37℃，200rpm，复苏3h后，涂板。37℃，过夜培养，挑取菌落至LB卡那霉素培养基中，进行验证，酶切后表达载体和目的基因条带大小一一对应即验证正确，然后进行摇瓶发酵产酶。

实施例3:摇瓶发酵产酶

将实施例2中得到的重组枯草芽孢杆菌菌株接种于LB培养基中，在37℃下培养8h后以5％接种量转接至TB发酵培养基中，先放至37℃、200rpm恒温培养2h，再移至33℃恒温培养48h产酶。发酵结束后，离心收集上清液即为粗酶液。

LB培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 10。

TB培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉24，甘油5，K₂HPO₄·3H₂O>2PO₄2.31。

对粗酶液中的酶活进行测定，结果显示，酶活力为136U/mL。蛋白电泳结果显示在53kDa处有一条与理论分子量一致的条带(图4)。

实施例4：酶转化法制备α-熊果苷

在50mL的密闭的容器中进行10mL的酶转化体系。以对苯二酚为受体分子，蔗糖作为供体进行SPase转糖基反应。反应体系包括：在20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)中加入供受体的摩尔比例为4:1的蔗糖和HQ以及7500U/g对苯二酚的SPase，将其在30℃下反应24h。沸水浴中加热5min终止反应。然后在40℃下用糖化酶处理3h并进一步加热灭活，离心并通过HPLC分析产物。当反应结束后转化率可达83.64％，色谱峰见图5。

实施例5

采用实施例1～3相同策略构建重组枯草芽孢杆菌，区别在于，将宿主替换为枯草芽孢杆菌168，经检测，酶活达113U/mL。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种表达L. mesenteroides来源的蔗糖磷酸化酶重组枯草芽孢杆菌

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 490

<212> PRT

<213> 肠膜明串珠菌 Leuconostoc mesenteroides

<400> 1

Met Glu Ile Gln Asn Lys Ala Met Leu Ile Thr Tyr Ala Asp Ser Leu

1 5 1015

Gly Lys Asn Leu Lys Asp Val His Gln Val Leu Lys Glu Asp Ile Gly

202530

Asp Ala Ile Gly Gly Val His Leu Leu Pro Phe Phe Pro Ser Thr Gly

354045

Asp Arg Gly Phe Ala Pro Ala Asp Tyr Thr Arg Val Asp Ala Ala Phe

505560

Gly Asp Trp Ala Asp Val Glu Ala Leu Gly Glu Glu Tyr Tyr Leu Met

65707580

Phe Asp Phe Met Ile Asn His Ile Ser Arg Glu Ser Val Met Tyr Gln

859095

Asp Phe Lys Lys Asn His Asp Asp Ser Lys Tyr Lys Asp Phe Phe Ile

100 105 110

Arg Trp Glu Lys Phe Trp Ala Lys Ala Gly Glu Asn Arg Pro Thr Gln

115 120 125

Ala Asp Val Asp Leu Ile Tyr Lys Arg Lys Asp Lys Ala Pro Thr Gln

130 135 140

Glu Ile Thr Phe Asp Asp Gly Thr Thr Glu Asn Leu Trp Asn Thr Phe

145 150 155 160

Gly Glu Glu Gln Ile Asp Ile Asp Val Asn Ser Ala Ile Ala Lys Glu

165 170 175

Phe Ile Lys Thr Thr Leu Glu Asp Met Val Lys His Gly Ala Asn Leu

180 185 190

Ile Arg Leu Asp Ala Phe Ala Tyr Ala Val Lys Lys Val Asp Thr Asn

195 200 205

Asp Phe Phe Val Glu Pro Glu Ile Trp Asp Thr Leu Asn Glu Val Arg

210 215 220

Glu Ile Leu Thr Pro Leu Lys Ala Glu Ile Leu Pro Glu Ile His Glu

225 230 235 240

His Tyr Ser Ile Pro Lys Lys Ile Asn Asp His Gly Tyr Phe Thr Tyr

245 250 255

Asp Phe Ala Leu Pro Met Thr Thr Leu Tyr Thr Leu Tyr Ser Gly Lys

260 265 270

Thr Asn Gln Leu Ala Lys Trp Leu Lys Met Ser Pro Met Lys Gln Phe

275 280 285

Thr Thr Leu Asp Thr His Asp Gly Ile Gly Val Val Asp Ala Arg Asp

290 295 300

Ile Leu Thr Asp Asp Glu Ile Asp Tyr Ala Ser Glu Gln Leu Tyr Lys

305 310 315 320

Val Gly Ala Asn Val Lys Lys Thr Tyr Ser Ser Ala Ser Tyr Asn Asn

325 330 335

Leu Asp Ile Tyr Gln Ile Asn Ser Thr Tyr Tyr Ser Ala Leu Gly Asn

340 345 350

Asp Asp Ala Ala Tyr Leu Leu Ser Arg Val Phe Gln Val Phe Ala Pro

355 360 365

Gly Ile Pro Gln Ile Tyr Tyr Val Gly Leu Leu Ala Gly Glu Asn Asp

370 375 380

Ile Ala Leu Leu Glu Ser Thr Lys Glu Gly Arg Asn Ile Asn Arg His

385 390 395 400

Tyr Tyr Thr Arg Glu Glu Val Lys Ser Glu Val Lys Arg Pro Val Val

405 410 415

Ala Asn Leu Leu Lys Leu Leu Ser Trp Arg Asn Glu Ser Pro Ala Phe

420 425 430

Asp Leu Ala Gly Ser Ile Thr Val Asp Thr Pro Thr Asp Thr Thr Ile

435 440 445

Val Val Thr Arg Gln Asp Glu Asn Gly Gln Asn Lys Ala Val Leu Thr

450 455 460

Ala Asp Ala Ala Asn Lys Thr Phe Glu Ile Val Glu Asn Gly Gln Thr

465 470 475 480

Val Met Ser Ser Asp Asn Leu Thr Gln Asn

485 490

<210> 2

<211> 1473

<212> DNA

<213> 肠膜明串珠菌 Leuconostoc mesenteroides

<400> 2

atggaaattc agaacaaggc catgttaatt acctatgcag atagcttagg caaaaatctg 60

aaagatgttc atcaggttct gaaagaagat attggagatg ccattggcgg tgttcatctg 120

ctgccgtttt tcccgtcaac cggcgatcgc ggctttgccc cagcagatta tacccgcgtg 180

gatgcagcct ttggcgattg ggccgatgtg gaagccttag gtgaagaata ttatctgatg 240

tttgatttta tgattaatca tatttcacgc gaatcagtta tgtatcagga ttttaagaag 300

aaccatgatg atagtaaata taaggacttc tttattcgct gggaaaaatt ttgggccaaa 360

gcaggcgaaa atcgtccgac ccaggccgat gtggatctga tctataagcg caaagataaa 420

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ggcgaagaac agattgatat tgatgtgaat agcgccattg ccaaagagtt cattaaaacc 540

accttagaag atatggttaa acatggcgcc aaccttattc gcttagatgc ctttgcctat 600

gccgttaaaa aagtggatac caatgacttc ttcgttgaac cggaaatttg ggataccctg 660

aacgaagtgc gcgaaattct gaccccgctg aaagccgaaa ttctgccgga aattcatgaa 720

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ccgatgacca ccctgtatac cctgtatagc ggcaaaacca atcagttagc caaatggctg 840

aaaatgtctc cgatgaaaca gtttaccacc ttagataccc atgatggcat tggtgttgtg 900

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gtgggcgcca atgttaaaaa gacctatagc tcagcaagct ataacaatct ggacatctat 1020

cagattaata gtacctatta tagtgcactg ggtaatgatg atgcagcata tctgctgtct 1080

cgcgtgtttc aggtgtttgc accgggcatt ccgcaaatct actatgtggg cttactggcc 1140

ggtgaaaatg atattgccct gctggaatca accaaagaag gtcgtaatat taatcgtcat 1200

tattataccc gcgaagaagt taaatcagaa gttaaacgtc cggttgttgc caacctgctg 1260

aaactgctgt cttggcgtaa cgagtctccg gcctttgatc tggcaggctc tattaccgtg 1320

gataccccga ccgataccac cattgttgtg acccgccagg atgaaaatgg tcagaataag 1380

gcagtgctga ccgcagatgc agccaataag acctttgaaa ttgtggaaaa tggtcagacc 1440

gttatgtcta gcgataatct gacccagaat taa 1473