新型透明质酸结合肽及透皮吸收与皮下靶向释放制剂

摘要

本发明为设计一种新型透明质酸结合肽及透皮吸收与皮下靶向释放制剂，设计能够与透明质酸特异性结合的HaBP，将该HaBP与细胞穿透肽、HA以一定条件孵育混合，以及将HaBP、细胞穿透肽、皮下内源性蛋白酶酶切位点三部分连接在一起构建为融合蛋白后与HA孵育，均可显著促进透明质酸的跨膜转运及透皮吸收，并实现HA的皮下靶向释放。本发明方法克服了透明质酸作为生物大分子物质所具有的透皮吸收性低的缺陷，使透明质酸可以高效跨越皮肤角质层，并在皮下靶向释放发挥促进细胞增殖以发挥其在护肤、保湿、祛皱、美白等方面的实际功效，为相关美容产品和生物药物的开发生产提供了一种新思路与新方法。

说明书

技术领域

本发明属于化妆品及生物医药领域，是一种新型透明质酸结合肽及其促进透明质酸透皮吸收与皮下靶向释放的方法及其在美容和生物医药中的应用。

背景技术

透明质酸(Hyaluronic acid，HA)是一种直链高分子多糖，广泛地存在于生物体的结缔组织中,是组成细胞外基质的几种糖胺聚糖之一，在人的皮肤真皮层和关节滑液中含量最多,具有保水、润滑等重要的生理作用。其天然性、无过敏性和与人体组织良好的生物相容性,在化妆品、保健食品、美容手术和医药领域得到广泛的应用。然而，作为一种生物大分子，透皮率低一直是困扰其实际应用的重大问题。细胞穿膜肽(cell-penetratingpeptides，CPP)是一种能够携带蛋白质等多种外源性物质进入细胞的小分子多肽，实现物质细胞内化，高效透皮性。为获得一种促进HA高效透皮吸收及皮下靶向释放的方法，本发明设计了一种新型透明质酸结合肽HaBP及其进一步衍生的融合蛋白PMH，并建立了其促进透明质酸透皮吸收与皮下靶向释放的方法。

发明内容

本发明的目的在于克服生物大分子物质HA低透皮性的缺陷，设计一种新型透明质酸结合肽HaBP及其进一步衍生的融合蛋白PMH，并建立了其促进透明质酸透皮吸收与皮下靶向释放的方法。本发明获得的HaBP及PMH可促使HA高效跨膜转运、透过皮肤角质层细胞，并在皮下靶向定位释放，从而增强其提高皮肤弹性、锁水去皱等功效的发挥效力，为生物美容产品和生物药物的生产提供了一种新思路与新方法。

本发明实现目的的技术方案如下：

一种透明质酸结合肽HaBP，其蛋白序列见序列1所示。

一种融合蛋白PMH，其蛋白序列见序列2所示。

一种透明质酸结合肽透皮吸收与皮下靶向制剂，将HaBP与细胞穿膜肽、HA三者混合孵育获得，孵育条件为：HaBP:细胞穿膜肽:HA的比例为1:1:8，先将HaBP与细胞穿膜肽混合均匀后加入HA，37℃孵育1h。

一种透明质酸结合肽透皮吸收与皮下靶向制剂，其特征在于：将透明质酸结合肽HaBP、细胞穿膜肽、皮下内源性蛋白酶酶切位点三部分连接在一起构建为融合蛋白，然后与HA孵育后获得。

而且，所述细胞穿膜肽为包括Pep-1、TAT、MPG或多聚精氨酸。

而且，融合蛋白PMH的基本组成情况是在HaBP的N端引入细胞穿膜肽，以皮下内源性表达的蛋白酶酶切位点作为二者的连接臂，将三者拼接在一起。

而且，所述皮下内源性表达的蛋白酶为基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9、胶原酶、明胶酶、溶基质素、角蛋白酶或组织蛋白酶。

透明质酸结合肽作为制有护肤、保湿、祛皱、美白化妆品的应用。

融合蛋白PMH作为制有护肤、保湿、祛皱、美白化妆品的应用。

本发明的有益效果和优点是：

1、本发明成功的设计了一种新型透明质酸结合肽HaBP及其进一步衍生的融合蛋白PMH，并建立了其促进透明质酸透皮吸收与皮下靶向释放的方法，可很好的克服HA作为生物大分子所存在的透皮吸收率底下的缺陷，为生物美容产品和生物药物的研发生产提供了一种新方法与新视角。

2、本发明建立了这种高透皮吸收、皮下靶向释放型PMH的基因工程表达方法，为其产业化奠定了基础。

3、本发明方法克服了透明质酸作为生物大分子物质所具有的透皮性低的缺陷，使透明质酸可以高效跨越皮肤角质层，并在皮下靶向释放发挥促进细胞增殖以发挥其在护肤、保湿、祛皱、美白等方面的实际功效，为相关美容产品和生物药物的开发生产提供了一种新思路与新方法。

附图说明

图1为本发明重组质粒(以大肠杆菌表达质粒pGST-6P-3-PMH为例)图谱；

图2为本发明重组质粒(以大肠杆菌表达质粒pGST-6P-3-PMH为例)双酶切验证图，泳道1是pGST-6P-3空载质粒被EcoR I和Xho I双酶切结果，泳道2是重组质粒pGST-6P-3-PMH为被EcoR I和Xho I双酶切结果，泳道3是PMH基因PCR产物。

图3为融合蛋白的载体优化表达，泳道1、2、3、4、5、6分别是已pSUMO为载体PMH分别在BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、Rossetta(DE3)等宿主菌中的表达，泳道7、8、9、10、11、12分别是已pGST-6P-3为载体PMH分别在BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、Rossetta(DE3)等宿主菌中的表达。

图4为HaBP促进HA跨越角质细胞的转运能力分析。

图5为小鼠实验中HaBP对HA透皮吸收能力的促进作用分析结果(红色为HA)。

图6为小鼠实验中血清IgE检测1：对照组；2：仅CPP组；3：仅HaBP组；4：仅HA组；5：PMH组。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明为设计一种新型透明质酸结合肽(HaBP)及其促进透明质酸透皮吸收与皮下靶向释放的方法。根据透明质酸结合蛋白的结构特点，设计能够与透明质酸(HA)特异性结合的HaBP，将该HaBP与细胞穿膜肽、HA以一定条件孵育混合，以及将HaBP、细胞穿膜肽、皮下内源性蛋白酶酶切位点三部分连接在一起构建为融合蛋白后与HA孵育，均可显著促进透明质酸的跨膜转运及透皮吸收，并实现HA的皮下靶向释放。

本发明根据透明质酸结合蛋白的结构特点，在生物信息学分析的指导下设计一种新型透明质酸结合肽HaBP，通过将HaBP与细胞穿膜肽、HA三者以一定条件孵育混合，或者将HaBP、细胞穿膜肽、皮下内源性蛋白酶酶切位点三部分连接在一起构建为融合蛋白PMH，然后与HA孵育的方法，实现HA的高效跨膜转运、透过皮肤角质层细胞，并在皮下靶向定位释放，从而增强其提高皮肤弹性、锁水去皱等功效的发挥效力。其中HaBP、细胞穿膜肽及融合蛋白PMH的制备获得，可以采用化学合成法，也可以采用基因工程表达生产方法。

一、高透皮吸收、皮下靶向释放型PMH的构建方法，融合蛋白PMH的基本组成情况是在HaBP的N端引入细胞穿膜肽，以皮下内源性表达的蛋白酶酶切位点作为二者的连接臂，将三者拼接在一起。

具体步骤如下：

以下表中引物进行PCR扩增

在引物P1、P2中分别引入EcoR I和XhoI酶切位点(下划线部分)。PCR步骤：以人工合成的细胞穿膜肽和HaBP基因为模板(序列详见后文附录)，利用引物1和引物2为引物进行PCR扩增得到目的基因PMH。具体体系及扩增条件如下：

扩增PMH的PCR反应体系

二、PMH的基因工程诱导表达(以大肠杆菌表达系统为例)

1、将PMH基因插入到表达载体(以pGST-6P-3为例)的多克隆位点，构建得到PMH重组质粒。

将PMH基因和pGST-6P-3质粒用EcoR I和Xho I双酶切后，经T4DNA连接酶16℃水浴过夜连接，转化大肠杆菌DH5α，在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基平板上，培养12h后挑取单克隆，提取质粒用EcoR I和XhoI双酶切验证，琼脂糖凝胶电泳检测有266bp PMH目的片段的重组质粒经测序鉴定正确后，命名为pGST-6P-3-PMH(见图1)。

构建质粒所需连接体系

2、将pGST-6P-3-PMH重组质粒转化大肠杆菌，得到PMH重组大肠杆菌

采用化转法，将pGST-6P-3-PMH转化E.coli DH5α大肠杆菌感受态细胞，获得PMH重组大肠杆菌，化转法具体步骤如下：

冰上溶解E.coli DH5α感受态细胞，将10μl连接产物加入到感受态细胞中，冰浴30min，注意感受态必须放置冰上，勿用手摸。42℃水浴热击90s，不要振动。将混合物迅速转置冰浴2min，让细胞完全闭合，向每个EP管加入900μl LB液体培养基后于37℃，220r/min振荡培养40min。8000r/min离心1min去掉900μl上清，剩余100μl吹悬混匀转化产物，涂布于含抗生素的LB固体平板上，将平板正置20min后倒置平皿37℃培养过夜。与此同时，感受态细胞菌种要进行对照试验，确保其在含有抗生素的平板里不能正常生长。挑取阳性单克隆经过质粒酶切验证及测序确定正确性(图1)。

3、诱导表达

将重组质粒pGST-6P-3-PMH转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、Rossetta(DE3)等中，以1％接菌量接种于100ml LB培养基(含有2％甘油)中培养至OD600≈0.8时，加入0.1mM IPTG诱导其蛋白表达。诱导条件为：30℃，200r/min过夜培养。表达后进行SDS-PAGE检测(图2)。

三、重组蛋白的分离纯化

1、可融蛋白的洗涤

(1)诱导目的蛋白表达后，于4℃离心机中10000r/min离心15min收集菌体，按每1.5g湿菌体用50ml PBS(pH 7.4)重悬菌体，并超声裂解菌体。

(2)4℃12000r/min离心15min，收集上清，并用0.45μm的滤膜过滤。

2、可融蛋白的纯化

由于目的蛋白带有GST标签，因此可以用与固定的谷胱甘肽(GSH)通过硫键共价亲和层析的方法纯化。这里主要使用GE公司的Glutathione Sepharose 4B层析柱进行纯化，其纯化方法如下：

(1)柱平衡：用5倍体积的Binding Buffer平衡柱子，平衡后即可上样。

(2)上样：样品负载上柱，流速为10倍柱体积/小时，收集流穿液。

(3)样品流尽后加入10倍柱体积的washing buffer；

(4)每毫升柱体加0.5ml elution buffer洗脱，重复三次，并收集洗脱液；

(5)将收集到的洗脱液用截留分子尺寸10kD的超滤管进行buffer置换和浓缩；

(6)用SDS-PAGE检测各洗脱峰收集的蛋白，从中得到GST融合的PMH蛋白(图2)。

(7)利用构建质粒时再GST与PMH之间引入的酶切位点(Xa因子、肠激酶、凝血酶、TEV酶等均可)对所获得的融合蛋白进行酶切处理，然后再次利用GST亲和层析将切去的GST标签以及因酶切不完全而剩余的融合蛋白，与去除GST标签的PMH蛋白分离开来，获得纯化后的PMH蛋白。

四、免疫荧光检测透明质酸跨越角质细胞转运的能力(以HaBP为例)

(1)前期细胞培养：Hacat人永生化表皮细胞用含10％肽牛血清的完全培养液MEM于37℃、5％CO₂条件下培养。培养至一定密度消化后取500μl接种于24孔板中，培养24h。

(2)加药：将Pep-1、HaBP和HA等物质按不同比例或者将融合表达的PMH蛋白用无血清培养基梯度稀释，弃去旧培养液，每孔加入500μl梯度稀释的样品，继续培养24h。

(2)洗涤：弃去细胞培养液，用cell PBS清洗3次，每次5min。

(3)固定：4％多聚甲醛对细胞进行固定室温45min，再用cell PBS清洗3次，每次5min。

(4)通透化：0.3％Triton的透膜剂覆盖细胞，透膜处理30min，再用cell PBS清洗3次，每次5min。

(5)封闭：兔血清封闭液(1:20稀释)37℃封闭1h。

(6)一抗孵育用HA的抗体(1:200稀释)4℃过夜孵育，次日于室温下放置1h，再用PBS清洗3次，每次5min。

(7)二抗孵育与染核：用Alexa 标记兔抗绵羊lgG抗体(1:200稀释)+DAPI(1:1000稀释)混合溶液，加入24孔板中37℃避光孵育1h，再用cell PBS清洗3次，每次5min。

(8)用共聚焦显微镜照相，观察透明质酸在细胞内的分布情况(图3)。

实验结果表明：Pep-1可以携带HaBP穿入角质层细胞，而HaBP是HA受体的一部分氨基酸序列，因此从理论上来讲HaBP可以以类似于桥梁纽带的形式，连接Pep-1与HA，从而与Pep-1协同性促进HA跨膜转运。与control及仅含HA的实验组相比，Pep-1可促进HA的跨膜转运能力，而HaBP的存在则可进一步增强这一作用。

五、本发明原料及方法对小鼠皮肤的透皮吸收能力及致敏性分析

(1)健康周龄4周20只昆明种小鼠，雌雄各半，使其自由进食和饮水，第一周使其适应环境。

(2)脱毛：小鼠的下背部及臀部毛发均匀涂抹人用脱毛膏(薇婷)，作用三分钟，用医用棉蘸清水清洗干净，恢复三天开始试验，注意小鼠保暖。

(3)实验分组：根据体重随机分为5组，分别为阴性对照组1组、Pep-1组2组、HaBP组3组、透明质酸组4组和样品组(Pep-1+HaBP+HA)5组，每组四只，做好标记。

(4)涂药：为小鼠注射0.1ml异戊巴比妥，使其麻醉。在脱毛后的皮肤上分出区域，左边涂抹0.9％的NaCl溶液200μl，右边分别涂抹对应药物各200μl。

(5)透皮吸收能力及致敏性分析：每日监测皮肤外观变化情况，连续七天。在第7天时，通过眼眶取血，将血浆迅速离心(3000转/分，20分钟)后取上层血清，立即-80℃冻存待检。同时用手术刀切取试验部位皮肤标本，石蜡包埋制备组织切片后，利用HA抗体进行免疫组化分析、应用lgE ELISA试剂盒检测血清中IgE水平(图4，图5)。

实验结果表明：与对照组相比，单独涂抹Pep-1、HaBP及HA和三者混合涂抹后的小鼠的IgE均没有明显的变化，而致敏阳性对照组IgE含量增加了约1.2倍。这些结果提示我们：Pep-1/HaBP在协同促进HA透皮吸收时，三者的混合物对皮肤不会产生一定的致敏风险。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津科技大学

<120> 新型透明质酸结合肽及透皮吸收与皮下靶向释放制剂

<130> 2017-03-27

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 31

<212> PRT

<213> HaBP的氨基酸序列

<400> 1

Lys Gln Lys Ile Lys His Val Val Lys Leu Lys Asp Glu Asn Ser Gln

1 5 1015

Leu Lys Ser Glu Val Ser Lys Leu Arg Cys Gln Leu Ala Lys Lys

202530

<210> 2

<211> 73

<212> PRT

<213> PMH的氨基酸序列

<400> 2

Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys

1 5 1015

Lys Lys Arg Lys Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

202530

Gly Gly Gly Thr Pro Leu Gly Leu Ala Gly Lys Gln Lys Ile Lys His

354045

Val Val Lys Leu Lys Asp Glu Asn Ser Gln Leu Lys Ser Glu Val Ser

505560

Lys Leu Arg Cys Gln Leu Ala Lys Lys

6570

<210> 3

<211> 63

<212> DNA

<213> 细胞穿膜肽（以Pep-1为例）基因序列

<400> 3

aaagaaacct ggtgggaaac ctggtggacc gaatggtctc agccgaaaaa aaaacgtaaa 60

gtg 63

<210> 4

<211> 93

<212> DNA

<213> HaBP基因序列

<400> 4

aaacagaaaa ttaaacatgt ggtgaaactg aaagatgaaa atagccagct gaaaagcgaa 60

gtgagcaaac tgcgttgcca gctggcgaaa aaa 93