一种奇球菌T1R5及其在辐射保护中的应用

摘要

本发明公开一种奇球菌T1R5及其在辐射保护中的应用，通过在新疆和硕盐碱地区干旱区土壤样品中分离筛选出一株奇球菌新种（

说明书

技术领域

本发明涉及微生物菌种及其应用的技术领域，具体的涉及一种新的耐辐射细菌及其在制备辐射保护制剂中应用的技术领域。

背景技术

奇球菌是一种粉红色 、非孢子 、非致病的革兰氏阳性微球菌，菌落呈凸状，表面光滑，分离纯化后测定其菌体直径在 10 ～ 25 μ m 之间，分裂方式为单个、成对或者多个平面分裂。由于奇球菌的形态与微球菌属（Micrococcus）相似，在发现之初被命名为Micrococcus>。30年后，科学家重新对其进行了分类，将其归于与其亲缘关系最近的一个新的Deinococ->科和Deinococcus属(奇球菌属)。目前已知的奇球菌属Deinococcus>2O₂以及其他一些因素所导致的DNA和蛋白质的损伤都具有极强的耐受与抵抗能力。奇球菌独特的生物学特性、生理机制和遗传机制逐渐引起研究人员的兴趣。

目前全世界共有8个国家进行了2000多次核试验。这些核试验对各试验场地及周边地区都造成不同程度、不同性质的放射性污染，对局部地区人们的健康和生存造成一定影响。截至2014年12月31日，全球共有437座运行中核动力堆，此外还有100多座核电站正在建设中，核技术利用已从军事领域逐步走向人们的生活，核技术在惠及人类的同时负面效应也日益凸显。随着世界核安全形势紧张带来的核战争和核恐怖事件隐忧，辐射损伤的防护与救治正在受到越来越多的重视。我国每年有300多万癌症病人需术后放疗，放疗在杀死癌细胞的同时，会导致周边正常组织和器官乃至全身的急性辐射损伤，放疗的副反应严重地限制了放射治疗在肿瘤治疗中的广泛应用。

当前对于辐射损伤的救治主要采用药物治疗，相关药物包括含硫化合物、激素类、细胞因子类以及中草药等，含硫化合物普遍存在副作用较大的问题；使用激素类药物会对性器官和生殖系统有影响，细胞因子类药物例如白介素类、集落刺激因子类药物的辐射防护作用受到给药时间的影响，因给药时间的不同产生不同的作用；酚类、多糖类、天然黄酮类等中草药类抗辐射药物具有活性成分不明确、低毒等特点。以上药物总体上存在治疗效果缓慢、副作用大等缺点。耐辐射微生物是一类能够在高辐射剂量下生存的极端微生物资源，其具有超强的DNA损伤修复能力以及清除细胞内多种自由基的能力，通过该能力使得耐辐射微生物能够在高辐射环境下生存并繁衍。

尽管目前有许多利用微生物进行生物修复的报道，但迄今为止，利用耐辐射微生物在预防和治疗辐射造成的相关损伤救治和疾病治疗方面及用于制备相关药物中的应用尚未见报道。因此需要进一步探究耐辐射微生物的耐辐射特性，为辐射损伤和疾病提供具有预防和治疗的抗性菌株，对于生物防治技术领域具有现实意义。

发明内容

针对现有技术中有关奇球菌在辐射保护制剂方面的研究记载较少的技术现状，且分离筛选新的菌种对γ射线具有较强的耐受性的技术现状，本发明旨在为微生物治疗辐射损伤及疾病提供具有相对高耐受性且性能稳定的新的抗性菌株，提供一种新菌种奇球菌T1R5及其在辐射保护中的应用。本发明通过在新疆和硕盐碱地区干旱区土壤样品中分离筛选出一株奇球菌新种（Deinococcus>）T1R5 CGMCC No.12800，利用分离出的菌种制备辐射保护制剂，应用到辐射动物中，可显著提高辐射后动物的成活率，对于应用耐辐射微生物菌种应用技术领域具有广泛的应用价值。

本发明采用的主要技术方案：

本发明通过从新疆和硕盐碱地区干旱区土壤样品中筛选、分离，从中筛选得到出一株可应用于辐射保护方面的奇球菌新种T1R5。利用本发明分离筛选出的编号为T1R5的细菌菌株制备辐射保护制剂，应用到昆明鼠等辐射动物中，能够在20KGry剂量的γ射线辐射下存活，可显著提高辐射动物的成活率，利用本发明提供的奇球菌新种T1R5制备辐射保护制剂具有非常大的应用前景。

本发明具体提供一种奇球菌新种（Deinococcus>）T1R5 CGMCC No.12800。通过从新疆和硕盐碱地区干旱区土壤样品中分离得到取样，筛选出一株细菌奇球菌（Deinococcus>）T1R5，该菌，能够在20KGry剂量的γ射线辐射下存活，具有较高的耐辐射特性。

本发明根据新疆地理环境的特殊性和新疆极端环境微生物资源的富集地特点，通过从新疆和硕盐碱地区干旱区土壤样品中进行微生物菌种的培养、分离与筛选一批优良菌种，并从中分离筛选出一株编号为T1R5的奇球菌（Deinococcus>），经微生物学分类与鉴定，属于奇球菌属，能耐受0-1%浓度的NaCl，最适生长温度为30℃，最高生长温度为42℃，可在1/5TGY培养基上生长，菌落凸起，圆形，光滑，不透明，粉红色。参照《伯杰氏细菌鉴定手册》及《常见细菌鉴定手册》等对菌株进行形态学、生理生化测定，确定T1R5菌株为奇球菌属中成员，但是具有与常见的奇球菌属成员菌种不同的特点，具有一些新菌种的特性。

通过对上述菌种基因测序，序列参见附后提供的SEQUENCE LISTING，经16SRNA同源分析、系统发育分析，通过BLAST同源比对，确定与实验菌株亲缘关系最近的种属。从数据库获得相关种属的序列，并结合细菌生物多样性研究中心数据库，进行聚类分析和系统进化树构建。T1R5菌株归属于奇球菌（Deinococcus>）菌株T1R5与该属模式菌株序列比对最高同源性为97.54 %（Deinococcus> VCD115^T），与该属其它菌株同源性均低于97.0>Deinococcus>）新种，具有新菌种典型性的特点，从分类学角度暂命名为奇球菌（Deinococcus>）T1R5。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101；保藏日期是2016年07月20日，菌种保藏号为CGMCC No.12800，经微生物学鉴定暂命名为奇球菌（Deinococcus>）T1R5。

奇球菌（Deinococcus>）T1R5的生理生化特性：革兰氏染色呈阳性、好氧，无运动性，在触酶、脲酶、水解纤维素、淀粉、吐温20、吐温40、吐温80、硫化氢、硝酸盐和甲基红试验中呈阴性；在凝乳、牛奶胨化、明胶试验、吲哚和Proskauer试验中呈阳性；在GN III中只利用D-甘露糖，在API 50CH系统中可利用苦杏仁甙、秦皮甲素、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、糖原、D-来苏糖发酵产酸；在API 20NE试纸上，明胶、蔗糖、半乳糖、阿拉伯糖、D-甘露糖反应为阳性，与常见的奇球菌属成员菌种不同的生理生化特性，具有一些新菌种的特征。

同时，本发明进一步提供一种利用奇球菌（Deinococcus>）T1R5 CGMCCNo.12800制备辐射保护制剂的方法，具体步骤如下：

将经活化的新鲜斜面菌株T1R5 接种于装有5ml 1/5TGY 液体培养基的种子试管中，于30℃培养，200rpm 振荡培养36h 后，按2％接种量接种于1/5TGY 液体发酵瓶中，于30℃培养，220rpm 振荡培养72h。培养物经8000rpm、3min离心，弃上清，收集菌体；菌体经生理盐水洗涤离心三遍，收集菌体后，以生理盐水稀释至活菌数浓度为1×10¹⁰cfu/ml，超声破碎采用4℃冰水浴，功率400w，90次，每次超5秒，停5秒，获得细胞破碎液，灌装后即为辐射保护制剂，4℃备用。

进一步，本发明提供辐射保护制剂，通过采用奇球菌（Deinococcus>）T1R5CGMCC No.12800，利用上述制备辐射保护制剂的方法获得，制备的辐射保护制剂能够在20KGry剂量的γ射线辐射下存活，显著提高辐射动物的成活率，具有广泛的应用价值。

通过实施本发明提供上述具体技术方案，实施本发明内容，可以达到以下有益效果：

（1）本发明提供的奇球菌（Deinococcus>）T1R5 CGMCC No.12800是一种典型的新菌种，能耐受0-1 %（W/V）的NaCl，可在1/5TGY培养基上生长，最适生长温度为30℃，最高生长温度为42℃，该菌种能够在20KGry剂量的γ射线辐射下存活，具有较高的耐辐射特性，同时具有培养条件简单，繁殖快的特点。

（2）将本发明分离筛选的奇球菌（Deinococcus>）T1R5 CGMCC No.12800通过发酵技术获得的辐射保护制剂，应用到低辐射剂量的小鼠中，小鼠经剂量率0.86 Gy/min累计辐射 6Gy后，经奇球菌（Deinococcus>）T1R5辐射保护制剂注射处理组饲养一个月，无小鼠死亡，存活率为100%。而对照组在辐射后2周小鼠出现陆续死亡，至饲养一个月，总存活率83.4%，保护指数达到了1.2；在8Gy辐照实验中，耐辐射菌T1R5注射处理组小鼠辐射后2周后出现死亡，至饲养一个月，总存活率83.4%；而对照组小鼠辐射后1周后即发现陆续死亡，至饲养一个月，总存活率58.8%，保护指数达到了1.4。

（3）将本发明分离筛选的奇球菌（Deinococcus>）T1R5 CGMCC No.12800通过发酵技术获得的辐射保护制剂，应用到高辐射剂量的小鼠中，小鼠经辐射经剂量率1.20 Gy/min累计照射6Gy辐照后，经奇球菌（Deinococcus>）T1R5辐射保护制剂注射处理组辐射后2周小鼠出现陆续死亡，存活率为66.7%，而对照组在辐射后当天即出现小鼠陆续死亡，至饲养一个月，总存活率11.2%，保护指数达到了5.95；同样剂量率条件下，在10Gy辐照实验中，耐辐射菌T1R5注射处理组小鼠辐射后1周后出现死亡，至饲养一个月，总存活率38.9%，而对照组小鼠辐射后1周后即发现陆续死亡，至饲养一个月，总存活率25%，保护指数达到了1.56。

（4）经本发明提供的一种奇球菌（Deinococcus>）T1R5辐射保护制剂注射后，可以明显提高小鼠辐射存活率，尤其是在高剂量率低剂量下，保护效果更明显。

附图说明

图1所示为菌株奇球菌（Deinococcus>）T1R5 CGMCC No.12800的系统发育树状图。

图2所示为菌株奇球菌（Deinococcus>）T1R5 CGMCC No.12800与相关菌株的耐辐射曲线图，横轴表示辐射剂量，纵轴表示存活率。

图3所示为菌株奇球菌（Deinococcus>）T1R5 CGMCC No.12800在剂量率0.86Gy/min条件下对昆明鼠辐照的保护作用，横轴表示辐射剂量，纵轴表示存活率。

图4所示为菌株奇球菌（Deinococcus>）T1R5 CGMCC No.12800在剂量率1.20Gy/min下菌株T1R5对昆明鼠辐照的保护作用，横轴表示辐射剂量，纵轴表示存活率。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明中选用的所有原辅材料，以及选用的菌种培养方法都为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的%都为重量百分比，除非特别指出除外。

本发明实施例中采用如下基础培养基：

TGY培养基：蛋白胨5 g，酵母浸粉3g，葡萄糖2g，蒸馏水1000mL，pH 值=7.0。

实施例一：奇球菌（Deinococcus>）T1R5的分离、筛选及鉴定

1、分离、纯化：从新疆和硕盐碱地区干旱区土壤样品中分离得到。称取100g土壤样品，置于⁶⁰Co辐射源下辐射至剂量10KGy后，取其中5.0g被辐射样品加至含有50>

采用上述提供的奇球菌（Deinococcus>）T1R5，称取100g土壤样品，置于⁶⁰Co辐射源下辐射至剂量10KGy后，取其中5.0g被辐射样品加至含有50>

T1R5菌株在1/5TGY培养基中30℃培养5天，菌落凸起，圆形，光滑，不透明，粉红色。菌株最适生长温度为30℃，最高生长温度为42°C，可耐受0-1 %（W/V）NaCl，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》及《常见细菌鉴定手册》对菌株进行分类鉴定，初步断定为奇球菌（Deinococcus>）。

奇球菌（Deinococcus>）T1R5的生理生化特性：革兰氏染色呈阳性、好氧，无运动性，在触酶、脲酶、水解纤维素、淀粉、吐温20、吐温40、吐温80、硫化氢、硝酸盐和甲基红试验中呈阴性；在凝乳、牛奶胨化、明胶试验、吲哚和Proskauer试验中呈阳性；在GN III中只利用D-甘露糖，在API 50CH系统中可利用苦杏仁甙、秦皮甲素、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、糖原、D-来苏糖发酵产酸；在API 20NE试纸上，明胶、蔗糖、半乳糖、阿拉伯糖、D-甘露糖反应为阳性。

菌株奇球菌（Deinococcus>）T1R5已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期2016年07月20日，菌种保藏号为CGMCC No.12800。经微生物学鉴定暂命名为奇球菌（Deinococcus>）T1R5。

本发明提供的奇球菌（Deinococcus>）T1R5 CGMCC No.12800能够在适合其增殖的固体培养基或液体培养基中进行增殖培养，利用常规固体斜面培养培养、低温保藏的方法，每次传代可保藏3个月以上，以干燥冷冻法制做的长期保藏菌种，可保藏1年以上，或是以甘油管进行长期保藏。

2、分类、鉴定：通过观察奇球菌（Deinococcus>）T1R5菌落形状和生理生化特点，提取菌株的总DNA，采用细菌ITS PCR扩增通用引物，进行PCR扩增，PCR产物经切胶纯化，测序，进行ITS BLAST比较，进行聚类分析和系统进化树构建。

通过提取奇球菌（Deinococcus>）T1R5 的总DNA，采用细菌ITS PCR扩增通用引物，进行PCR扩增，PCR产物经切胶纯化、测序，其序列参见附后提供的SEQUENCE LISTING。

所得T1R5的序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较，确定与实验菌株亲缘关系最近的种属。从数据库获得相关种属的序列，并结合细菌生物多样性研究中心数据库的标准模式菌序列，利用MEGA 5.0软件包采用邻接法(Neighbor-Joining method)进行聚类分析和系统进化树构建，系统进化树参见附图1，由系统进化树可知，菌株归属于奇球菌（Deinococcus>），菌株T1R5与该属模式菌株序列比对最高同源性为97.54 %（Deinococcus> VCD115^T），与该属其它菌株同源性均低于97.0>Deinococcus>）新种，暂命名为奇球菌（Deinococcus>）T1R5。

通过上述对于菌种奇球菌（Deinococcus>）T1R5 CGMCC No.12800的菌体形态、培养特征观察、生理生化指标测定及分子水平鉴定，即通过菌体形态观察、菌株培养特征观察、生长温度测定、耐性试验等试验，与常见的奇球菌相比，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》及《常见细菌鉴定手册》的方法进行，编号为T1R5的菌种尽管与常见的奇球菌属细菌菌种相比，具有共性的一些属性，但是与常见的奇球菌属细菌菌种有明显的生理生化特性差异和分子水平的差异性，表明T1R5菌株是一种典型的新菌种，从菌种分类角度将菌种编号为T1R5的菌株综合鉴定为奇球菌（Deinococcus>）。

实施例二：奇球菌（Deinococcus>）T1R5 CGMCC No.12800的耐辐射特性

从新鲜培养的奇球菌（Deinococcus>）T1R5斜面上挑去菌苔一环，接种至1/5TGY液体培养基中，30℃，150rpm震荡培养4天后，5000r／min离心收集菌体，用0.05mol／L pH为7.2的磷酸钾缓冲液洗涤菌体三次，并调整至浓度OD₆₀₀>60Co>D.radiodurans、D.>VCD115^T和E.coli>60Co>D.radiodurans、D.>

结果参见附图2，菌株T1R5的耐γ射线辐射特性与D.>VCD115T极为相似，均可以在20KGry剂量下有存活，略低于菌D.radiodurans的耐辐射能力。

实施例三：奇球菌（Deinococcus>）T1R5制备辐射保护制剂的方法

利用奇球菌（Deinococcus>）T1R5 CGMCC No.12800制备辐射保护制剂的具体步骤如下：

将经活化的新鲜斜面菌株T1R5 接种于装有5ml 1/5TGY 液体培养基的种子试管中，于30℃培养，200rpm 振荡培养36h 后，按2％接种量接种于1/5TGY 液体发酵瓶中，于30℃培养，220rpm 振荡培养72h。培养物经8000rpm、3min离心，弃上清，收集菌体。菌体经生理盐水洗涤离心三遍，收集菌体后，以生理盐水稀释至活菌数浓度为1×10¹⁰cfu/ml，超声破碎采用4℃冰水浴，功率400w，90次，每次超5秒，停5秒，获得细胞破碎液，灌装后即为辐射保护制剂，4℃备用。

实施例四：奇球菌（Deinococcus>）T1R5 CGMCC No.12800制备辐射保护制剂在辐射保护中的应用

试验动物采用平均体重为15-22克的昆明鼠，购买自新疆维吾尔自治区实验动物研究中心，雌雄随机挑选。将购买后的昆明鼠在实验室常规饲喂3天后，开始注射试验，试验组注射奇球菌（Deinococcus sp.）T1R5辐射保护制剂，对照组注射生理盐水。

（1）奇球菌（Deinococcus>）T1R5辐射保护制剂对低辐射剂量的昆明鼠的作用：

使用奇球菌（Deinococcus>）T1R5辐射保护制剂对昆明鼠进行腹腔注射，每只鼠腹腔注射0.5ml，每隔7天注射一次，共三次，对照组注射等量生理盐水。从第一次注射后42天进行辐照，辐照采用⁶⁰Co辐照，剂量分别为6Gy、8Gy，剂量率为0.86>

试验结果参见附图3，小鼠经剂量率0.86 Gy/min累计辐射 6Gy后，经奇球菌（Deinococcus>）T1R5辐射保护制剂注射处理组饲养一个月，无小鼠死亡，存活率为100%。而对照组在辐射后2周小鼠出现陆续死亡，至饲养一个月，总存活率83.4%，保护指数达到了1.2；在8Gy辐照实验中，耐辐射菌T1R5注射处理组小鼠辐射后2周后出现死亡，至饲养一个月，总存活率83.4%；而对照组小鼠辐射后1周后即发现陆续死亡，至饲养一个月，总存活率58.8%，保护指数达到了1.4。

由此可知，经本发明提供的一种奇球菌（Deinococcus>）T1R5辐射保护制剂注射后，可以明显提高小鼠辐射存活率。

（2）奇球菌（Deinococcus>）T1R5辐射保护制剂对高辐射剂量的昆明鼠的作用：

使用奇球菌（Deinococcus>）T1R5辐射保护制剂进行昆明鼠的注射，每只鼠腹腔注射0.5ml，每隔7天注射一次，共三次，对照组注射等量生理盐水。从第一次注射后42天进行辐照，辐照采用60Co辐照，剂量分别为6Gy、10Gy，剂量率为1.20>

试验结果参见附图4，小鼠经辐射经剂量率1.20 Gy/min累计照射6Gy辐照后，经奇球菌（Deinococcus>）T1R5辐射保护制剂注射处理组辐射后2周小鼠出现陆续死亡，存活率为66.7%，而对照组在辐射后当天即出现小鼠陆续死亡，至饲养一个月，总存活率11.2%，保护指数达到了5.95；同样剂量率条件下，在10Gy辐照实验中，耐辐射菌T1R5注射处理组小鼠辐射后1周后出现死亡，至饲养一个月，总存活率38.9%，而对照组小鼠辐射后1周后即发现陆续死亡，至饲养一个月，总存活率25%，保护指数达到了1.56。

由此可知，经本发明提供的一种奇球菌（Deinococcus>）T1R5辐射保护制剂注射后，可以明显提高小鼠辐射存活率，尤其是在高剂量率低剂量下，保护效果更明显。

通过上述系列实施例提供的奇球菌（Deinococcus>）T1R5 CGMCC No.12800是一种典型的新菌种，能耐受0-1 %（W/V）的NaCl，最适生长温度为30℃，最高生长温度为42℃，该菌，能够在20KGry剂量的γ射线辐射下存活，具有较高的耐辐射特性，同时具有培养条件简单，繁殖快的特点。将奇球菌（Deinococcus>）T1R5 CGMCC No.12800通过发酵技术获得的辐射保护制剂，应用到辐射动物中，可明显提高辐射后动物的成活率，对于微生物菌种应用技术领域具有广泛的应用价值。

上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

SEQUENCE LISTING

<110>新疆农业科学院微生物应用研究所(中国新疆-亚美尼亚生物工程研究开发中心)

<120>一种耐辐射奇球菌T1R5及其在辐射保护中的应用

<130>T1R5

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1467

<212>DNA

<213>T1R5

<220>

<221>T1R5

<222>(1)..(1467)

<400>1

tcagagtttg atcctggctc agggtgaacg ctggcggcgt gcttaagaca tgcaagtcga 60

acgggggaag cttgcttccc cagtggcgca cgggtgagta acgcgtaact gacctacccc120

aaagtccgga ataacctccc gaaagggaag ctaatactgg atgtgcagtc agattgtgtt180

ctgcctgtaa agatttattg ctttgggatg gggttgcgtt ccatcagctt gttggtgggg240

taaaggccta ccaaggcgac gacggatagc cggcctgaga gggtggccgg ccacaggggc300

actgagacac gggtcccact cctacgggag gcagcagtta ggaatcttcc acaatgggcg360

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aagggcgtgt aggcggatca gtaagtctgg ttttaaagac tgcggctcaa ccgcagggat600

ggactggata ctgttgatct tgacctctgg agaggaaacc ggaattcctg gtgtagcggt660

ggaatgcgta gataccagga ggaacaccaa tggcgaaggc aggtttctgg acagaaggtg720

acgctgaggc gcgaaagtgt ggggagcgaa ccggattaga tacccgggta gtccacaccc780

taaacgatgt acgttggcta agcgcaggat gctgtgcttg gcgaagctaa cgcgataaac840

gtaccgcctg ggaagtacgg ccgcaaggtt gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca900

caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac960

atcctaggaa ccgttgagag atcagcgggt gcccttcggg gaacctagag acaggtgctg 1020

catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc 1080

cctaccttca gttgccagca ttcagttggg cactctggag ggactgccta tgaaagtagg 1140

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cccagttcag atcggagtct gcaactcgac tccgtgaagt tggaatcgct agtaatcgtg 1320

ggtcagcata ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg 1380

ggagtacgtt gcagttgaaa ccgccgggag ctgtaaggca ggcgtctaga ctgtggcgca 1440

tgactggggt gaagtcgtaa caaggta 1467

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