一种响应谷胱甘肽杀灭肿瘤细胞的光敏感靶向抗肿瘤前药及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种基于谷胱甘肽、光刺激的药物和荧光双释放体系的设计与应用，以谷胱甘肽为药物释放的靶分子、2,4‑二硝基本磺酰氯为响应基团，设计合成了谷胱甘肽和光刺激的药物和荧光双释放体系。通过测定前药(CM‑2)的荧光性能，发现前药(CM‑2)可以很好地响应谷胱甘肽释放荧光；同时，相比于其他光敏感药物，前药具有更好的稳定性及靶向性；利用MTT法测定其抗肿瘤活性研究，发现化合物(CM‑2)具有高于苯丁酸氮芥的抗肿瘤活性，说明化合物(CM‑2)的靶向性比苯丁酸氮芥更高；根据香豆素的荧光特性，探究了细胞对药物的摄取情况，实验结果表明前药可以被细胞摄取。为细胞研究中药物的释放提供了一种有效的研究工具。

说明书

技术领域

本发明涉及光敏感靶向抗肿瘤药物的释放，具体涉及基于谷胱甘肽、光刺激的抗肿瘤药物苯丁酸氮芥和荧光双释放体系的设计与应用。

背景技术

光作为一种“取之不尽，用之不竭”的外界刺激因素，无需依赖机体内部生理环境的变化，能够在特定的时间和空间控制光敏感类前药释放出活性药物，是药物释放领域最受青睐的刺激手段之一。近年来，制备光敏感前药的报道越来越多，其中香豆素类光敏基团具有易合成、易修饰、易检测、光解速度快和明确的光解机理等优势，得到了广泛的应用。氮芥类药物是应用于临床的一类广谱性抗肿瘤药物，对癌细胞的杀灭能力较强，但由于其本身药代动力学性质(毒副作用大、半衰期短、选择性差、治疗效率低等)的局限，使得它在抗肿瘤的临床应用上受到限制。

发明内容

为了克服上述缺陷，本论文以香豆素为母核，针对肿瘤细胞中过量表达的谷胱甘肽(GSH)，利用其特有的反应性能，设计光敏感部位的“开-关”，并合成了具有靶向性的光敏感氮芥类衍生物，实现了抗肿瘤药物释放和荧光示踪的双重目的。

本发明采用的技术方案为：

一种式(CM-2)所示的化合物：

本发明还提供一种如式(CM-2)所示的化合物的制备方法，包括以下步骤：

将式(2-3)所示化合物溶解于DCM中，依次加入DMAP，DCC，活化1-30min后得混合物，将苯丁酸氮芥溶于DCM中，再加入上述混合物中，反应1～48小时，反应全程在惰性气体保护下进行，反应液经分离纯化，得到式(CM-2)所示的化合物；

进一步，本发明所述式(2-3)所示化合物、DMAP、DCC与苯丁酸氮芥物质的量之比为1:0.2-2:1-2:1-2，优选为1:1:1.2:1.2。

进一步，本发明所述DCM总体积用量推荐以式(2-3)所示化合物物质的量计为10～50mL/mmol。

进一步，本发明所述分离纯化方法为：反应液加入DCM后用水洗涤，取有机相饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸除去有机溶剂得粗产物，经薄层层析分离，所用展开剂为DCM/MeOH＝15:1或DCM/MeOH＝12:1，收集目标组分，干燥，获得式(CM-2)所示的化合物。

此外，本发明还提供一种式(CM-2)所示的化合物在制备响应谷胱甘肽杀灭肿瘤细胞的光敏感靶向抗肿瘤前药中的应用。

进一步，所述肿瘤细胞优选为子宫颈癌细胞HeLa、HepG2、MFC-7、F9或TE-1细胞。

进一步，所述谷胱甘肽推荐以水溶液形式存在，浓度为1～10μmol/L。

更进一步，所述谷胱甘肽优选为肿瘤细胞内谷胱甘肽。

本发明所述DCM为二氯甲烷；DMAP为4-二甲氨基吡啶；DCC为二环己基碳二亚胺。

本发明的反应路线如下：

本发明所述化合物(CM-2)可作为荧光监测光敏感靶向抗肿瘤前药，应用于肿瘤细胞药物释放时的荧光监测。所述的谷胱甘肽浓度的荧光检测的方法为：以化合物(CM-2)作为荧光探针，与PBS缓冲溶液中的谷胱甘肽进行反应，产生荧光，测定在激发为365nm下的荧光强度变化，从而获得谷胱甘肽浓度。

其次，以化合物(CM-2)作为荧光探针，与HeLa细胞进行孵化，然后加入外源谷胱甘肽进行荧光成像。

此外，本发明还制备了以下化合物K以进一步验证前药CM-2的选择性及抗肿瘤活性。

本发明所述化合物(CM-2)可作为光敏感靶向抗肿瘤前药，应用于光敏感靶向抗肿瘤药物的释放。所述的药物释放过程的检测方法为：以化合物(CM-2)作为光敏感靶向抗肿瘤前药，与PBS缓冲溶液中的谷胱甘肽进行反应，随后对反应液进行UV光照，取不同时段反应液进行高效液相色谱分析，从而获得药物释放过程。

其次，针对肿瘤细胞HeLa，HepG2给不同浓度前药CM-2光照前后的细胞活性评价采用一种标准的MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)方法。

本发明基于香豆素光敏感的特性，成功设计合成了谷胱甘肽激活的光刺激苯丁酸氮芥前药的释放体系，改善了药物苯丁酸氮芥的不良药代动力学。

附图说明

图1为本发明实施例1制得的前药(CM-2)的核磁氢谱。

图2为本发明实施例1制得的前药(CM-2)在pH为7.4条件下加入GSH、Cys、Hcy水溶液的荧光光谱。

图3为本发明实施例1制得的前药(CM-2)在pH为7.4条件下的荧光强度与谷胱甘肽浓度之间的关系。

图4为本发明实施例1制得的前药(CM-2)在pH为7.4条件下与谷胱甘肽反应的荧光强度与随时间变化的关系

图5为本发明实施例1制得的前药(CM-2)在pH为7.4条件下加入谷胱甘肽和不同生物相关活性小分子的荧光光谱。

a图(1.Gly,2.Ala,3.Ser,4.Gln,5.Thr,6.Val,7.Leu,8.Ile,9.Met,10.Phe,11.Trp,12.Asp,13.Asn,14,Glu,15.Hcy,16.Cys,17.GSH)；b图(1.Zn(II),2.Na(I),3.Mg(II),4.K(I),4.Fe(III),5.Fe(II),6.Cu(II),7.Ca(II),8.Pb(II),9.Pb(0),10.GSH)

图6为本发明实施例1制得的前药(CM-2)在pH为7.4条件下和谷胱甘肽反应之后，在光照条件下药物释放的高效液相色谱图。

图中，CM-1U为：

图7为本发明实施例1制得的前药(CM-2)在pH为7.4条件下经谷胱甘肽处理之后分别在光照和暗场下的药物释放情况。

图8为本发明实施例1制得的前药(CM-2)的抗HeLa和HepG2细胞增殖活性。

图9为本发明实施例1制得的前药(CM-2)在子宫颈癌细胞(HeLa)中的共聚焦荧光成像效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1前药(CM-2)的合成

将化合物2-3(100mg)投入到含有30mL DCM的三口烧瓶中，完全溶解后，加入1.5当量DMAP，2.5当量DCC，活化10min后，将2.2当量苯丁酸氮芥溶于5mL DCM注入瓶中，反应过夜。向瓶中加入50mL DCM,并水洗(3×30mL)，饱和氯化钠洗(2×30mL)，无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸除去有机溶剂得粗产物，经薄层层析分离得到产物纯的产物CM-2，所用展开剂为DCM(D)/MeOH(M)＝15:1，收率83％。核磁氢谱见图1。

¹H>3)δ7.85(d,J＝8.1Hz,3H),7.42(dd,J＝16.4,8.4Hz,6H),7.08(d,J＝8.7Hz,4H),6.97–6.88(m,4H),6.68–6.60(m,4H),6.33(s,2H),5.25(d,J＝1.2Hz,4H),5.16(d,J＝3.6Hz,4H),3.71(t,J＝6.9Hz,8H),3.63(dd,J＝10.6,3.9Hz,8H),2.60(t,J＝7.5Hz,4H),2.47(t,J＝7.5Hz,4H),2.02–1.89(m,5H),1.36(s,22H).

实施例1前药(CM-2)的合成

将化合物2-3(100mg)投入到含有30mL DCM的三口烧瓶中，完全溶解后，加入0.1当量DMAP，1当量DCC，活化10min后，将1当量苯丁酸氮芥溶于5mL DCM注入瓶中，反应过夜。向瓶中加入50mL DCM,并水洗(3×30mL)，饱和氯化钠洗(2×30mL)，无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸除去有机溶剂得粗产物，经薄层层析分离得到产物纯的产物CM-2，所用展开剂为DCM(D)/MeOH(M)＝15:1，收率65％。

实施例3对照化合物K的合成

将化合物3(100mg)投入到含有30mLDCM的三口烧瓶中，完全溶解后，加入0.2当量DMAP，1.2当量DCC，活化30分钟，将1.2当量的苯丁酸氮芥溶于10mL DCM注入瓶中，反应24小时。向瓶中加入50mL DCM，水洗(3×30mL)，饱和氯化钠洗(2×30mL)，无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸除去有机溶剂得粗产物，经薄层层析分离得到产物纯的产物K，所用展开剂为DCM(D)/MeOH(M)＝15:1-3，收率51％。

实施例4实施例1制得的前药(CM-2)在pH为7.4条件下加入0mM和100μM谷胱甘肽水溶液浓度的荧光光谱检测。

将含有5μM前药(CM-2)的PBS缓冲液中，分别加入谷胱甘肽(GSH)GSH、半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)，在37℃水浴摇床反应，与此同时，将含有前药(CM-2)，H₂O₂的PBS溶液作为对照组，实验设置三组平行。酶标仪检测其荧光强度，如图2从荧光谱图中我们可以发现，相比较于Cys和Hcy，GSH对化合物前药(CM-2)具有更好的选择性。

实施例5实施例2制得的对照样品K在pH为7.4条件下加入100μM谷胱甘肽水溶液浓度的荧光光谱检测。

将含有5μM化合物K的PBS缓冲液中，分别加入谷胱甘肽(GSH)GSH、半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)，在37℃水浴摇床反应，与此同时，将含有前药(CM-2)，H₂O₂的PBS溶液作为对照组，实验设置三组平行。经酶标仪检测，并没有出现荧光强度增强的现象，从而证明前药CM-2对GSH具有极高的选择性。

实施例6实施例1制得的前药(CM-2)在pH为7.4条件下的荧光强度与谷胱甘肽浓度之间的关系检测。

将化合物(CM-2)与不同浓度的谷胱甘肽在水浴摇床下反应，通过酶标仪检测荧光强度变化。与此同时，将等量的超纯水与化合物(CM-2)在同等条件下反应，作为空白对照组。从图3中可以看出，当谷胱甘肽浓度在0-100μM的范围内时，(CM-2)在460nm处的荧光强度随谷胱甘肽浓度的增加而增强；当GSH浓度为100μM时，荧光强度达到最大。

实施例7实施例1制得的前药(CM-2)在pH为7.4条件下与谷胱甘肽反应的荧光强度与随时间变化的关系检测。

将加入了前药(CM-2)及GSH的PBS缓冲液，实验设置三组平行，置于水浴摇床中，反应不同时间，酶标仪检测荧光强度变化(图4)；与此同时，将化合物前药(CM-2)及等量超纯水加入到PBS缓冲液中，作为对照组。将从图中可以看出，在0-10min范围内，前药(CM-2)在460nm处的荧光强度随时间的增加不断增高，在20min时荧光值达到最大。

实施例8实施例1制得的前药(CM-2)在pH为7.4条件下加入谷胱甘肽和不同生物相关活性小分子的荧光光谱。

将前药(CM-2)和不同氨基酸、金属离子反应，实验设置三组平行。通过酶标仪检测其波长为460nm时的荧光强度，从图5中可以发现，化合物前药(CM-2)对GSH具有优异的专一性，反应之后荧光强度有着较强的变化，除了Cys和Hcy会发生一定的作用外，其它氨基酸以及金属离子并不会诱导产生荧光。

实施例9实施例1制得的前药(CM-2)在pH为7.4条件下和谷胱甘肽反应之后，在光照条件下药物释放的高效液相色谱检测。

将化合物(CM-2)和谷胱甘肽加入到PBS缓冲液中(pH＝7.4)，37℃水浴摇床中反应，取样进行高效液相色谱分析。然后将反应液置于紫外光照射条件下继续反应，每隔两分钟分别取样进行，进行高效液相色谱分析，结果如图6所示。

实施例10实施例1制得的前药(CM-2)在pH为7.4条件下经谷胱甘肽处理之后分别在光照和暗场下的药物释放情况。

将反应液置于光照条件下反应5min，取样，进行高效液相色谱检测，然后将反应液置于暗场中反应5min，取样，进行高效液相色谱检测，如此交替进行60min。通过计算峰面积比值变化，计算药物释放率如图7，结果表明，被谷胱甘肽激活的抗肿瘤前药(CM-2)只有在光照条件下才能分解释放活性药物。

实施例11实施例1制得的前药(CM-2)的抗HeLa和HepG2细胞增殖活性

对化合物前药(CM-2)，利用MTT法选用人宫颈癌细胞HeLa、人肝癌细胞HepG2、对其进行体外抗肿瘤细胞活性检测研究其抗肿瘤作用。如上述图8所示，其中，“(Cell+UV)+chlorambucil”表示细胞先被UV照射一段时间之后再加入苯丁酸氮芥，然后孵育24小时。“(Cell+UV)+CM-2”表示细胞先UV照射15min后加入化合物CM-2，然后孵育24h。“(Cell+CM-2)+UV”表示细胞先加入化合物CM-2孵育12小时后，进行光照15min，之后再次孵育12h。每组设置三个平行，通过实验组与空白对照组吸光度的比值，计算出药物对肿瘤细胞存活率的影响。从图8中可以明显看出：苯丁酸氮芥对肿瘤细胞的杀灭能力明显较小，原因是药物浓度较低，无法对肿瘤细胞造成有效的杀灭浓度。而对于化合物CM-2而言，细胞存活率无明显变化，说明化合物CM-2对细胞无明显毒性，但是，当化合物CM-2在细胞中孵育一段时间后，再给予其光照，然后在孵育一段时间后，产生了对肿瘤细胞明显的毒性，药物浓度在5μM时细胞存活率低于50％，说明经修饰后的抗肿瘤前药CM-2较苯丁酸氮芥有了靶向性，并且发挥药效达到杀灭肿瘤细胞的目的。

实施例12前药(CM-2)在子宫颈癌细胞(HeLa)中的共聚焦荧光成像效果图。

由于在谷胱甘肽作用及光照后所释放的香豆素为强荧光染料，我们尝试通过共聚焦显微镜观察药物在肿瘤细胞内的分布情况，实验结果如图9所示。其中，图A为未经处理的对照组，图B为加药孵育12h后的共聚焦细胞成像图，图C为加药孵育12h之后，谷胱甘肽处理30min。由图可以看出，化合物可以被细胞摄取，并且可通过此时的细胞形态来判断是否释放苯丁酸氮芥。

实验证明，在谷胱甘肽浓度提高的情况下，我们能够看到细胞中的荧光信号也在变强。说明我们的物质能够响应细胞内的谷胱甘肽。