一种新型小分子结构及其在检测蓝绿藻肝毒素方面的应用

摘要

本发明公开了一种新型小分子结构及其在检测蓝绿藻肝毒素方面的应用。所述新型小分子结构的结构式如式（I）所示：

说明书

技术领域

本发明属于食品安全技术领域。更具体地，涉及一种新型小分子结构及其在检测蓝绿藻肝毒素方面的应用。

背景技术

随着工业化、城市化的发展，大量营养物注入水中造成水体富营养化，而致使藻类迅猛生长，藻类代谢产生包括蓝绿藻肝毒素(微囊藻毒素，节球藻毒素)在内的有毒物质，危害着人类健康。我国是世界上藻灾害最为严重的国家之一，淡水湖泊中发生的水华80％是有毒的，而微囊藻毒素分布最广、毒性最大。

微囊藻毒素(Microcystins，MCs)主要由淡水藻类铜绿微囊藻产生。MCs是一类单环七肽肝毒素，由于多肽中两种可变氨基酸组成的不同，主要有L、R、Y、W和F，分别代表亮氨酸、精氨酸、酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸，因而具有多种异构体，其中存在最普遍，含量最多的是MC-LR、MC-YR和MC-RR三种，其他还包含MC-WR、MC-LA、MC-LW、MC-LY和MC-LF等在内的80多种。而Adda基团(3-氨基-9-甲氧基-2,6,8-三甲基-10-苯基-4,6-二烯酸)是一种特殊的β-氨基酸，是微囊藻毒素类物质共同拥有的结构，且其为主要表达毒性的部分。MCs分布最广泛，它对蛋白磷酸酶1和蛋白磷酸酶2A具有抑制作用，为肿瘤促进剂。1998年世界卫生组织(WHO)的《用水卫生标准》中建议饮用水中MCs标准为1.0μg/L。我国生活饮用水卫生标准(GB 5749-2006)的颁布，将饮用水中微囊藻毒素含量限制为1μg/L，该标准的实施对水源水的质量提出了更高的要求。

节球藻毒素(Nodularin，NOD)也是一种蓝藻水华腐烂后释放于水中的毒素之一，主要存在于泡沫节球藻中。NOD为环状五肽肝毒素，已分离得到7种节球藻毒素异构体，也都具备Adda基团，是丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶1(PP1)和蛋白磷酸酶2A(PP2A)的抑制剂，同时也是肿瘤诱发挤和促进剂，其对人类的危害可见一斑，但目前仍没有NOD的限量标准，但设置其限量标准势在必行。

目前，微囊藻毒素和节球藻毒素的检测方法主要有薄层色谱(Thin Layer chromatography，TLC)、高效液相色谱(High performance liquid chromatography，HPLC)、气相色谱(Gas chromatography,GC)、质谱(Mass sepectrum,MS)以及高效液相-质谱联用(High performance liquid chromatography-mass sepectrum，HPLC-MS)等方法。这些方法虽然准确度高，但其仪器设备昂贵、样品前处理复杂繁琐、检测成本高且需要专业人员操作。而免疫层析检测方法具备快速、灵敏、准确、操作简便等特点，且对样品纯度要求不高，特别适用于大批量样品的检测。

目前已报道的蓝绿藻肝毒素(多种微囊藻毒素类似物和节球藻毒素)制备的抗体大多使用MC-LR和NOD偶联蛋白制备抗原、抗体，而其抗体特性也有很大差异，广谱性也受到免疫原和包被原的限制。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术中缺乏同时检测多种微囊藻毒素结构类似物和节球藻毒素的免疫学检测方法，提供一种近似于共同基团Adda的新型小分子物质，以增加检测方法的广谱识别性能，制备出灵敏性度高且广谱性强的半定量蓝绿藻肝毒素免疫层析试纸条，适用于多种微囊藻毒素类似物和节球藻毒素，且具有快速、直观、易于操作等特点，可作为检测主要蓝绿藻肝毒素的有效手段，具有广阔的发展前景。

本发明的目的是提供一种新型小分子免疫原结构。

本发明另一目的是提供所述小分子免疫原结构在制备蓝绿藻肝毒素广谱免疫层析试纸条中的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种新型小分子结构LH-1，其结构式如式(I)所示：

该新型小分子结构LH-1采用系统命名法命名为：(2E，4E，6S，7S)-7-甲氧基-4,6-二甲基-8-苯辛基-2,4-二烯酸(即：(2E,4E,6S,7S)-7-methoxy-4,6-dimethyl-8-phenylocta-2,4-dienoic acid)。

本发明首先获得了一种特殊的新型小分子结构作为免疫原，将该小分子及微囊藻毒素MC-LR分别与载体蛋白偶联制得人工抗原，利用将该小分子人工抗原乳化后免疫兔，分离纯化兔血清得到免疫制备多克隆抗体，制备抗体标记的纳米金颗粒，将MC-LR人工抗原包被于硝酸纤维膜上作为检测带，羊抗兔二抗作为控制带，依据免疫竞争法原理建立得快速检测蓝绿藻肝毒素的广谱性免疫层析试纸条。该免疫层析试纸条灵敏性度高、广谱性强，可半定量检测蓝绿藻肝毒素，适用于多种微囊藻毒素类似物和节球藻毒素，且具有快速、直观、易于操作等优势。

所述新型小分子结构LH-1的制备方法是使用N-丙酰基硫偶氮烷硫酮经过缩二脲醛醇缩合、反式酰胺化反应、烷基化反应、还原反应、Wittig反应、还原反应、氧化反应、Wittig反应、还原反应、氧化反应、氧化反应共11步反应生成新型小分子。

具体地，新型小分子结构的制备方法包括以下步骤：将右旋N-丙酰基硫偶氮烷硫酮溶于无水二氯甲烷中，冷却后依次加入四氯化钛、N,N-二异丙基乙胺、N-甲基吡咯烷酮和苯乙醛，经缩二脲醛醇缩合纯化后生成黄色固体状的醛醇2。将醛醇2溶于无水二氯甲烷，依次加入N,O-二甲基羟胺盐酸盐和咪唑，经反式酰胺化反应，纯化后得黄色油状物中间体Weinreb酰胺。将碘甲烷溶于无水四氢呋喃中，加入固体碳酸钠搅拌，将混合物冷却，脱脂棉过滤并加入到先前获得的Weinreb酰胺中，之后加入氢化钠，纯化后得到黄色油状物3。将Weinreb酰胺3溶于无水二氯甲烷中，冷却后滴加二异丁基氢化铝的无水甲苯溶液，纯化后过滤，并真空浓缩得到橙色油状中间体醛。将新制备的醛溶于无水甲苯中，加入稳定的磷叶立德(1-乙氧基羰基亚乙基)三苯基正膦，回流搅拌过夜，Wittig反应纯化后得到黄色油状烯烃4。将烯烃4溶于无水四氢呋喃中，冷却后滴加1.0M二异丁基氢化铝的无水甲苯溶液搅拌，还原反应纯化后得淡黄色油状的烯丙醇。将烯丙醇溶于无水甲苯中，加入活化的二氧化锰，将所得悬浮液在55℃剧烈搅拌2h，氧化反应纯化后得到黄色油状物醛5。将新制备的醛5溶于无水甲苯中，加入磷叶立德(1-乙氧基羰基亚甲基)三苯基正膦，Wittig反应纯化后得到黄色油状物酯6。将酯6溶于无水四氢呋喃中，冷却后滴加二异丁基氢化铝的无水甲苯溶液，还原反应纯化后得到黄色油状中间体醇。将醇溶于无水甲苯中，冷却加入二氧化锰，氧化反应纯化后减压浓缩滤液得到黄色油状醛7。将醛7溶于二甲基亚砜中，加入1,3,5-三甲氧基苯，次氯酸钠和磷酸二氢钠，经纯化即得新型小分子结构。

更优选地，所述新型小分子结构物质LH-1的制备方法，包括以下步骤：

(a)缩二脲醛醇缩合：室温下，称取26.2g右旋N-丙酰基硫偶氮烷硫酮(CAS：1217320-19-8)溶于250mL无水二氯甲烷中搅拌，之后在丙酮中用干冰冷却至-78℃，逐滴向上述溶液中加入12mL四氯化钛，所得混合物搅拌15min形成钛络合物，再向上述溶液中加入18.9mL蒸馏过的N,N-二异丙基乙胺，将混合物接着搅拌40min形成相应的烯醇化钛，再加入20.0mL新蒸馏的N-甲基吡咯烷酮，10min后，加入13.4mL新蒸馏的苯乙醛，将上述溶液持续在-78℃再放置30min后温热至4℃，并在该温度下再搅拌1h。通过TLC监测反应，展开剂为环己烷-乙酸乙酯(7:3，v/v)，最后加入300mL 50％NH₄Cl水溶液猝灭反应。将有机层用300mL>2CO₃和300mL盐水洗涤两次，再用Na₂SO₄干燥。得到黄色固体状的醛醇2。

(b)反式酰胺化反应：将37.1g醛醇2溶于无水150mL二氯甲烷中，依次加入14.6g N,O-二甲基羟胺盐酸盐和27.2g咪唑，将此混合物在室温下搅拌12h。通过TLC监测反应，展开剂为环己烷-乙酸乙酯(7:3，v/v)。然后用300mL去离子水将有机层洗涤3次，再用Na₂SO₄干燥，过滤并真空浓缩。所得残余物通过硅胶柱层析纯化，称取600g硅胶填柱，以环己烷和乙酸乙酯(AcOEt，30-50％)作为流动相梯度洗脱，得到黄色油状物中间体Weinreb酰胺。

(c)烷基化反应：将40.1mL碘甲烷溶于140mL无水四氢呋喃中，再将此溶液与1.38g固体Na₂CO₃混合搅拌10min后冷却至4℃，通过脱脂棉过滤并加入到先前获得的15.1g>4Cl去除。混合物用AcOEt萃取两次，有机层再用250mL盐水洗涤，之后用Na₂SO₄干燥，过滤并减压浓缩。用300g硅胶填柱后，用环己烷-AcOEt(6:4，v/v)作为流动相纯化，得到黄色油状Weinreb酰胺3。

(d)还原反应：将10.71g Weinreb酰胺3溶于100mL无水二氯甲烷中，将所得溶液用在丙酮中的干冰冷却至-78℃。在80min内滴加100mL的1.0M二异丁基氢化铝的无水甲苯溶液。通过TLC监测反应，展开剂为环己烷-乙酸乙酯(7:3，v/v)，再依次加入40mL甲醇和40mL饱和NH₄Cl猝灭反应，之后将该溶液升温至室温搅拌30min。然后将混合物通过545垫，并用300mL苯乙基洗涤，合并有机相后用200mL>4干燥，过滤并真空浓缩得到橙色油状中间体醛。

(e)Wittig反应：将8.48g新制备的醛溶于275mL无水甲苯中，加入18.52g磷叶立德(1-乙氧基羰基亚乙基)三苯基正膦，将所得混合物回流反应12h。通过TLC监测反应，展开剂为环己烷-乙酸乙酯(8:2，v/v)。将反应混合物减压浓缩，所得残余物通过硅胶柱纯化，用0-10％AcOEt的环己烷溶液作为流动相，得到黄色油状烯烃4。

(f)还原反应：将7.59g烯烃4溶于55mL无水四氢呋喃中，并将所得溶液用丙酮中的干冰冷却至-78℃，在1h内向上述溶液滴加68mL 1.0M二异丁基氢化铝的无水甲苯溶液，在该温度下搅拌90min，并通过TLC监测反应，展开剂为环己烷-乙酸乙酯(8:2，v/v)，之后依次加入30mL甲醇和30mL NH₄Cl淬灭反应。使所得溶液升温至室温30min后将混合物用545垫过滤并用150mL二氯甲烷洗涤，再将有机层用200mL>4干燥，过滤并真空浓缩，再经过硅胶柱层析纯化，以0-20％AcOEt的环己烷溶液作为流动相梯度洗脱，得到淡黄色油状的烯丙醇。

(g)氧化反应：将3.4g烯丙醇溶于100mL无水甲苯中，将所得溶液冷却至0℃，再加入13.6g MnO₂，将所得悬浮液在55℃剧烈搅拌2h。通过TLC监测反应，展开剂为环己烷-乙酸乙酯(8:2，v/v)，将所得溶液用545垫过滤，并用大量二氯甲烷洗涤。将所得滤液减压浓缩，得到黄色油状物醛5。

(h)Wittig反应：将3.39g新制备的醛5溶于80mL无水甲苯中，加入6.06g磷叶立德(1-乙氧基羰基亚甲基)三苯基正膦，将所得反应混合物搅拌并回流过夜。通过TLC监测反应，展开剂为环己烷-乙酸乙酯(8:2，v/v)。此后，将反应混合物用545垫过滤，用二氯甲烷洗涤并减压浓缩。所得油状残余物通过硅胶柱纯化，以0-20％AcOEt的环己烷溶液作为流动相梯度洗脱，得到黄色油状物酯6。

(i)还原反应：将1.0g酯6溶于12mL无水四氢呋喃中，并将所得溶液用干冰的丙酮冷却至-78℃，在15min内向上述溶液中逐滴滴加12mL 1.0M二异丁基氢化铝的无水甲苯溶液，在-78℃下搅拌90min，并通过TLC监测反应，展开剂为环己烷-乙酸乙酯(8:2，v/v)，之后在-78℃下，缓慢加入5mL甲醇和5mL NH₄Cl淬灭反应，然后将溶液温热至室温搅拌30min。加入50mL>4干燥，过滤并在真空下浓缩。所得残余物通过硅胶柱纯化，以0-20％AcOEt的环己烷溶液作为流动相梯度洗脱，得到黄色油状中间体醇。

(j)氧化反应：将上一步所得醇全部溶于35mL无水甲苯中，冷却至4℃。加入4.0g MnO₂，在50℃下搅拌1h。通过TLC监测反应，展开剂为环己烷-乙酸乙酯(7:3，v/v)，并将悬浮液用545垫过滤，并用大量二氯甲烷洗涤，减压浓缩滤液得到黄色油状醛7。

(k)氧化反应：将醛7溶于10mL DMSO中，再加入3.0g 1,3,5-三甲氧基苯后搅拌5min，之后将2.0g NaClO₂和3.0g>2PO₄溶于水中，再将该水溶液逐滴加入到DMSO溶液中并持续搅拌，通过TLC监测反应，展开剂为环己烷-乙酸乙酯(1:1，v/v)，反应4h后使用Na₂S₂O₃猝灭反应并加入5mL>4干燥，所得残余物通过硅胶柱纯化，以40％AcOEt的正己烷溶液(0.1％HOAc)作为流动相梯度洗脱，减压浓缩滤液得到黄色油状羧酸8，经TLC纯化反应，展开剂为环己烷-乙酸乙酯(1:1，v/v)。

另外，上述新型小分子结构LH-1在制备蓝绿藻肝毒素检测用人工抗原、在制备蓝绿藻肝毒素检测用抗体或在制备蓝绿藻肝毒素检测产品方面的应用，均应在本发明的保护范围之内。

一种由上述新型小分子结构LH-1与载体蛋白偶联制得小分子人工抗原，以及由该人工抗原免疫动物获得的抗体，也均在本发明的保护范围之内。

优选地，所述载体蛋白为钥孔血蓝蛋白(KLH)等。

具体是将该小分子人工抗原乳化后免疫兔，分离纯化兔血清得到多克隆抗体。

作为优选的实施方案，新型小分子结构多克隆抗体的制备方法包括以下步骤：

用新型小分子结构偶联钥孔血蓝蛋白(KLH)的人工抗原免疫新西兰大白兔，分别将1mg/mL的人工抗原溶液与等量佐剂混合乳化，初次免疫与弗氏完全佐剂混合乳化后免疫，之后的加强免疫使用免疫原与弗氏不完全佐剂乳化后免疫，共免疫四次，每次间隔3周，每次免疫剂量为0.6mL/只；第四次免疫后第十天采血，采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体。

另外，上述小分子人工抗原或由其制备的蓝绿藻肝毒素检测用抗体在制备蓝绿藻肝毒素检测产品方面的应用，也都在本发明的保护范围之内。

一种蓝绿藻肝毒素广谱免疫层析试纸条，是将上述抗体进行金纳米颗粒标记制得抗体标记的纳米金颗粒，将微囊藻毒素MC-LR人工抗原(微囊藻毒素MC-LR与载体蛋白偶联制得)包被于硝酸纤维膜上作为检测带，羊抗兔二抗作为控制带，依据免疫竞争法原理建立快速检测蓝绿藻肝毒素的广谱性免疫层析试纸条。

具体地，所述蓝绿藻肝毒素广谱免疫层析试纸条依次包括点样孔、检测带和控制带；点样孔上喷涂新型小分子结构抗体标记的胶体金复合物，检测带为微囊藻毒素MC-LR的蛋白载体的偶联物，控制带上喷涂羊抗兔二抗；试纸的基质为硝酸纤维膜。

更具体地，所述蓝绿藻肝毒素广谱免疫层析试纸条由如下方法制备得到：将新型小分子结构抗体标记的胶体金复合物喷涂金标垫(喷涂量为50～70μL/cm²，优选60μL/cm²)，用7～10mg/mL(优选8mg/mL)的MC-LR-OVA在硝酸纤维膜(NC膜)上划线为检测线(T线)，用0.1～0.3mg/mL(优选为0.2mg/mL)的羊抗兔二抗划线作为控制线(C线)，将金标垫裁剪为4～10mm(优选6mm)的宽度，待干燥后组装试纸条，使用免疫定量读数仪度数。

其中，所述MC-LR-OVA为微囊藻毒素MC-LR与载体蛋白偶联制得的人工抗原。

所述新型小分子结构抗体标记的胶体金复合物由如下方法制备得到：将超纯水加热至沸腾，加入0.5～1.5％(优选1％)氯金酸，再次加热至沸腾，加入2～5％(优选4％)柠檬酸三钠，煮沸直至溶液颜色由蓝紫色变为紫红色且不再发生变化后2～5min；待胶体金溶液冷却后，向胶体金溶液中加入0.1～0.3mol/mL(优选0.2mol/mL)碳酸钾溶液震荡，再加入的权利要求5所述抗体后将混合液静置反应3～8min(优选5min)，再加入15～25％(优选20％)BSA封闭，6000～10000rpm离心3～8min(优选8000rpm离心5min)，溶液浓缩至原体积的85～90％。

其中，优选地，所述超纯水：1％氯金酸：4％柠檬酸三钠的体积比为400：16：5～8。

优选地，所述胶体金溶液：碳酸钾溶液：抗体：BSA的体积比为1mL：1μL：2μL：20μL。

另外，上述蓝绿藻肝毒素广谱免疫层析试纸条在检测微囊藻毒素结构类似物和/或节球藻毒素方面的应用，也在本发明的保护范围之内。

优选地，所述微囊藻毒素结构类似物和/或节球藻毒素公有九种：MC-YR、MC-LR、MC-WR、NOD、MC-LA、MC-RR、MC-LW、MC-LY和MC-LF。

本发明具有以下有益效果：

(1)本发明设计了一种新型小分子结构LH-1((2E，4E，6S，7S)-7-甲氧基-4,6-二甲基-8-苯辛基-2,4-二烯酸)的合成方法，该方法简单可行，可以用于与载体蛋白偶联作为免疫原或包被原增加检测方法的广谱性；

(2)本发明得到的LH-1抗体对MC-LR进行检测的IC₅₀为7.0ng/mL，LOD为0.1ng/mL，IC₂₀-IC₈₀为0.6-87.8ng/mL，对MC-LW、MC-YR、MC-LF、MC-WR、NOD、MC-LA、MC-RR和MC-LY的交叉反应率分别为405.7％、164.6％、163.5％、136.6％、129.4％、92.1％、70.1％和37.8％，LOD均低于1ng/mL故本法所得新型小分子结构LH-1多克隆抗体灵敏度良高，特异型好，可用于建立蓝绿藻肝毒素免疫层析试纸条；

(3)本发明制得的蓝绿藻肝毒素广谱性免疫层析试纸条灵敏度高，广谱性好，可半定量检测九种主要微囊藻毒素结构类似物和节球藻毒素，对其中的MC-YR、MC-LR、MC-WR、NOD、MC-LA检测限可以达到1ng/mL，MC-RR、MC-LW、MC-LY和MC-LF检测限也可达到2ng/mL，具有广阔的发展前景。

附图说明

图1.广谱性免疫层析试纸条制备流程图。

图2.新型小分子结构LH-1合成过程示意图。

图3.新型小分子结构LH-1人工抗原紫外扫描鉴定曲线。

图4.新型小分子结构LH-1抗体间接竞争ELISA标准曲线。

图5.广谱性免疫层析试纸条广谱性检测结果。

图6.广谱性免疫层析试纸条基质效应的影响。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

本发明研究由如下基金支持：国家自然科学基金：藻毒素广谱特异性免疫识别分子基础研究(U1301214)；广东省大学生科技创新培育专项资金：微囊藻毒素广谱性快速检测胶体金免疫层析试纸条的研制(pdjh2016b0089)。

以下实施例包括新型小分子结构LH-1的合成、人工抗原的合成、新型小分子结构LH-1多克隆抗体的制备、新型小分子结构LH-1抗体的ELISA检测、蓝绿藻肝毒素广谱性免疫试纸条的制备，流程如图1所示。

实施例1 新型小分子LH-1结构的合成

1、新型小分子结构LH-1的合成

新型小分子结构LH-1的合成路线图如图2所示，具体反应流程如下：

(a)缩二脲醛醇缩合：室温下，称取26.2g右旋N-丙酰基硫偶氮烷硫酮(CAS：1217320-19-8)溶于250mL无水二氯甲烷中搅拌，之后在丙酮中用干冰冷却至-78℃，逐滴向上述溶液中加入12mL四氯化钛，所得混合物搅拌15min形成钛络合物，再向上述溶液中加入18.9mL蒸馏过的N,N-二异丙基乙胺，将混合物接着搅拌40min形成相应的烯醇化钛，再加入20.0mL新蒸馏的N-甲基吡咯烷酮，10min后，加入13.4mL新蒸馏的苯乙醛，将上述溶液持续在-78℃再放置30min后温热至4℃再搅拌1h。通过TLC监测反应，展开剂为环己烷-乙酸乙酯(7:3，v/v)，最后加入300mL 50％NH₄Cl水溶液猝灭反应。将有机层用300mL>2CO₃和300mL盐水洗涤两次，再用Na₂SO₄干燥。得到黄色固体状的醛醇2。

(b)反式酰胺化反应：将37.1g醛醇2溶于无水150mL二氯甲烷中，依次加入14.6g N,O-二甲基羟胺盐酸盐和27.2g咪唑，将此混合物在室温下搅拌12h。通过TLC监测反应，展开剂为环己烷-乙酸乙酯(7:3，v/v)。然后用300mL去离子水将有机层洗涤3次，再用Na₂SO₄干燥，过滤并真空浓缩。所得残余物通过硅胶柱层析纯化，称取600g硅胶填柱，以环己烷和乙酸乙酯(AcOEt，30-50％)作为流动相梯度洗脱，得到黄色油状物中间体Weinreb酰胺。

(c)烷基化反应：将40.1mL碘甲烷溶于140mL无水四氢呋喃中，再将此溶液与1.38g固体Na₂CO₃混合搅拌10min后冷却至4℃，通过脱脂棉过滤并加入到先前获得的15.1g>4Cl去除。混合物用AcOEt萃取两次，有机层再用250mL盐水洗涤，之后用Na₂SO₄干燥，过滤并减压浓缩。用300g硅胶填柱后，用环己烷-AcOEt(6:4，v/v)作为流动相纯化，得到黄色油状Weinreb酰胺3。

(d)还原反应：将10.71g Weinreb酰胺3溶于100mL无水二氯甲烷中，将所得溶液用在丙酮中的干冰冷却至-78℃。在80min内滴加100mL的1.0M二异丁基氢化铝的无水甲苯溶液。通过TLC监测反应，展开剂为环己烷-乙酸乙酯(7:3，v/v)，再依次加入40mL甲醇和40mL饱和NH₄Cl猝灭反应，之后将该溶液升温至室温搅拌30min。然后将混合物通过545垫，并用300mL苯乙基洗涤，合并有机相后用200mL>4干燥，过滤并真空浓缩得到橙色油状中间体醛。

(e)Wittig反应：将8.48g新制备的醛溶于275mL无水甲苯中，加入18.52g磷叶立德(1-乙氧基羰基亚乙基)三苯基正膦，将所得混合物回流反应12h。通过TLC监测反应，展开剂为环己烷-乙酸乙酯(8:2，v/v)。将反应混合物减压浓缩，所得残余物通过硅胶柱纯化，用0-10％AcOEt的环己烷溶液作为流动相，得到黄色油状烯烃4。

(f)还原反应：将7.59g烯烃4溶于55mL无水四氢呋喃中，并将所得溶液用丙酮中的干冰冷却至-78℃，在1h内向上述溶液滴加68mL 1.0M二异丁基氢化铝的无水甲苯溶液，在该温度下搅拌90min，并通过TLC监测反应，展开剂为环己烷-乙酸乙酯(8:2，v/v)，之后依次加入30mL甲醇和30mL NH₄Cl淬灭反应。使所得溶液升温至室温30min后将混合物用545垫过滤并用150mL二氯甲烷洗涤，再将有机层用200mL>4干燥，过滤并真空浓缩，再经过硅胶柱层析纯化，以0-20％AcOEt的环己烷溶液作为流动相梯度洗脱，得到淡黄色油状的烯丙醇。

(g)氧化反应：将3.4g烯丙醇溶于100mL无水甲苯中，将所得溶液冷却至0℃，再加入13.6g MnO₂，将所得悬浮液在55℃剧烈搅拌2h。通过TLC监测反应，展开剂为环己烷-乙酸乙酯(8:2，v/v)，将所得溶液用545垫过滤，并用大量二氯甲烷洗涤。将所得滤液减压浓缩，得到黄色油状物醛5。

(h)Wittig反应：将3.39g新制备的醛5溶于80mL无水甲苯中，加入6.06g磷叶立德(1-乙氧基羰基亚甲基)三苯基正膦，将所得反应混合物搅拌并回流过夜。通过TLC监测反应，展开剂为环己烷-乙酸乙酯(8:2，v/v)。此后，将反应混合物用545垫过滤，用二氯甲烷洗涤并减压浓缩。所得油状残余物通过硅胶柱纯化，以0-20％AcOEt的环己烷溶液作为流动相梯度洗脱，得到黄色油状物酯6。

(i)还原反应：将1.0g酯6溶于12mL无水四氢呋喃中，并将所得溶液用干冰的丙酮冷却至-78℃，在15min内向上述溶液中逐滴滴加12mL 1.0M二异丁基氢化铝的无水甲苯溶液，在-78℃下搅拌90min，并通过TLC监测反应，展开剂为环己烷-乙酸乙酯(8:2，v/v)，之后在-78℃下，缓慢加入5mL甲醇和5mLNH₄Cl淬灭反应，然后将溶液温热至室温搅拌30min。加入50mL>4干燥，过滤并在真空下浓缩。所得残余物通过硅胶柱纯化，以0-20％AcOEt的环己烷溶液作为流动相梯度洗脱，得到黄色油状中间体醇。

(j)氧化反应：将上一步所得醇全部溶于35mL无水甲苯中，冷却至4℃。加入4.0g MnO₂，在50℃下搅拌1h。通过TLC监测反应，展开剂为环己烷-乙酸乙酯(7:3，v/v)，并将悬浮液用545垫过滤，并用大量二氯甲烷洗涤，减压浓缩滤液得到黄色油状醛7。

(k)氧化反应：将醛7溶于10mL DMSO中，再加入3.0g 1,3,5-三甲氧基苯后搅拌5min，之后将2.0g NaClO₂和3.0g>2PO₄溶于水中，再将该水溶液逐滴加入到DMSO溶液中并持续搅拌，通过TLC监测反应，展开剂为环己烷-乙酸乙酯(1:1，v/v)，反应4h后使用Na₂S₂O₃猝灭反应并加入5mL>4干燥，所得残余物通过硅胶柱纯化，以40％AcOEt的正己烷溶液(0.1％HOAc)作为流动相梯度洗脱，减压浓缩滤液得到黄色油状羧酸8，经TLC纯化反应，展开剂为环己烷-乙酸乙酯(1:1，v/v)。

2、鉴定：

取新型小分子结构LH-1进行氢谱核磁、碳谱核磁和质谱鉴定。

氢谱核磁结果如下：¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)

δ_H7.41(1H，d，J＝10.4Hz，H-2)，7.28(2H，dd，J＝8.8Hz，J＝2.8Hz，H-3’,5’)，7.17-7.22(3H，m，H-2’,4’,6’)，5.88(1H，d，J＝6.4Hz，H-5)，5.81(1H，d，J＝10.4Hz，H-3)，3.27(3H，s，C₇-OCH₃)，3.22-3.26(1H，m，H-7)，2.80(1H，dd，J＝9.2Hz，J＝3.2Hz，H-8a)，2.72(1H，dd，J＝9.2Hz，J＝4.8Hz，H-8b)，2.63-2.68(1H，m，H-6)，1.68(3H，s，C₄-CH₃)，1.07(3H，d，J＝4.4Hz，C₆-CH₃)。

碳谱核磁结果如下：¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)

δ_C172.9(C-1)，152.0(C-3)，145.7(C-1’)，138.9(C-5)，132.5(C-4)，129.4(C-3’,5’)，128.3(C-2’,6’)，126.2(C-4’)，115.3(C-2)，86.4(C-7)，58.7(C₇-OCH₃)，38.1(C-8)，37.1(C-6)，15.6(C₄-CH₃)，12.3(C₆-CH₃)

质谱结果如下：ESI-MS：m/z[M-H]^-243.2(C₁₇H₂₁O₃)。

两者结果皆表明合成结果正确且成功，成功合成得到新型小分子结构LH-1。

实施例2 人工抗原的合成

1、人工抗原的合成

(1)准确称取2mg LH-1，1mg NHS和1mg EDC溶解于500μL DMF中，室温下避光过夜搅拌，未见沉淀出现；

(2)8mg钥孔血蓝蛋白(KLH)加入到500μL的碳酸缓冲液(0.1moL/L，pH 9.6)中；

(3)将LH-1溶液缓慢逐滴加入KLH溶液中，室温下避光搅拌3h；

(4)用磷酸盐缓冲液透析两天，每天4次，透析结束后得LH-1人工抗原。

(5)MC-LR与卵清蛋白(OVA)的偶联方法同上。

碳酸盐溶液(0.1M，pH 9.6)：称量1.59g Na₂CO₃和2.93g>3，用去离子水定容1000mL。

磷酸盐缓冲液(0.01M，pH 7.4)：Na₂HPO₄·12H₂O>2PO₄>

2、鉴定

取人工抗原进行紫外扫描，结果如图3所示。

LH-1、KLH和人工抗原分别进行紫外(200～400nm)扫描鉴定，并通过比较偶联前后的各物质的最高吸光值，发现人工抗原的吸收曲线与载体蛋白明显不同，KLH仅在280nm处有特征峰，LH-1在300nm处有特征峰，而偶联反应后，LH-1-KLH在290nm处出现特征峰，对比三者曲线可看出发生显著位移，故说明反应产物是载体蛋白与LH-1的复合物，偶联成功。

实施例3 新型小分子结构LH-1多克隆抗体的制备及纯化

1、新型小分子结构LH-1抗体制备

用LH-1-KLH免疫新西兰大白兔，将1mg/mL的人工抗原溶液与等量佐剂混合乳化，初次免疫与弗氏完全佐剂混合乳化后免疫，之后的加强免疫使用免疫原与弗氏不完全佐剂乳化后免疫，共免疫四次，每次间隔3周，每次免疫剂量为0.6mL/只，第四次免疫后第十天采血。

2、新型小分子结构LH-1多克隆抗体纯化(辛酸-硫酸铵法)：

(1)取兔血清，在4℃条件下，12000r/min离心15min，去除沉淀；

(2)取1体积的兔血清与2体积的醋酸盐缓冲液混合(pH4.8)，室温搅拌下，逐滴加入正辛酸，使用量为75μL正辛酸/mL兔血清；

(3)室温搅拌混合30min，4℃静止2h使其充分沉淀；

(4)4℃条件下，12000r/min离心15min，去除沉淀；

(5)上清经砂芯漏斗或125μm尼龙网过滤后，加入1/10体积的PBS缓冲液(0.1M，pH 7.4)，用2M的氢氧化钠调pH至7.4，计算总溶液体积；

(6)冰浴下于30min内加入0.277g/mL的硫酸铵，使其成为45％饱和溶液；

(7)4℃静止1h以上后，4℃条件下，12000r/min离心15min，弃上清；

(8)沉淀用PBS缓冲液(0.1M，pH 7.4)溶解并透析三天。

实施例4 新型小分子结构LH-1抗体的ELISA检测

1、ELISA检测流程

(1)将MC-LR-OVA人工抗原用包被液稀释至0.5μg/mL的浓度，包被96孔酶标板，每孔加入100μL，37℃温育过夜；

(2)弃去包被液，洗涤2次；

(3)每孔加入120μL封闭液(5％脱脂奶粉)，37℃封闭30min；

(4)弃去封闭液，拍板，37℃烘干备用；

(5)用PBST 1:8000倍稀释新型小分子结构LH-1抗体，并将微囊藻毒素MC-LR稀释至1000，100，10，1，0.1，0.01，0.001ng/mL；

(6)每行加50μL MC-LR稀释液(三组平行)，再加50μL抗体稀释液/孔，在37℃温育40min，洗涤5次；

(7)加入羊抗兔二抗-HRP(4000倍稀释)，37℃温育30min，洗涤5次，拍板；

(8)加入显色液显色10min；

(9)加入50μL10％H₂SO₄终止反应，并在450nm处读取OD值；

(10)将MC-LR换成MC-RR、MC-YR、MC-LW、MC-LF、MC-LA、MC-LY、MC-WR和NOD八种药物分别检测，使用IC₅₀的比值计算交叉反应率。

2、检测结果

LH-1-KLH免疫所得抗体间接竞争ELISA标准曲线如图4所示。

对MC-LR的识别性能良好，其IC₅₀为7.0ng/mL，LOD为0.1ng/mL，IC₂₀-IC₈₀为0.6-87.8ng/mL，对MC-LW、MC-YR、MC-LF、MC-WR、NOD、MC-LA、MC-RR和MC-LY的交叉反应率分别为405.7％、164.6％、163.5％、136.6％、129.4％、92.1％、70.1％和37.8％，LOD均低于1ng/mL故本法所得新型小分子结构LH-1多克隆抗体灵敏度良高，特异型好，可用于建立蓝绿藻肝毒素免疫层析试纸条。

实施例5 蓝绿藻肝毒素广谱性免疫试纸条的制备

1、胶体金的制备

将400mL超纯水加热至沸腾，加入16mL的1％氯金酸，再次加热至沸腾，加入5～8mL的4％柠檬酸三钠，煮沸直至溶液颜色由蓝紫色变为紫红色且不再发生变化后2～5min，带胶体金溶液冷却后备用，所得金颗粒大小均一。

2、新型小分子结构LH-1多抗胶体金的标记

向1mL胶体金中分别加入1μL的0.2mol/mL碳酸钾溶液震荡，再加入2μL的多抗，将混合液静置反应5min，再加入20μL的20％BSA封闭，8000rpm离心5min，浓缩至900μL，喷涂金标垫(60μL/cm²)。

3、样品垫液的确定

用6mg/mL的MC-LR-OVA在硝酸纤维膜(NC)上划线为检测线(T线)，用0.2mg/mL的羊抗兔二抗划线作为控制线(C线)，将金标垫裁剪为6mm的宽度，待干燥后组装试纸条，用5‰Casein Na+1‰、2‰、3‰、4‰吐温+曲拉通10mmol PBS溶液做样品液，点样孔上分别滴加60μL的样品液，每隔5min使用免疫定量读数仪度数。结果如表1。

表1

时间1‰吐温+曲拉通2‰吐温+曲拉通3‰吐温+曲拉通4‰吐温+曲拉通5min6147.240.344.910min88.37072.857.115min117.789.1113.386.620min128106149.9115.8

可得出使用5‰Casein Na+1‰吐温+曲拉通10mmol PBS溶液做样品液时，显色最快且颜色最深。

4、MC-LR-OVA包被量的确定

用1、4、6、8mg/mL的MC-LR-OVA在NC膜上划线为检测线(T线)，用0.2mg/mL的羊抗兔二抗划线作为控制线(C线)，将金标垫裁剪为6mm的宽度，待干燥后组装试纸条，用5‰Casein Na+1‰吐温+曲拉通10mmolPBS溶液涂样品垫，使用蒸馏水为阴性样品，稀释成1ng/mL的微囊藻毒素MC-LR作为阳性样品，点样时，每孔分别滴加60μL，每隔5min使用免疫定量读数仪度数。结果如表2。

表2

可得出使用8mg/mL MC-LR-OVA溶液包被于NC膜上时，显色最快且颜色最深，且阴阳性数值差最明显，且可看出在15min后反应趋于平衡，数值变化不明显，故于15min时度数。

5、试纸条灵敏度及广谱性的检测

使用上述实施例中确定的条件喷涂NC膜、金标垫和样品垫，组装试纸条，将试纸条裁成3.5nm宽度，使用蒸馏水为阴性样品，将MC-LR、MC-YR、MC-RR、MC-WR、MC-LA、MC-LW、MC-LY、MC-LF和DON分别稀释成8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625ng/mL作为阳性样品进行检测，点样时，每孔分别滴加60μL，每隔5min使用免疫定量读数仪度数，每组重复三次，结果如图5所示。制得的蓝绿藻肝毒素广谱性免疫层析试纸条灵敏度高，广谱性好，可半定量检测九种主要蓝绿藻肝毒素，对其中的MC-YR、MC-LR、MC-WR、NOD、MC-LA检测限可以达到1ng/mL，MC-RR、MC-LW、MC-LY和MC-LF检测限也可达到2ng/mL，具有广阔的发展前景。

6、试纸条基质效应的检测

使用上述实施例中确定的条件喷涂NC膜、金标垫和样品垫，组装试纸条，将试纸条裁成3.5nm宽度，分别用蒸馏水和湖水分别将MC-LR稀释成8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625，0ng/mL，点样时，每孔分别滴加60μL，每隔5min使用免疫定量读数仪度数，每组重复三次，结果如图6所示，即本技术所述试纸条在检测湖水时，检测限仍可以达到1ng/mL，故该免疫层析试纸条可对经过滤后的湖水样品进行检测。