法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2019-09-27
授权
授权
2017-10-20
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N1/14 申请日:20170705
实质审查的生效
2017-09-19
公开
公开
技术领域
本发明属于海洋真菌提取新化合物领域,更具体地说,本发明涉及一种新的团青霉T3-1(Penicillium commune T3-1),及其发酵提取得到的一类青霉发酵化合物、相应的提取纯化方法和青霉发酵化合物在抗过敏中的应用。
背景技术
食物过敏,即食物变态反应,是指某些人在吃了某种食物之后,引起身体某一组织、某一器官甚至全身的强烈反应,以致出现各种各样的功能障碍或组织损伤,严重者甚至可能引起过敏性休克。食物过敏威胁着人类生命健康,在过去几十年内其发病率逐渐增加,几乎10%的儿童患有食物过敏。食品法典委员会指出常见的食物过敏原包括牛奶、鸡蛋、鱼类、甲壳类、贝类、花生、坚果、大豆、谷物等。其中,贝类过敏是最常见的食物过敏,原肌球蛋白(muscle protein tropomyosin,TM)已被确定为贝类的主要过敏原。食物过敏反应主要是血清免疫球蛋白(immunoglobulin E,IgE)介导的,而这种过敏反应通常伴随着特异型免疫球蛋白IgE含量的提高。
目前治疗食物过敏的方案只有避免接触过敏原或进行脱敏疗法,还未找到抑制致敏食物抗原的活性药物。膳食干预是食物过敏管理一个至关重要的组成部分,但却会对人体的营养摄入和生活质量产生负面影响;而使用抗组胺类药物或激素类药物容易产生耐药性等副作用,所以寻找抗过敏活性化合物尤为重要。
天然化合物是创新药物研究的重要源泉,据最新的一份统计表明,从1981年到2014年共三十多年的时间里批准的小分子药物共有1211个,其中来自天然产物及其衍生物的占65%。上世纪五十年代,由于青霉素的发现,导致了对陆地微生物持续50多年的集中研究和开发。时至今日,陆地微生物次级代谢产物发现的重复率已高达95%,因此人们将关注度转向海洋,尤其是深海。目前,海洋微生物来源的代谢产物正迅速成为药物研发的新源泉。目前已有多种海洋来源的微生物次级代谢产物被开发成用于治疗包括肿瘤、病毒等在内多种疾病的药物。
因此,在海洋微生物中筛选发现具有抗过敏活性的天然产物对于抗过敏药物研发具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于:克服现有技术中存在的上述问题,提供一种新的深海团青霉T3-1(Penicillium commune T3-1),由此发酵提取得到的、具有抗过敏活性的一类青霉发酵化合物以及相应的发酵提取纯化方法。
为了实现上述发明目的,本发明提供了一种团青霉T3-1(Penicillium communeT3-1),其保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 2017123,保藏地址为中国.武汉.武汉大学,保藏日期为2017年3月15日。
为了实现上述发明目的,本发明还提供了一类青霉发酵化合物,这类青霉发酵化合物是由上述团青霉T3-1(Penicillium commune T3-1)经发酵提取纯化而得;其结构式如式(I)和式(II)所示:
本发明另一目的在于提供上述青霉发酵化合物的提取纯化方法,包括如下步骤:
(1)取深海真菌青霉属T3-1,加入到培养基中静置培养,然后加入有机溶剂萃取,将萃取液低压浓缩得到青霉发酵粗提物;
(2)将青霉发酵粗提物进行ODS色谱柱吸附,然后使用甲醇水溶液进行梯度洗脱;
(3)将步骤(2)所得活性部位进行葡聚糖凝胶LH-20吸附,然后使用体积比为1:1的氯仿/甲醇溶液进行洗脱;
(4)将步骤(3)所得活性部位进行硅胶柱层析吸附,然后采用体积比为10:0~1:1的氯仿/甲醇溶液进行梯度洗脱;
(5)根据TLC检测结果,收集合并步骤(4)中的氯仿/甲醇溶液洗脱液,减压浓缩蒸干后得到权利要求1或2所述两种青霉发酵化合物。
本发明经实验发现,上述青霉发酵化合物具有较强的抗过敏活性,因此,本发明的另一目的在于提供上述青霉发酵化合物在制备抗过敏活性药物中的应用。
本发明还有一个目的在于提供一种新的抗过敏活性药物,其包括有效剂量的作为活性成分的上述青霉发酵化合物及其盐类中的一种或几种的组合,以及药学上可接受的载体。
相对于现有技术,本发明青霉发酵化合物由深海真菌团青霉T3-1(Penicilliumcommune T3-1)发酵提取纯化得到,经实验发现,其具有较强的抗过敏活性,可用于制备和开发抗过敏药物。本发明为研发抗过敏药物提供了新的化合物来源,对我国海洋药物开发具有重要意义,还可促进深海生物资源的有效应用,具有良好的应用前景。
一种团青霉T3-1(Penicillium commune T3-1),保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 2017123,保藏地址为中国.武汉.武汉大学,保藏日期为2017年3月15日。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是,本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明,并非为了限定本发明,实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。
实施例1
本实施例以深海真菌中的团青霉T3-1(Penicillium commune T3-1)为原料,制备式(I)和式(II)所示的青霉发酵化合物,具体步骤如下:
(1)取团青霉T3-1(Penicillium commune T3-1),加入到培养基中,静置35天,加有机溶剂萃取三次,合并得到的萃取液,将萃取液低压浓缩,得到28.6g青霉发酵粗提物;
(2)将步骤(1)中青霉发酵粗提物进行C18ODS色谱柱吸附,采用甲醇水溶液进行梯度洗脱;
(3)将步骤(2)中所得活性部位用葡聚糖凝胶LH-20吸附,使用1:1的氯仿-甲醇溶液进行洗脱;
(4)将步骤(3)中得到的活性部位进行100-200目硅胶柱层析吸附,采用10:0至1:1的氯仿-甲醇溶液进行梯度洗脱;
(5)根据TLC检测结果,收集和合并步骤(4)中氯仿-甲醇溶液洗脱液,减压浓缩蒸干后得到两种化合物分别为1、2,重量分别为5.7mg、3.0mg,化合物1为白色粉末,化合物2为淡黄色油状物质。
将上述所得化合物分别用1H-NMR和13C-NMR谱分析。化合物1高分辨质谱(HR>32H41NO3。在1H>H>H>H>H>H>H>H>H>13C>2(δC>3(δC>2(δC>3(δC>2(δC>3(δC>C>
化合物2,HR ESI MS给出分子式为C15H16O2。1H>H>H>H>H>1H>H>H>H>13C>C>2次甲基(δC>C>
表1本发明化合物1的1H、13C-NMR数据
表2本发明化合物2的1H、13C-NMR数据
实施例2实施例1制备得到的化合物1、2的体外抗过敏活性筛选
本实施例选择IgE介导的RBL-2H3细胞模型,检测细胞致敏后的脱颗粒效率,计算化合物样品对细胞脱颗粒效率的抑制率,从而检测实施例1中化合物1、2的抗过敏活性。
本实施例分为以下3组:
(1)阳性对照组,氯雷他定;
(2)化合物1实验组:实施例1中步骤(5)所得深海真菌化合物1;
(3)化合物2实验组:实施例1中步骤(5)所得深海真菌化合物2;
本实施例采用如下操作:
(1)胰酶消化回收RBL-2H3细胞,6×105cells/mL,每孔加100μL(即6×104cells/孔)入96孔板,同时添加anti-DNP-IgE至1μg/mL的终浓度,培养箱(37℃,5%CO2)孵育过夜;
(2)用PBS洗孔3遍,将样品溶于PBS中,分别取5μL样品加95μL Tyrode’s缓冲液混匀(粗样终浓度100μg/mL),阴性对照为5μL PBS+95μL Tyrode’s缓冲液,分别取95μL加到培养板中,继续培养1h。用1μg/mL DNP-BSA刺激RBL-2H3细胞6小时;
(3)β-氨基己糖苷酶的活性利用4-methylumbellife-ryl-N-acetyl-β-D-glucosaminide底物进行检测,回收细胞培养上清后,向培养板中加100μL Tyrode’s缓冲液(含0.1%Triton X-100)裂解细胞;最后用25μL上清或细胞裂解液分别入96孔荧光板,每孔加100μL4-methylumbellife-ryl-N-acetyl-β-D-glucosaminide试剂(1.2mM),反应30min(37℃),用酶标仪获取每孔溶液360nm激发,450nm发射的荧光值。
(4)脱颗粒效率计算公式:
脱颗粒效率=(上清的荧光值/(上清的荧光值+细胞裂解液的荧光值))×100%。
结果显示化合物1、2有较明显的抗过敏活性,其IC50分别为:10.36μg/ml和20.66μg/ml,优于阳性对照氯雷他定的35.01μg/ml,可用于制备相应的治疗药物。
根据上述说明书的揭示和教导,本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此,本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式,对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外,尽管本说明书中使用了一些特定的术语,但这些术语只是为了方便说明,并不对本发明构成任何限制。
机译: 新型α-氯化碳酸盐,其制造方法和在保护氨基酸胺官能团中的应用
机译: 氯化碳酸盐,其制造方法和在保护氨基酸胺官能团中的应用
机译: 由3-氰基-4--1-乙基亚磺酰基苯基吡唑类杀虫剂组成,包括应用,使用这种化合物的人和动物隔离场所的有害生物抑制方法。其制备方法和在中间体化合物中的应用