一株从百香果根际土壤中筛选的具有强抑草作用真菌

摘要

本发明属于微生物除草剂领域，特别涉及一种从百香果土壤中筛选的抑草真菌。分别以莴苣（菊科）、稗草（禾本科）和狼尾巴草（禾本科）为受体，对该真菌菌株发酵液的抑草能力进行生物测试，发现其对两种受体的根长和株高都有很强的抑制率。发酵液中检测到原儿茶酸、对羟基苯甲酸、香草酸、水杨酸和肉桂酸具有抑草作用的酚酸。并把该菌株命名为FJ‑01‑BXG ‑08。通过对该菌株的形态学和ITS序列分析鉴定结果都表明该菌株为Aspergillus sydowii（聚多曲霉属）中的一员，为首次从桉树土壤中筛选强抑草真菌聚多曲霉属（Aspergillus sydowii）。

说明书

技术领域

本发明属于农作物病害防治领域，具体涉及一株从百香果根际土壤中筛选的具有强抑草作用真菌。

背景技术

百香果(Passiflora>)又名西番莲、鸡蛋果，是一种种植在热带、亚热带的藤本植物，其果汁具有助消化和滋补作用备受人们喜爱。据估计，目前世界百香果的种植面积已经达到2万多公顷，但是由于百香果越来越受欢迎，市场的需求量在不断的增加，百香果的种植面积也在不断的增加。有统计表明，80年代初世界对百香果的需求已经超过25万吨，但生产量也仅为12万吨，需求远远大于供给。在我国最初是20世纪初引进，主要的种植地有福建、台湾、海南、广东、云南等地。但由于长期的百香果种植，导致百香果种植土壤理化性质以及土壤微生态发生变化，从而致使百香果的幼苗和成株容易受到根腐病的危害。目前对于根腐病的研究认为其致病菌主要包括镰刀菌和腐霉菌等病原菌。根际微生物种类丰富、数量庞大，并且，根与土壤微生物之间基于共同进化的压力，通常它们之间具有专性。此外，根系分泌物的种类会影响到根际微生物群落结构。

杂草是影响作物产量提高的重要因素，现在已经成为世界性的难题。目前主要的除草方式是利用化学除草剂来进行农田的杂草防治。但长期、大量、非选择性的施用化学除草剂会导致土壤和地下水污染，杂草也会产生抗性。高浓度的化学除草剂也会增加农作物中有害物质的残留。因此，我们需要一种更为生态友好的方法来进行杂草的防治。生物除草剂是用于生物除草的植物病原微生物或微生物植物毒素，它具有环境安全、相容性好、在土壤中无残留等优点，是现在的一个研究热点。

化感作用是指植物、藻类、细菌、真菌、放线菌产生并释放次生代谢产物来影响周围其他植物的生长发育（抑制或促进作用）和农业系统。这些次生代谢产物主要包括：酚酸、萜类、黄酮类、脂肪酸等等。这些化感物质的含量决定了化感作用的强弱。

本发明利用植物化感作用原理和根际微生态的理论，在长期种植百香果的果园并感染根腐病的百香果植株根际筛选对植物有害的病原菌，为杂草防治减少化学除草剂使用提供一个新的思路。

发明内容

本发明提供一株从百香果根际土壤中筛选的聚多曲霉及其应用，该聚多曲霉发酵液中含有原儿茶酸、对羟基苯甲酸、香草酸、水杨酸和肉桂酸等具有抑草作用的酚酸，因此其发酵液具有抑草作用。本发明具有环境安全、环境相容性好，在土壤中无残留等优点。

为实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：

一株从桉树根际土壤中筛选的聚多曲霉，所述聚多曲霉为Aspergillus>FJ-01-BXG-08；已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏日期为2017.4.19，保藏号为CCTCC M 2017198。

所述聚多曲霉FJ-01- BXG -08的菌体及发酵液均对莴苣、禾本科的稗草和狼尾巴草的生长具有抑制作用。

本发明的另一目的在于提供一种利用上述从桉树根际土壤中筛选的聚多曲霉作为抑草真菌的方法，其使用方法如下：

（1）取菌株FJ-01- BXG -08进行发酵培养；

（2）取发酵液稀释1-100倍；

（3）将稀释发酵液浇于种子或植株周围即可。

本发明的优点在于：

该真菌菌株发酵液中含有原儿茶酸、对羟基苯甲酸、香草酸、水杨酸和肉桂酸等具有抑草作用的酚酸，其具有环境安全、环境相容性好，在土壤中无残留等优点；且对稗草和莴苣的根长和株高都有很强的抑制率。

附图说明

图1菌株FJ-01-BXG-08发酵液中酚酸HPLC色谱图；其中，峰1为原儿茶酸；峰2为对羟基苯甲酸；峰3为香草酸；峰6为水杨酸；峰7为肉桂酸。

图2菌株FJ-01-BXG-08形态图；图2A为菌株分生孢子图 (10×40)，图2B为菌落图。

图3 菌株FJ-01-BXG-08-ITS I区目的条带电泳图；图3A中泳道1为真菌菌株FJ-01-BXG-08-ITS I区目的条带电泳图，泳道2为DL10000 DNAMarker，图3B为DL10000DNAMarker标准电泳条带示意图。

图4菌株FJ-01-BXG-08利用NJ法（邻接法）构建的发育树。

图5不同浓度菌株FJ-01-BXG-08发酵液对小稗生长的影响。

具体实施方式

实施例1

菌株发酵液的抑草能力生物测试

分别在组培瓶中放一张滤纸，取稀释50倍的发酵液5 mL加入到组培瓶中，每个组培瓶中播入5粒刚冒白的莴苣，蒸馏水做对照，并将其置28℃恒温培养箱中培养，每个实验设置3次重复。培养3d后测定莴苣的根长和株高。抑制率计算按公式：IR=（1-TR/CK）×100%。其中，IR：抑制率(Inhibition>TR：处理(Treatment)；CK：对照(Control)。

再分别以稗草和狼尾巴草为实验对象进行发酵液抑草能力测试。以稗草为实验对象，发酵液稀释20倍；以狼尾巴草为实验对象，菌液稀释50倍进行抑草能力测试。抑草能力生物测试实验步骤同上，抑草能力测试结果见表1。

表1 FJ-01-BXG-08菌株发酵液稀释后对受体植株的影响

试验结果表明，FJ-01-BXG-08菌株发酵液稀释50倍后对莴苣的根长和株高都有很强的抑制作用，分别为80.08%和37.98%。对狼尾巴草的根长的抑制率达到45.15%，但对其株高抑制率只有9.93%。对于抗性较强的稗草，菌株发酵液稀释20倍后对其根长和株高也有很强的抑制作用，抑制率分别达到58.41%和34.43%。

实施例2菌株鉴定

1、形态学鉴定

菌落的形态学观察

在PDA固体培养基平板中间接入用直径0.8cm的打孔器打下的菌饼，28℃连续培养7d，每天观察菌落边缘和表面的质地、颜色纹饰等形态特征。

显微镜形态观察

将在PDA固体培养基平板上培养3d的菌落用解剖针挑出一点菌落，放在中间滴有无菌水的载玻片上，然后用两只解剖针尽量的把菌落分散开，盖上盖玻片，用吸水纸把载玻片周围的水吸干，在光学显微镜下观察分生孢子梗和孢子等形态。

形态学鉴定依据菌落的特征，根据魏景超的 《真菌鉴定手册》和C.J.Alexpoulos的Introductory Mycology对菌株进行初步的鉴定。

其分生孢子图及菌落形态如图2所示，其中，图2A为菌株FJ-01-BXG-08的分生孢子图，图2B为其菌落形态图。菌落在PDA培养基上恒温28℃培养5d，直径达3.00-4.00cm，菌落质地为丝绒状至絮状，致密有同心环，边缘白色；初生颜色呈灰绿色，老后颜色呈淡褐色；背面为乳白色或暗褐色，表面无渗出物。小分生孢子似青霉状，呈疏松柱形或散乱。

2、真菌菌株的分子生物学鉴定

利用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取纯化的真菌的基因组 DNA。选用下列真菌通用引物对菌株ITS I区进行PCR扩增测序：

上游引物 ITS1: 5'- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，

下游引物 ITS4: 5'- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'；

PCR 扩增体系为25μL，其中2×TaKaRa TaqTMHS Perfect Mix 3.7μL，上下游引物(20μmol·mL^-1)>

菌株ITS测序结果显示，其序列大小为542bp，通过与NCBI（Blast）中的数据进行同源性比较，该菌株与Aspergillus>的序列相似率达99%以上，推断该菌株是Aspergillus>（聚多曲霉属）。利用 MEGA 5.05 软件进行系统发育分析。采用邻接法(Neighbor-Joining，NJ)构建系统发育树如图4所示。

通过形态学和ITS鉴定结果表明该菌株是Aspergillus>（聚多曲霉属）中的一种。

实施例3 菌株发酵液中酚酸测定

取发酵液100mL，用磷酸调节pH到4.00，后加入8g的NaCl，溶解后溶液待用。取CleanertPEP固相萃取小柱分别经蒸馏水-甲醇-蒸馏水(8 mL - 8 mL - 6 mL)浸润和淋洗活化，后去除甲醇残余备用。将已经处理过的发酵液加到已经活化的PEP固相萃取小柱中，当发酵液都流完后，加入2mL的蒸馏水冲洗，再加入10mL的甲醇洗脱，并收集洗脱液后冷冻干燥。用1mL的甲醇（色谱纯）溶解后，用0.22μmL滤膜过滤于上样瓶中，即为发酵液上样样品。

分别取原儿茶酸、阿魏酸、肉桂酸、香草酸、水杨酸、对羟基苯甲酸等7种酚酸作为标准物质（均购于阿拉丁公司），用甲醇（色谱纯）配置成1mg/mL的母液备用。母液稀释成7个浓度梯度的混合溶液作为标准曲线，标准曲线方程见表2。

表2 酚酸物质的标准曲线方程

高效液相色谱的程序参照文献郑新宇等，略做调整，简述为：高效液相色谱仪为日本岛津（CBM-20A，LC-20AD，SPD-20A），色谱柱为SunFireTW-C18 (4.6 mm×250 mm, ID 5μm)；流动相: A-甲醇（色谱纯）和B-0.1 %磷酸溶液（分析纯）；洗脱条件：0-5min，A：B=27:73，5-10min A：B=27:73，10-15min A：B =50:50，检测波长为280 nm；流速为 1.6 mL /min；进样量10μL；柱温为30℃。

测试溶液的谱图与混合标样谱图对照，按保留时间确定物质，按标准曲线法计算各物质的相对含量；试验结果如图1所示，各物质含量如表3所示。

表3 菌株FJ-01-BXG-08的菌液酚酸含量分析

菌株FJ-01-BXG-08菌液的HPLC检测结果见表2，菌液中含原儿茶酸0.078mg/L，含对羟基苯甲酸1.05 mg/L，含香草酸4.19 mg/L，含水杨酸28.17 mg/L，含肉桂酸最高33.39 mg/L。

实施例4 菌株抑草潜力验证-盆栽实验

实验室的培养箱中进行，温度28℃，12h光照。取稻田土自然晾干，碾碎后去除土中的碎石和杂物，过筛。称取过筛后的细土500 g置于塑料盆（直径12cm，高6cm）中。将已催芽的小稗5粒播入土壤表层。对FJ-01-BXG-08菌株在28℃，180rpm/min,培养7天的发酵液进行3个梯度稀释，共4个处理。处理1：原液，处理2：稀释5倍，处理3：稀释20倍，处理4：稀释50倍。分别将各梯度的30mL稀释液浇于种子周围。对照为蒸馏水。每个处理重复3次。每天用喷雾器添加20mL蒸馏水以保持土壤湿润。种植5d后测定受体植株的根长和株高。

菌株发酵液对土培条件下的小稗的影响见表4，结果表明不同浓度梯度的菌株发酵液对小稗幼苗的生长是有影响的。对稗草株高的抑制率最高的达到56.53%。

表4 发酵液对土培稗草的影响

菌株发酵液对土培条件下的小稗的影响见表4，结果表明不同浓度梯度的菌株发酵液均可抑制小稗幼苗的生长，其抑制率高于40%；可用于抑制杂草生长。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一株从百香果根际土壤中筛选的具有强抑草作用真菌

<130> 3

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

<213> 上游引物 ITS1

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<211> 20

<212> DNA

<213> 下游引物 ITS4

<400> 2

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<210> 3

<211> 584

<212> DNA

<213> FJFAFU-BXG01-ITS I区

<400> 3

taggtgaacc tgcggaagga tcattaccga gtgcgggtcc tttgggccca acctcccatc 60

cgtgtctatt gtaccctgtt gcttcggcgg gcccgccgct tgtcggccgc cgggggggcg 120

cctctgcccc ccgggcccgt gcccgccgga gaccccaaca cgaacactgt ctgaaagcgt 180

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ggcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga taactaatgt gaattgcaga attcagtgaa 300

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