一株具有抑真菌作用的芽孢杆菌鉴定及其抑菌活性成分分析

摘要

植物真菌病害往往给农业生产带来重大损失，芽孢杆菌常被用作植物真菌病害防治的菌株，在植物真菌病害防治中发挥着重要作用。本课题对一株可以抑制真菌生长的芽孢杆菌NK-2展开研究，通过菌落对峙法检测其抑真菌活性，发现它对八种常见的植物病害真菌：黑曲霉(Aspergillium niger)、黄瓜灰霉(Botrytis cinerea)、小麦赤霉（Fusarium graminearum）、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、苹果轮纹病菌(Physalospora piricola)、黑根霉（Rhizopus nigricans）及棉花立枯病菌（Rhizoctonia solani）均有较好的抑制作用，表现出较广的抑菌谱。盆栽法实验表明，NK-2菌的发酵液可以有效抑制番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)的发生，经其发酵液处理后，植株发病指数为32.4，平均防效为64.1％，这也为我们开发该菌株并将其应用于田间提供了良好的依据。
　　 从分子水平上利用基因序列的差异比较推测细菌间进化关系，进而对未知细菌进行鉴定和检测，是现代细菌菌种鉴定的一种科学的方法。本研究采用16SrDNA(GenBank accession: GU064894)、gyrA(GenBank accession: GU226662)、rpoB(GenBank accession: GU226663)等基因作为分类鉴定基因，并分别利用gyrA和rpoB基因构建了分子进化树，鉴定结果表明它是一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
　　 为分离NK-2抑菌活性成分，我们对其发酵液采用经典的硫酸铵(65%)沉淀方法，经透析、超滤管(30kDa)浓缩后得到具有抑制真菌菌丝生长和孢子萌发的活性粗蛋白。随后对该粗蛋白的耐受温度、pH值耐受范围、有机溶剂耐受性、蛋白酶K耐受性等方面性质进行了初步的研究。发现该粗蛋白的温度耐受范围较广，甚至经高温、高压(121℃，0.1MPa)处理25min后，仍有大约77%的活性；对多种有机溶剂如甲醇、乙醚、丙酮等也表现出一定的耐受性，但氯仿则使蛋白活性降低大约50%;对pH的耐受范围也较广，在pH值4到12的范围，具有很高的活性；对蛋白酶K的耐受性也较强，经100μg/ml的蛋白酶K作用90min后，仍保持大约80%的活性。
　　 寻找具有广谱抗真菌活性的蛋白，克隆其基因，利用基因工程的方法培育植物抗病品种或者构建工程菌株，生产微生物农药，已成为近年来生物技术研究的一个热点。在本研究中，对从发酵液中提取的粗蛋白经葡聚糖凝胶SephadexG-200初步纯化后，将活性组分进行质谱检测。经串联质谱(MALDI-MS-MS)检测分析，目的蛋白与NCBI中解淀粉芽孢杆菌FZB42的YhfE相似性较高。据此结果，我们从NK-2菌株的基因组中克隆得到了该基因，并提交GenBank(GenBank accession：HM143898)。随后将该基因与表达载体pET-28a+)连接，转入表达宿主E．coli BL21(DE3)。经IPTG诱导表达、亲和Ni-NTA柱纯化后，得到45.02kDa的融合YhfE蛋白。经活性检测，该蛋白可以有效抑制尖孢镰刀菌孢子萌发，对菌丝的生长也有一定的抑制作用。