一种适合观察橡胶树花器官解剖结构的切片方法

摘要

一种适合观察橡胶树花器官解剖结构的切片方法，包括如下步骤：(1)将修切好的橡胶树雌花、雄花及花柄中的1种或几种材料置于固定液中，抽出空气，固定一段时间；(2)步骤(1)所得材料依次用磷酸缓冲液、磷酸缓冲液与OCT包埋剂的混合溶液、OCT包埋剂浸洗，然后使用OCT包埋剂进行冰冻切片的包埋；(3)将步骤(2)所得包埋好的材料进行切片，然后粘取切片后封片观察。本发明的方法不使用有挥发性、有毒的试剂，操作简单、快捷，而且重复性和通用性好。

说明书

技术领域

本发明属于植物组织化学技术领域，涉及一种植物组织的切片方法，尤其涉及一种适合观察橡胶树花器官解剖结构的切片方法。

背景技术

橡胶树为圆锥花序，着生于叶腋或鳞片腋，雌雄同株，同序异花；雌花着生于花枝梗顶端，通常每个花序具有雌花3-20朵，雌花基部具一绿色花盘；子房上位，花柱短或无，柱头着生于子房上，中轴胎座，通常3室，每室有一侧生胚珠；雄花较雌花小，数量多，无绿色花盘无花瓣，花萼基部合生，花萼5齿裂或5深裂，米黄色，雄蕊5-10枚，两轮排列与合生额花丝柱上，药室中有大量花粉。橡胶树实生树5-6龄开花，芽接树3-4龄开花；一般每年开花两次，3-4月为春花，5-6月为夏花，春花为主花期。橡胶树的雌花花期10-25天，雄花花期12-27天，受到气候和光照等因素影响而有所不同。

目前，橡胶树的花器官结构已了解的很清楚，但是橡胶树花的解剖结构却研究甚少。目前观察橡胶树花器官解剖结构仍使用观察橡胶树乳管的方法，是基于史自强和胡正海报道的方法(Shi ZQ,Hu ZH,A histological method for rubber-bearing tissues ofplants,《ActBot Sin》,1965,13,179-182)，其关键环节是用碘和溴的冰醋酸溶液处理含胶组织，经石蜡切片，在光学显微镜下观察。郝秉中等人将该方法应用于显示橡胶树树皮中的乳管时，对几个环节进行了改进(Hao B Z,Wu J L,Biology of laticifers in Hevea andlatex production,《Chinese J Trop Crops》,2004,25(4):1-7)，具体包括：1)固定液用80％的乙醇代替FAA固定液，目的是溶解单宁类物质，避免将染色呈红褐色的单宁薄壁细胞误认为棕褐色的乳管细胞；2)含胶组织置于碘和溴的冰醋酸溶液中，在60-65℃条件下处理36-48小时，可以加深橡胶颜色，容易分辨乳管细胞；还可以软化组织，便于顺利切片；3)在组织透明环节，使用毒性较小的正丁醇或叔丁醇代替毒性较大的二甲苯。

但是，上述石蜡切片的方法存在三个主要缺点：1)步骤繁多，费时，容易弄错标签，切片质量不容易重复：该方法的操作流程有40多个步骤，从材料固定到切片观察需要7-10天，而且在材料比较多的时候，容易弄错标签；此外，由于步骤多，如果操作不熟练，切片质量不容易重复；2)对于像花粉粒、淀粉粒等暴露在外的微小颗粒，由于需要置换溶液或更换容器，且这些步骤繁多，容易导致这些微小颗粒被洗掉，导致切片上无法观察到；3)由于植物组织要经过碘和溴的冰醋酸溶液进行染色处理，此步骤对植物组织的软化和腐蚀性很强，花器官容易被腐蚀和溶解掉，很难观察到完整结构；4)使用的挥发性有毒的试剂较多：除酒精外，还需要腐蚀性的溴和冰醋酸、具有一定毒性的正丁醇和二甲苯。此外，多个步骤在高温下操作，存在安全隐患。

针对上述多种缺陷，迫切需要建立一种快捷而安全，适合观察橡胶树花器官解剖结构的切片方法。

发明内容

为此，本发明目的是提供一种适合观察橡胶树花器官解剖结构的切片方法。本发明的方法不使用挥发性有毒的试剂，操作简单、快捷，而且重复性和通用性好。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种适合观察橡胶树花器官解剖结构的切片方法，包括如下步骤：

(1)将修切好的橡胶树雌花、雄花及花柄中1种或几种材料置于固定液中，抽出空气，固定一段时间；抽出空气可以使用真空泵进行，使得花内部的气体排出，从而加速溶液的浸入和置换速度；修切例如将花器官切出合适的小口；

(2)步骤(1)所得材料依次用磷酸缓冲液、磷酸缓冲液与OCT包埋剂的混合溶液、OCT包埋剂浸洗，完成材料从缓冲液到OCT包埋剂中的过渡，然后使用OCT包埋剂进行冰冻切片的包埋；

(3)将步骤(2)所得包埋好的材料进行切片，然后粘取切片后封片观察。

橡胶树花器官不能用橡胶树的常规方法来做石蜡切片的，容易被碘溴软化溶解掉，所以目前仍没有做橡胶树花器官切片的文献。而传统的冰冻切片方法来观察橡胶树花器官的冰冻切片效果又很差，主要是因为未开放的雄花花蕾和已发育的子房是封闭的，内部有空隙，存在空气的，不经过修切处理，直接进行固定，固定液很难浸入，组织不能很好固定和置换溶液，导致切片效果差。本发明中将未开放的雄花花蕾和已发育的子房侧面修切一个小口，花柄上下端平行修切，可通过抽真空的方法，使得内部的气体排出，从而加速溶液的浸入和置换速度，该方法观察到的组织解剖结构完整、清晰，观察效果好很多。

作为优选，步骤1)中对于含有已发育的子房的雌花，所述修切为在子房一侧切除0.1-0.3cm×0.1-0.3cm，优选为0.2cm×0.2cm的表皮，形成一个开口，可以加速气体排出、固定液渗透和溶液置换，且可以制造一个平面利于包埋时保持水平；

对于未开放的雄花花蕾，所述修切为在花萼一侧隆起处修切一个0.1-0.3cm×0.1-0.3cm，优选为0.2cm×0.2cm的小口，开口可以加速气体排出、固定液渗透和溶液置换，且可以制造一个平面利于包埋时保持水平；

对于开放的雄花，所述修切为切除一个展开的花萼，可以制造一个平面利于包埋时保持水平；

对于花柄，所述修切为在子房以下切长度为0.3-0.8cm，优选为0.5cm的一段花柄。

将上述材料小心地分别置于固定液中，勿剧烈震荡，防止花的内部器官及花粉粒被洗掉。

修切时可使用单面刀片进行。

作为优选，步骤(1)中所述固定液为包含多聚甲醛和戊二醛的磷酸缓冲溶液。

优选地，所述多聚甲醛的质量浓度为2-6％，优选为4％，所述戊二醛的浓度为1-5％，优选为2.5％。

优选地，磷酸缓冲溶液的pH为6-8，优选为7.2。

在一个具体实施方式中，所述固定液是4wt％多聚甲醛和2.5wt％戊二醛的0.01M的pH 7.2磷酸缓冲液。

步骤(1)排出空气可通过如下过程实现：将装有固定液的容器放入连接真空装置的容器中，抽气0.5min以上，优选为1-2min。可在排出空气后，开始固定之前更换新鲜的固定液。

作为优选，步骤(1)中固定的时间为1h以上，优选为2-4h。固定可优选在室温下进行。

作为优选，步骤(2)中磷酸缓冲液的浓度为0.005-0.02M，优选为0.01M，pH为6-8，优选为7.2。使用磷酸缓冲液浸泡用于去除样品中的多聚甲醛和戊二醛。

OCT包埋剂是一种聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物，目前已广泛用于免疫组化实验室中，其用途是在冰冻切片时支撑组织，以增加组织的连续性，减少皱折及碎裂。又因OCT混合物为水溶性，故在漂片时可溶于水，所以在以后的染色中不会增加背景染色。利用OCT混合物预先浸润组织，然后再进行恒冷箱切片，可使切片质量得到改善。为了更好地改善切片质量，本发明所用OCT包埋剂为商品化产品，可商购获得。

优选地，磷酸缓冲液和OCT包埋剂的混合溶液中磷酸缓冲液和OCT包埋剂的体积比为1:0.5-2，优选为1:1。混合溶液用于磷酸缓冲液和OCT包埋剂间的过渡。

优选地，用磷酸缓冲液浸洗的时间为10min以上，优选为15-20min，以去除样品中的多聚甲醛和戊二醛，由于固定液也是磷酸缓冲液，因此此处用磷酸缓冲液更方便洗涤，不用再换溶液，且磷酸缓冲液接近于植物组织本身的pH值和内部盐浓度，对植物本身不造成太大损害，用磷酸缓冲液和OCT包埋剂的混合溶液浸洗的时间为20min以上，优选为30min，用于磷酸缓冲液和OCT包埋剂间的过渡，用OCT包埋剂浸洗的时间为40min以上，优选为60min，用于OCT包埋剂浸入到花器官组织内。上述先缓冲液洗，再磷酸缓冲液和OCT包埋剂洗，然后OCT包埋剂浸洗这种浸洗方式可防止替换溶液变化太快，组织发生皱缩或者膨胀。

在一个具体实施方式中，步骤3)中先用0.01M的pH 7.2磷酸缓冲液，浸洗时间15-20min，用于去除样品中的多聚甲醛和戊二醛；再用二分之一的0.01M的pH 7.2磷酸缓冲液和二分之一的OCT包埋剂的混合溶液，浸洗时间30min，用于磷酸缓冲液和OCT包埋剂间的过渡；最后用OCT包埋剂，浸洗时间60min，用于OCT包埋剂浸没到花器官组织内。

优选地，冰冻切片的包埋时冷冻台温度为-18至-22℃；包埋的时间为15-30min。

作为优选，步骤(3)中封片使用5-20wt％，优选为10wt％的甘油水溶液。

切片可按常规冰冻切片方法进行；粘取切片可用室温的普通载玻片进行。

作为优选，本发明所述的切片方法包括如下步骤：

1)将修切好的橡胶树雌花、雄花及花柄中1种或2种的组合置于盛有固定液的离心管中；

2)打开离心管盖子，放入连接真空泵的玻璃干燥器中，抽气1-2min；

3)换新鲜的固定液，在室温条件下固定2-4h后，用缓冲液浸洗3次，第一次15min，第二次30min；第二次60min；

4)将步骤3)中的材料从缓冲液过渡到OCT包埋剂中；

5)将步骤4)中OCT包埋剂中的材料，用OCT包埋剂中补充并包埋于包埋盒内，置于-20℃冷冻台，冷凝20min；

6)取出步骤5)中的材料，按常规冰冻切片方法进行切片；

7)用室温的普通载玻片粘取切片；

8)用封片剂封片，光学显微镜观察。

所述离心管可为普通带盖子的塑料或玻璃离心管；离心管规格可以是1.5-10mL的试管。有利地，所述固定液的体积为离心管规格的二分之一至三分之二。在一个具体实施方式中，离心管规格是5mL的离心管；所述固定液的体积为3mL。

与现有技术相比，本发明具有下列有益的技术效果：

(1)操作简单，节省时间。最多两天完成实验流程，时间主要花在固定和切片这两个环节。由于环节少，操作简单，切片的质量重复性好，而且不容易弄错标签。

(2)操作步骤少，避免了在置换溶液过程中花内部器官损坏和花粉粒被洗掉，而无法观察到。

(3)在整个方法中不使用挥发性有毒的试剂，同时所有步骤在室温和低温下操作，不存在安全隐患。

(4)具有取材方便、省工省地、重复性和通用性好以及批量筛选的优点。

附图说明

图1是固定前处理橡胶树雌花示意图；

图2是固定前处理橡胶树未开放的雄花示意图；

图3是橡胶树无性系CATAS 7-33-97的9龄开割树雌花，在5倍物镜明场条件下的纵切面图，其中1为花萼，2为柱头，3为胚珠，4为子房壁，5为胎座，6为花萼基部，7为花柄；星号示花萼离层，白色箭头示初生乳管，黑色箭头示表皮毛等；标尺：200μm，切片厚度：14μm，物镜倍数为5倍；

图4是橡胶树无性系CATAS 7-33-97的9龄开割树未开放的雄花，在5倍物镜明场条件下的纵切面图，其中1为花萼，2为合生的花丝，3为花药，4为花粉粒，5为已脱落的花药，6为花萼基部，7为花柄；白色箭头示初生乳管，黑色箭头示表皮毛等；标尺：100μm，切片厚度：14μm，物镜倍数为5倍；

图5是橡胶树无性系CATAS 7-33-97的9龄开割树已开放的雄花，在5倍物镜明场条件下的纵切面图，其中1为花萼，2为合生的花丝，3为花药，4为花粉粒，5为已脱落的花药，6为花萼基部，7为花柄；白色箭头示初生乳管，黑色箭头示表皮毛等；标尺：200μm，切片厚度：12μm，物镜倍数为5倍；

图6是橡胶树无性系CATAS 7-33-97的9龄开割树雌花花柄，在5倍物镜明场条件下的横切面图，其中1为表皮，2为皮层，3为纤维层，4为韧皮部，5为形成层，6为木质部，7为髓；白色箭头示初生乳管；标尺：100μm，切片厚度：12μm，物镜倍数为5倍。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1、橡胶树雌花、雄花及花柄的解剖结构观察

本实施例，采用橡胶树品种CATAS 7-33-97的9龄开割树的春花，进行花器官解剖结构观察。

实验条件：在4月，采集橡胶树无性系品种CATAS 7-33-97的9龄开割树枝端的花序，分别采集雌花、雄花和花柄等材料。修切方法如下：

1)雌花：摘取花序最顶端的，且子房开始发育的雌花，用单面刀片切除花柄，并在膨大的子房一侧切除0.2cm×0.2cm的表皮，形成一个小口，如图1所示，虚线示修切雌花子房的部位；

2)未开放的雄花：摘取成熟且未开放的雄花，用单面刀片切除花柄，在雄花一侧的花萼上切出0.2cm×0.2cm的小口，如图2所示，虚线示修切雄花花萼的部位；

3)已开放的雄花：摘取开放且未凋零的雄花，用单面刀片切除花柄后，不做任何处理：

4)花柄：摘取膨大的子房的雌花，用单面刀片在花萼合生以下，上下端平行修切长度为0.5cm的一段花柄。

将上述材料分别置于盛有3ml的4wt％多聚甲醛和2.5wt％戊二醛的0.01M磷酸缓冲液(pH 7.2)固定液中，抽气2min，换新的固定液，在室温条件下固定3h。分别用三种缓冲液各浸洗一次，第一次为0.01M的pH 7.2磷酸缓冲液，浸洗时间15min；第二次为二分之一的0.01M的pH 7.2磷酸缓冲液和二分之一的OCT包埋剂的混合溶液，浸洗时间30min；第三次为OCT包埋剂，浸洗时间60min。浸洗好的花器官材料，使用OCT包埋剂进行冰冻切片的包埋，冷凝时间为15-30min；使用常规的冰冻切片技术进行切片，冷冻台温度为-18至-22℃；切片厚度12-14μm，常温载玻片贴片，10wt％甘油水溶液封片；在光学显微镜的下观察结果。

结果表明：在显微镜的明场下观察结果如下：

1)橡胶树雌花的结构很完整，包含表皮毛、柱头及短花柱、已发育的子房、果皮、种子及其内部的胚、胎座、基部合生的花萼、花柄等结构，还可以见到深色条状的乳管和将要断开的花萼离层；切片的清晰度和完整性都很好，如图3所示；

2)未开放雄花的结构很完整，呈卵状披针形，包含表皮毛、基部合生的花萼、数枚雄蕊呈两轮排列并合生成花丝柱，花药室中有大量花粉，切片的清晰度和完整性都很好，如图4所示；

3)已开放的雄花的结构较完整，包含花萼、着生于花丝柱上的花药和掉落的花药，可见少量游离的花粉，以及即将枯萎的花柄等结构，切片的清晰度和完整性都较好，如图5所示；

4)花柄：对雌花的花柄进行横切，可见完整而清晰的组织结构，包括表皮、皮层、纤维层、韧皮部、初生乳管、形成层、木质部和髓等结构，切片的清晰度和完整性都很好，如图6所示。

实施例2

与实施例1相同，除了以下不同：雌花切口为0.1cm×0.1cm，未开放的雄花切口为0.1cm×0.3cm，花柄切长度为0.3cm和0.8cm各一截。

实施例3

与实施例1相同，除了以下不同：固定液是2wt％多聚甲醛和5wt％戊二醛的0.01M的pH 7.2磷酸缓冲液；浸洗过程为第一次为0.005M的pH 7.8磷酸缓冲液，浸洗时间10min；第二次为三分之二的0.005M的pH 7.8磷酸缓冲液和三分之一的OCT包埋剂的混合溶液，浸洗时间20min；第三次为OCT包埋剂，浸洗时间40min。

实施例4

与实施例1相同，除了以下不同：固定液是6wt％多聚甲醛和1wt％戊二醛的0.01M的pH 7.2磷酸缓冲液；浸洗过程为第一次为0.02M的pH 6磷酸缓冲液，浸洗时间15min；第二次为三分之一的0.02M的pH 6磷酸缓冲液和三分之二的OCT包埋剂的混合溶液，浸洗时间30min；第三次为OCT包埋剂，浸洗时间60min。

实施例2-4观察到的组织解剖结构完整性、清晰性均与实施例1观察到的相当。

综合以上实验结果，对橡胶树多种花器官的观察，证明使用本切片方法能够完整而清晰地显示橡胶树花器官的组织解剖结构，利用本发明所提供的切片方法，很容易观察到橡胶树花器官解剖结构，而且重复性好。可见本发明所提供的切片方法能够快速而有效的对橡胶花器官解剖结构进行显示，具有广阔的应用前景。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围之内。