一种硫化铜/二氧化硅双重减弱硫化镉/碳掺杂二氧化钛胰岛素光电化学传感器的制备方法

摘要

本发明属于纳米功能材料、免疫分析及生物传感技术领域。提供一种硫化铜/二氧化硅双重减弱硫化镉/碳掺杂二氧化钛胰岛素光电化学传感器的制备方法。该方法具体采用二氧化硅的空间位阻效应以及硫化铜对电子供体抗坏血酸的竞争消耗和对激发光源的竞争吸收效应，双重减弱基底硫化镉/碳掺杂二氧化钛敏化结构产生的光电流信号，实现对胰岛素的高灵敏检测。该方法具有制备简单、成本低、检测快速、灵敏度高、易于微型化的优点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种硫化铜/二氧化硅双重减弱硫化镉/碳掺杂二氧化钛胰岛素光电化学传感器的制备方法。具体是采用硫化铜/二氧化硅纳米复合材料，双重减弱硫化镉敏化碳掺杂的二氧化钛的光电流信号，制备一种高灵敏检测胰岛素的光电化学传感器，属于新型功能材料与生物传感技术检测领域。

背景技术

胰岛素是一种多肽类激素，对于体内碳水化合物和血糖含量水平具有重要的调节作用，是机体内唯一降低降低血糖的激素。人体内胰岛素分泌不足或机体对其利用有障碍，将引发起糖尿病的发生。随着糖尿病发病率的逐年升高，建立一种简便快捷、高灵敏检测血液中胰岛素的含量的方法，对糖尿病的早期诊断和及时治疗具有重要意义。

目前，胰岛素的检测方法主要有化学发光免疫分析法、荧光光谱法、质谱分析法和放射免疫法等。化学发光免疫分析法和放射免疫分析法检测周期长，操作步骤繁琐，仪器设备要求高，不适合现场快速检测。采用荧光和质谱法制备方法简单，灵敏度高，但同样存在着仪器昂贵，难以应用于现场即时检测的缺点。

光电化学免疫传感是将免疫化学反应与光电化学电极相结合的一种较为新颖的生物传感技术，兼具光化学和电化学的优势。同时，在光电化学检测中，光作为激发源激发光电活性物质，电信号则作为检测信号。由于光电化学过程的激发信号和检测信号分属于不同的能量形式，其传感信号的背景将低于传统的电化学方法，具有更高的检测灵敏度。此外，光电化学传感器具有简单、实验成本低的特点。基于上述优势，光电化学分析法近几年被越来越多的研究者所关注。在最优条件下，该方法分析物的浓度变化会直接影响光电流的变化，因此可通过检测光电流的变化实现对目标分析物的定量检测。因此本发明提供了一种基于硫化铜/二氧化硅纳米复合材料双重减弱硫化镉/碳掺杂二氧化钛敏化结构的胰岛素光电化学传感器的制备方法。

目前，根据光电流的变化，传感器大致分为两类：信号增强型和信号减弱型。由于免疫传感器生物分子自身的位阻效应，使得信号增强型传感器的检测灵敏度普遍不高。而对于信号减弱型光电化学传感器，往往都是通过单一的位阻效应、酶反应产生或消耗电子供体以及能量共振转移效应等方法使得光电流信号减小。有文献（Anal. Chem. 2016, 88, 3392-3399）报道采用硫化铜作为二抗标记物，实现了对癌胚抗原的高灵敏检测。相比于一种减弱光电流的方法，结合两种减弱光电流的方法会对传感器的灵敏度有一定程度的提高，然而，目前该类光电化学传感器的制备方法鲜有报道。

鉴于此，本发明采用ITO导电玻璃电极，结合光电化学技术和夹心型信号放大免疫分析方法，制备了一种硫化镉敏化碳掺杂二氧化钛作为光电活性基底材料，硫化铜/二氧化硅纳米复合材料作为二抗标记物载体的夹心型免疫传感器用于对胰岛素的高灵敏检测。二氧化钛因其具有无毒、化学性质稳定等优点在光催化领域得到了广泛应用。但是，单一的二氧化钛纳米材料对光的吸收有限，且光生电子空穴对极易复合，限制了其在光电化学传感领域的应用。因此，对于二氧化钛进行掺杂改性和复合，是提高光电活性的有效方法。本发明通过碳的掺杂以及硫化镉量子点的敏化，有效的抑制其电子空穴对的复合，光电流信号得到增强。以此作为光电活性基底材料，提高了传感器的检测灵敏度。所制备的硫化铜/二氧化硅纳米复合材料，利用二氧化硅不导电的性质，增加修饰电极的空间位阻，阻碍电子转移和电子供体的扩散，使得光电流降低。同时，p型半导体硫化铜能够与基底材料竞争消耗电解质中的电子供体抗坏血酸和吸收光能，致使传感器光电流信号进一步减弱。此外，由于二氧化硅制备方法简单，形貌及粒径易控，生物相容性好，并且表面易于修饰，能够固定大量检测抗体和硫化铜，利于提高传感器的重现性和检测灵敏度。目前国内外还没有公开任何关于硫化铜/二氧化硅纳米复合材料双重减弱光电流信号的策略用于检测胰岛素的夹心型光电化学免疫传感器的相关报道。该传感器的制备方法具有成本低、操作简单、特异性强、检测快速等特点。

发明内容

本发明的目的之一是制备硫化铜/二氧化硅纳米复合材料，双重减弱基底材料光电流信号，硫化铜能够与基底材料竞争消耗电解质中的电子供体抗坏血酸和竞争吸收光能，造成基底光敏材料的电子空穴易于复合和对光的利用率降低，使得光电流降低，同时利用二氧化硅不导电的性质，增大空间位阻，进一步减小光电流信号，较已报道的信号减弱型传感器所采用的单一光电流减小策略，本发明对传感器的灵敏度有很大程度的提高。

本发明的目的之二是构建信号双重减弱型的光电化学传感器，避免信号增强型传感器由于生物分子自身的位阻效应导致传感器的检测灵敏度不高的缺点。

本发明的目的之三是利用氨基化二氧化硅生物相容性好及易于功能化的优点，能够负载大量的硫化铜纳米粒子及检测抗体，且二氧化硅易于合成，粒径均匀，可提高传感器的检测准确度和重现性。

本发明的目的之四是对二氧化钛进行碳的掺杂，对比同等条件下合成的二氧化钛，碳掺杂二氧化钛具有更好的光电流响应；同时通过硫化镉的敏化，光电流强度进一步增强，拓宽了传感器的检测范围。

本发明的目的之五是避免传统检测方法的仪器设备复杂、操作过程繁琐、检测人员要求高、检测成本高等缺点，提供一种基于硫化镉/碳掺杂二氧化钛作为基底材料，硫化铜/二氧化硅纳米复合材料作为检测抗体标记物的简单、快速、灵敏度和准确性高的光电化学免疫传感器的制备方法，实现对胰岛素的快速高灵敏检测。

本发明的技术方案如下：

1. 一种硫化铜/二氧化硅双重减弱硫化镉/碳掺杂二氧化钛胰岛素光电化学传感器的制备方法

（1）碳掺杂二氧化钛纳米颗粒的制备

0.5 ~ 2 mL钛酸四正丁酯溶于40 mL乙二醇，逐滴加入40 mL超纯水中，磁力搅拌30 min，于180 ℃水热反应6 ~ 24 h，降至室温，乙醇、水各洗3次，真空60 ℃干燥12 h；

（2）硫化镉量子点的制备

250 µL巯基乙酸加入50 mL、0.005 ~ 0.02 mol/L的氯化镉溶液，100 ~ 120 ℃于氮气氛围下鼓泡30 min，保持pH = 10 ~ 12，再将5.5 mL浓度为0.1 moL/L的硫化钠加入，氮气氛围下回流3 ~ 5 h即可；

（3）光电化学传感器的制备

1）将0.8 × 1.5 cm的ITO电极，依次用30 mL的丙酮、超纯水、乙醇超声清洗30 min，高纯氮气吹干；

2）在ITO电极上修饰6 µL、2 ~ 8 mg/mL的碳掺杂二氧化钛溶液，将修饰好的ITO电极在400 ~ 500 ℃煅烧30 min；

3）在修饰好的ITO电极表面滴加6 μL、2 ~ 8 mg/mL的硫化镉溶液，室温下自然干燥；

4）滴加6 μL、10 ~ 20 mg/mL的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二甲胺盐酸盐EDC和5 ~ 10 mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺NHS混合溶液，室温下活化1 h；

5）滴加 6 μL、5 ~ 20 μg/mL胰岛素捕获抗体至ITO电极表面，磷酸缓冲溶液PBS冲洗，4 ℃冰箱中晾干；

6）滴加3 µL、质量分数为0.5 ~ 3%的牛血清白蛋白BSA溶液，PBS冲洗；

7）滴加6 µL、浓度为0.005 ~ 50 ng/mL的胰岛素抗原溶液，PBS冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

8）继续滴加6 µL、2 ~ 8 mg/mL的硫化铜/二氧化硅纳米复合材料标记的胰岛素抗体溶液于ITO修饰电极表面，室温孵化50 min，PBS清洗，制得胰岛素夹心型光电化学免疫传感器，于4 ℃冰箱中储存备用。

2. 硫化铜/二氧化硅纳米复合材料标记的胰岛素检测抗体溶液的制备

（1）氨基化二氧化硅的制备

1）将50 ~ 100 mL的无水乙醇与3 mL超纯水混合形成匀液，加入5 ~ 10 mL硅酸四乙酯，以2 mL/min的进样速度加入10 ~ 30 mL的质量分数为25%的氨水，于30 ~ 50 ℃下搅拌3 ~ 5 h，离心分离，用无水乙醇和超纯水洗至中性，60 ℃真空干燥12 h，制得二氧化硅；

2）将1 ~ 3 mL氨丙基三乙氧基硅烷和1 g二氧化硅加入200 mL无水甲苯中，超声30 min，于80 ~ 100 ℃搅拌24 h，离心分离，乙醇洗涤3次，60 ℃真空干燥，制得氨基功能化二氧化硅；

（2）硫化铜的制备

将30 ~ 50 mg氯化铜和35 ~ 45 mg的柠檬酸钠溶于180 mL超纯水，加入20 mL浓度为1 ~ 3 mg/mL的硫化钠溶液，于室温下搅拌5 min，80 ~ 100 ℃继续搅拌15 min，移至冰水中，所得溶液于4 ℃储存备用；

（3）硫化铜/二氧化硅纳米复合材料的制备

将10 mg氨基化二氧化硅加入到30 mL硫化铜溶液中，搅拌 1 ~ 3 h，离心分离，真空干燥12 h，得到硫化铜/二氧化硅纳米复合材料；

（4）硫化铜/二氧化硅纳米复合材料标记的胰岛素检测抗体溶液的制备

将0.5 mL、100 μg/mL胰岛素检测抗体加入0.5 mL、1 ~ 10 mg/mL的EDC和0.5 ~ 2 mg/mL的NHS混合液，震荡30 min，加入5 mg硫化铜/二氧化硅纳米复合材料，于4 ℃孵化12 h，加入50 ~ 200 μL的质量分数为1%的BSA孵化1 h，离心分离，PBS洗涤，分散在2 mL的浓度为10 mM的PBS中，即制得硫化铜/二氧化硅纳米复合材料标记的胰岛素检测抗体溶液。

3. 胰岛素的检测

（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的胰岛素光电化学传感器为工作电极，在含有10 mL、0.1 mol/L的抗坏血酸的pH 7.4的PBS缓冲溶液中进行测试；

（2）用时间-电流法对胰岛素溶液进行检测，输入电压为0 V记录电流变化，绘制工作曲线；

（3）将待测样品溶液代替胰岛素溶液进行检测，按照工作曲线的绘制方法进行测定。

本发明的有益成果

（1）本发明制备的硫化铜/二氧化硅纳米复合材料，双重减弱基底材料光电流信号，利用二氧化硅不导电的性质，增大空间位阻，同时硫化铜能够与基底材料竞争结合电解质中的电子供体抗坏血酸，进一步减小光电流信号，提高传感器的检测灵敏度。

（2）本发明氨基化二氧化硅制备方法简单，形貌及粒径易控，生物相容性好，并且表面易于修饰，能够固定大量硫化铜和检测抗体，利于保证传感器的重现性和提高检测灵敏度，从而实现对胰岛素的高灵敏检测。

（3）本发明对二氧化钛进行碳的掺杂，对比同等条件下合成的二氧化钛，碳掺杂二氧化钛具有更好的光电流响应；同时通过硫化镉的敏化，光电流强度进一步增强。

（4）本发明制备的用于检测胰岛素的夹心型光电化学免疫传感器兼具免疫分析的高选择性和光电化学技术的高灵敏度，具有选择性好、灵敏度高、操作简单、分析快速及易于操作等优点，可以实现对超低浓度胰岛素的定量检测，具有良好的应用前景。

具体实施方式

实施例1 一种硫化铜/二氧化硅双重减弱硫化镉/碳掺杂二氧化钛胰岛素光电化学传感器的制备方法

（1）碳掺杂二氧化钛纳米颗粒的制备

0.5mL钛酸四正丁酯溶于40 mL乙二醇，逐滴加入40 mL超纯水中，磁力搅拌30 min，于180 ℃水热反应6 h，降至室温，乙醇、水各洗3次，真空60 ℃干燥12 h；

（2）硫化镉量子点的制备

250 µL巯基乙酸加入50 mL、0.005 mol/L的氯化镉溶液，100 ℃于氮气氛围下鼓泡30 min，保持pH = 10，再将5.5 mL浓度为0.1 moL/L的硫化钠加入，氮气氛围下回流3 h即可；

（3）光电化学传感器的制备

1）将0.8 × 1.5 cm的ITO电极，依次用30 mL的丙酮、超纯水、乙醇超声清洗30 min，高纯氮气吹干；

2）在ITO电极上修饰6 µL、2 mg/mL的碳掺杂二氧化钛溶液，将修饰好的ITO电极在400 ℃煅烧30 min；

3）在修饰好的ITO电极表面滴加6 μL、2 mg/mL的硫化镉溶液，室温下自然干燥；

4）滴加6 μL、10 mg/mL的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二甲胺盐酸盐EDC和5 mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺NHS混合溶液，室温下活化1 h；

5）滴加 6 μL、5 μg/mL胰岛素捕获抗体至ITO电极表面，磷酸缓冲溶液PBS冲洗，4 ℃冰箱中晾干；

6）滴加3 µL、质量分数为0.5 %的牛血清白蛋白BSA溶液，PBS冲洗；

7）滴加6 µL、浓度为0.005 ng/mL的胰岛素抗原溶液，PBS冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

8）继续滴加6 µL、2 mg/mL的硫化铜/二氧化硅纳米复合材料标记的胰岛素抗体溶液于ITO修饰电极表面，室温孵化50 min，PBS清洗，制得胰岛素夹心型光电化学免疫传感器，于4 ℃冰箱中储存备用。

实施例2 一种硫化铜/二氧化硅双重减弱硫化镉/碳掺杂二氧化钛胰岛素光电化学传感器的制备方法

（1）碳掺杂二氧化钛纳米颗粒的制备

1 mL钛酸四正丁酯溶于40 mL乙二醇，逐滴加入40 mL超纯水中，磁力搅拌30 min，于180 ℃水热反应12 h，降至室温，乙醇、水各洗3次，真空60 ℃干燥12 h；

（2）硫化镉量子点的制备

250 µL巯基乙酸加入50 mL、0.01 mol/L的氯化镉溶液，110 ℃于氮气氛围下鼓泡30 min，保持pH = 11，再将5.5 mL浓度为0.1 moL/L的硫化钠加入，氮气氛围下回流4 h即可；

（3）光电化学传感器的制备

1）将0.8 × 1.5 cm的ITO电极，依次用30 mL的丙酮、超纯水、乙醇超声清洗30 min，高纯氮气吹干；

2）在ITO电极上修饰6 µL、5 mg/mL的碳掺杂二氧化钛溶液，将修饰好的ITO电极在450 ℃煅烧30 min；

3）在修饰好的ITO电极表面滴加6 μL、5 mg/mL的硫化镉溶液，室温下自然干燥；

4）滴加6 μL、15 mg/mL的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二甲胺盐酸盐EDC和8 mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺NHS混合溶液，室温下活化1 h；

5）滴加 6 μL、10 μg/mL胰岛素捕获抗体至ITO电极表面，磷酸缓冲溶液PBS冲洗，4 ℃冰箱中晾干；

6）滴加3 µL、质量分数为1%的牛血清白蛋白BSA溶液，PBS冲洗；

7）滴加6 µL、浓度为0.005 ~ 50 ng/mL的胰岛素抗原溶液，PBS冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

8）继续滴加6 µL、5 mg/mL的硫化铜/二氧化硅纳米复合材料标记的胰岛素抗体溶液于ITO修饰电极表面，室温孵化50 min，PBS清洗，制得胰岛素夹心型光电化学免疫传感器，于4 ℃冰箱中储存备用。

实施例3 一种硫化铜/二氧化硅双重减弱硫化镉/碳掺杂二氧化钛胰岛素光电化学传感器的制备方法

（1）碳掺杂二氧化钛纳米颗粒的制备

2 mL钛酸四正丁酯溶于40 mL乙二醇，逐滴加入40 mL超纯水中，磁力搅拌30 min，于180 ℃水热反应24 h，降至室温，乙醇、水各洗3次，真空60 ℃干燥12 h；

（2）硫化镉量子点的制备

250 µL巯基乙酸加入50 mL、0.02 mol/L的氯化镉溶液，120 ℃于氮气氛围下鼓泡30 min，保持pH = 12，再将5.5 mL浓度为0.1 moL/L的硫化钠加入，氮气氛围下回流5 h即可；

（3）光电化学传感器的制备

1）将0.8 × 1.5 cm的ITO电极，依次用30 mL的丙酮、超纯水、乙醇超声清洗30 min，高纯氮气吹干；

2）在ITO电极上修饰6 µL、8 mg/mL的碳掺杂二氧化钛溶液，将修饰好的ITO电极在500 ℃煅烧30 min；

3）在修饰好的ITO电极表面滴加6 μL、8 mg/mL的硫化镉溶液，室温下自然干燥；

4）滴加6 μL、20 mg/mL的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二甲胺盐酸盐EDC和10 mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺NHS混合溶液，室温下活化1 h；

5）滴加 6 μL、20 μg/mL胰岛素捕获抗体至ITO电极表面，磷酸缓冲溶液PBS冲洗，4 ℃冰箱中晾干；

6）滴加3 µL、质量分数为3%的牛血清白蛋白BSA溶液，PBS冲洗；

7）滴加6 µL、浓度为50 ng/mL的胰岛素抗原溶液，PBS冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

8）继续滴加6 µL、8 mg/mL的硫化铜/二氧化硅纳米复合材料标记的胰岛素抗体溶液于ITO修饰电极表面，室温孵化50 min，PBS清洗，制得胰岛素夹心型光电化学免疫传感器，于4 ℃冰箱中储存备用。

实施例4硫化铜/二氧化硅纳米复合材料标记的胰岛素检测抗体溶液的制备

（1）氨基化二氧化硅的制备

1）将50 mL的无水乙醇与3 mL超纯水混合形成匀液，加入5 mL硅酸四乙酯，以2 mL/min的进样速度加入10 mL的质量分数为25%的氨水，于30 ℃下搅拌3 h，离心分离，用无水乙醇和超纯水洗至中性，60 ℃真空干燥12 h，制得二氧化硅；

2）将1 mL氨丙基三乙氧基硅烷和1 g二氧化硅加入200 mL无水甲苯中，超声30 min，于80 ℃搅拌24 h，离心分离，乙醇洗涤3次，60 ℃真空干燥，制得氨基功能化二氧化硅；

（2）硫化铜的制备

将30 mg氯化铜和35 mg的柠檬酸钠溶于180 mL超纯水，加入20 mL浓度为1 mg/mL的硫化钠溶液，于室温下搅拌5 min，80 ℃继续搅拌15 min，移至冰水中，所得溶液于4 ℃储存备用；

（3）硫化铜/二氧化硅纳米复合材料的制备

将10 mg氨基化二氧化硅加入到30 mL硫化铜溶液中，搅拌 1 h，离心分离，真空干燥12 h，得到硫化铜/二氧化硅纳米复合材料；

（4）硫化铜/二氧化硅纳米复合材料标记的胰岛素检测抗体溶液的制备

将0.5 mL、100 μg/mL胰岛素检测抗体加入0.5 mL、1 mg/mL的EDC和0.5mg/mL的NHS混合液，震荡30 min，加入5 mg硫化铜/二氧化硅纳米复合材料，于4 ℃孵化12 h，加入50 μL的质量分数为1%的BSA孵化1 h，离心分离，PBS洗涤，分散在2 mL的浓度为10 mM的PBS中，即制得硫化铜/二氧化硅纳米复合材料标记的胰岛素检测抗体溶液。

实施例5 硫化铜/二氧化硅纳米复合材料标记的胰岛素检测抗体溶液的制备

（1）氨基化二氧化硅的制备

1）将75 mL的无水乙醇与3 mL超纯水混合形成匀液，加入8 mL硅酸四乙酯，以2 mL/min的进样速度加入20 mL的质量分数为25%的氨水，于40 ℃下搅拌4 h，离心分离，用无水乙醇和超纯水洗至中性，60 ℃真空干燥12 h，制得二氧化硅；

2）将2 mL氨丙基三乙氧基硅烷和1 g二氧化硅加入200 mL无水甲苯中，超声30 min，于90 ℃搅拌24 h，离心分离，乙醇洗涤3次，60 ℃真空干燥，制得氨基功能化二氧化硅；

（2）硫化铜的制备

将40 mg氯化铜和40 mg的柠檬酸钠溶于180 mL超纯水，加入20 mL浓度为2 mg/mL的硫化钠溶液，于室温下搅拌5 min，90 ℃继续搅拌15 min，移至冰水中，所得溶液于4 ℃储存备用；

（3）硫化铜/二氧化硅纳米复合材料的制备

将10 mg氨基化二氧化硅加入到30 mL硫化铜溶液中，搅拌 2 h，离心分离，真空干燥12 h，得到硫化铜/二氧化硅纳米复合材料；

（4）硫化铜/二氧化硅纳米复合材料标记的胰岛素检测抗体溶液的制备

将0.5 mL、100 μg/mL胰岛素检测抗体加入0.5 mL、5 mg/mL的EDC和1 mg/mL的NHS混合液，震荡30 min，加入5 mg硫化铜/二氧化硅纳米复合材料，于4 ℃孵化12 h，加入100 μL的质量分数为1%的BSA孵化1 h，离心分离，PBS洗涤，分散在2 mL的浓度为10 mM的PBS中，即制得硫化铜/二氧化硅纳米复合材料标记的胰岛素检测抗体溶液。

实施例6 硫化铜/二氧化硅纳米复合材料标记的胰岛素检测抗体溶液的制备

（1）氨基化二氧化硅的制备

1）将100 mL的无水乙醇与3 mL超纯水混合形成匀液，加入10 mL硅酸四乙酯，以2 mL/min的进样速度加入30 mL的质量分数为25%的氨水，于50 ℃下搅拌5 h，离心分离，用无水乙醇和超纯水洗至中性，60 ℃真空干燥12 h，制得二氧化硅；

2）将3 mL氨丙基三乙氧基硅烷和1 g二氧化硅加入200 mL无水甲苯中，超声30 min，于100 ℃搅拌24 h，离心分离，乙醇洗涤3次，60 ℃真空干燥，制得氨基功能化二氧化硅；

（2）硫化铜的制备

将50 mg氯化铜和45 mg的柠檬酸钠溶于180 mL超纯水，加入20 mL浓度为3 mg/mL的硫化钠溶液，于室温下搅拌5 min，100 ℃继续搅拌15 min，移至冰水中，所得溶液于4 ℃储存备用；

（3）硫化铜/二氧化硅纳米复合材料的制备

将10 mg氨基化二氧化硅加入到30 mL硫化铜溶液中，搅拌3 h，离心分离，真空干燥12 h，得到硫化铜/二氧化硅纳米复合材料；

（4）硫化铜/二氧化硅纳米复合材料标记的胰岛素检测抗体溶液的制备

将0.5 mL、100 μg/mL胰岛素检测抗体加入0.5 mL、10 mg/mL的EDC和2 mg/mL的NHS混合液，震荡30 min，加入5 mg硫化铜/二氧化硅纳米复合材料，于4 ℃孵化12 h，加入200 μL的质量分数为1%的BSA孵化1 h，离心分离，PBS洗涤，分散在2 mL的浓度为10 mM的PBS中，即制得硫化铜/二氧化硅纳米复合材料标记的胰岛素检测抗体溶液。

实施例7 胰岛素的检测

（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的胰岛素光电化学传感器为工作电极，在含有10 mL、0.1 mol/L的抗坏血酸的pH 7.4的PBS缓冲溶液中进行测试；

（2）用时间-电流法对不同浓度的胰岛素溶液进行检测，输入电压为0 V记录电流变化，绘制工作曲线；

（3）将待测样品溶液代替胰岛素溶液进行检测，按照工作曲线的绘制方法进行测定。