一种分离自蓝花黄芩的新型克罗烷型二萜类化合物及其在制备抗HIV药物中的用途

摘要

本发明属于植物化学技术领域，具体涉及一种分离自蓝花黄芩的新型克罗烷型二萜类化合物及其在制备抗HIV药物中的用途。所述新克罗烷型二萜类化合物具有式I所示的结构：

说明书

技术领域

本发明属于植物化学技术领域，具体涉及一种分离自蓝花黄芩的新型克罗烷型二萜类化合物及其在制备抗HIV药物中的用途。

背景技术

唇形科(Lamiaceae)黄芩属(Scutellaria)植物广泛分布于热带和亚热带山脉地区，遍及欧洲、北美和东亚，约有360多个物种。在我国明确记载的有102种，50个变种，多为药用。其中2010年版《中国药典》收录2种：黄芩(Scutellaria baicalensis)和半枝莲 (Scutellaria barbata)，黄芩主治湿温、暑湿，胸闷呕恶，湿热痞满，泻痢，黄疸，肺热咳嗽，高热烦咳，血热吐衄，痈肿疮毒和胎动不安。现代药理研究表明，黄芩属植物具有抗氧化、抗肿瘤、保肝，抗炎、抗惊厥、抗菌、抗病毒等作用。萜类和酚类化合物是黄芩属植物的主要化学成分，其中二萜类具有很好的抑制EBV病毒裂解复制，抗肿瘤，抗拒食和对脂多糖诱导的一氧化氮生成起抑制作用等活性。

蓝花黄芩(Scutellaria formosana N.E.Brown)为番唇形科(Lamiacea)黄芩属多年生草本植物，根茎近木质，具纤维状须根。该植物产自广东，江西，福建，云南等地。目前关于蓝花黄芩的化学成分及药理活性的研究仅限于挥发油成分鉴定及其粗提物活性研究，结果表明蓝花黄芩粗提物具有一定的抗肿瘤和抗HIV-1活性。据本属植物相关报道，这些活性可能与二萜类成分有关。从蓝花黄芩分离得到的新克罗烷型二萜类化合物未见报道，也未见该类化合物在抗HIV-1报道。

发明内容

本发明提供一种新克罗烷型二萜类化合物、其立体异构体、互变异构体、前药或其药学上可接受的盐，其特征在于所述新克罗烷型二萜类化合物具有式I所示的结构：

其中R₁选自Ac、Bz，R₂选自OH、OAc或OBz，R₃选自H、>

本发明提供另一优选实施方案，式I化合物优选如下化合物II-VIII：

本发明的另一实施方案提供一种同时制备化合物II-VIII的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将阴干的蓝花黄芩全草粉碎，用乙醇溶液加热50-60℃提取2-4次，每次提取1-3h，合并提取液，减压浓缩得粗提物；

(2)将步骤(1)得到的粗提物用适量的水稀释制成悬浮液后，依次用等体积的石油醚萃取3-5次，合并石油醚相，减压浓缩得浸膏；

(3)将步骤(2)得到的浸膏，先经减压硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂作为洗脱剂进行梯度洗脱，洗脱梯度分别为100:0、90:10、80:20、70:30、60:40， 50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100，每个梯度收集两个柱体积，根据极性大小分成10个组分，其中梯度100:0～90:10洗脱得到的为组分1，梯度90:10～80:20洗脱得到的为组分2，梯度80:20～70:30洗脱得到的为组分3，梯度70:30～60:40洗脱得到的为组分4，梯度60:40～50:50洗脱得到的为组分5，梯度50:50～40:60洗脱得到的为组分6，梯度 40:60～30:70洗脱得到的为组分7，梯度30:70～20:80洗脱得到的为组分8，梯度20:80～10:90 洗脱得到的为组分9，梯度10:90～0:100洗脱得到的为组分10，其中组分4先经正相硅胶柱层析，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝15:1-5:1的混合溶剂，洗脱2-5个柱体积，减压浓缩后再经Sephadex LH-20凝胶柱层析，洗脱剂为CHCl₃:MeOH＝1:1的混合溶剂，洗脱3-6>2O＝55:45，依次得到化合物II、IV、VI，组分5先经Sephadex>2O＝75:25，依次得到化合物III、VIII，组分6经高效液相色谱HPLC>2O>

上述制备方法，步骤(1)中所述乙醇溶液为体积分数为75-95％的乙醇溶液，其用量为每千克蓝花黄芩全草(干重)用2-3L乙醇溶液。步骤(2)中水的用量，本领域的技术人员可以根据粗提物的量，合理选择水的用量，优选每100克粗提物加水 200-300mL，每次萃取石油醚的体积用量与水的体积相同。

本发明色谱分离中所有涉及洗脱剂或流动相比例均为体积比。

本发明的另一实施方案提供一种抗HIV药物，其特征在于该药物以式I化合物、其立体异构体、互变异构体、前药或其药学上可接受的盐作为有效成分。该药物还可包括其他抗病毒药物。该药物还可包括药用辅料，例如药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

本发明的另一实施方案提供一种抗HIV药物，其特征在于该药物以化合物II-VIII、其立体异构体、互变异构体、前药或其药学上可接受的盐作为有效成分。该药物还可包括其他抗病毒药物。该药物还可包括药用辅料，例如药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

本发明的另一实施方案提供式I化合物、其立体异构体、互变异构体、前药或其药学上可接受的盐在制备抗HIV药物中的用途。尤其是在制备抗HIV-1药物中的用途。

本发明的另一实施方案提供化合物II-VIII、其立体异构体、互变异构体、前药或其药学上可接受的盐在制备抗HIV药物中的用途。尤其是在制备抗HIV-1药物中的用途。

本发明中术语“药学上可接受的盐”是指非毒性的无机或有机酸和/或碱的加成盐，可参见“Salt selection for basic drugs”,Int.J.Pharm.(1986),33,201–217。

具体实施方式

为了便于对本发明的进一步理解，下面提供的实施例对其做了更详细的说明。但是这些实施例仅供更好的理解发明而并非用来限定本发明的范围或实施原则，本发明的实施方式不限于以下内容。

实施例1：克罗烷型二萜类化合物II-VIII的制备

(1)将阴干的蓝花黄芩全草(2.0kg)粉碎，用75％的乙醇溶液(6L)加热50-60℃提取4次，每次提取1h，合并提取液，减压浓缩得粗提物(约300g)；

(2)将步骤(1)得到的粗提物用适量的水(600mL)稀释制成悬浮液后，依次用等体积的石油醚(600mL)萃取5次，合并石油醚相，减压浓缩得浸膏(约21g)；

(3)将步骤(2)得到的浸膏，先经减压硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂作为洗脱剂进行梯度洗脱，洗脱梯度分别为100:0、90:10、80:20、70:30、60:40， 50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100，每个梯度收集两个柱体积，根据极性大小分成10个组分，其中梯度100:0～90:10洗脱得到的为组分1，梯度90:10～80:20洗脱得到的为组分2，梯度80:20～70:30洗脱得到的为组分3，梯度70:30～60:40洗脱得到的为组分4，梯度60:40～50:50洗脱得到的为组分5，梯度50:50～40:60洗脱得到的为组分6，梯度 40:60～30:70洗脱得到的为组分7，梯度30:70～20:80洗脱得到的为组分8，梯度20:80～10:90 洗脱得到的为组分9，梯度10:90～0:100洗脱得到的为组分10，其中组分4先经正相硅胶柱层析，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝15:1-5:1的混合溶剂，洗脱2-5个柱体积，减压浓缩后再经Sephadex LH-20凝胶柱层析，洗脱剂为CHCl₃:MeOH＝1:1的混合溶剂，洗脱3-6>2O＝55:45，依次得到化合物II(20.0mg)、IV(2.8 mg)、VI(10.0mg)，组分5先经Sephadex LH-20凝胶柱层析，洗脱剂为MeOH，洗脱3-6>2O＝75:25，依次得到化合物III(18.9mg)、>2O＝75:25，依次得到化合物VII(3.0mg)、V(2.7mg)。

化合物II-VIII结构如下：

结构鉴定数据如下：

化合物II：(1R,4R,5S,6,8S,9R,10R,12S,13R)-1,6-二乙酰氧基-12-苯甲酰氧基 -4,18；8,13-二环氧-新克罗烷-15,16-内酯为无色晶状物，易溶于氯仿。经HRESI(+)MS(m/z 593.2366[M+Na]⁺，理论值593.2357)确定其分子式为C₃₁H₃₈O₁₀；根据¹H，¹³C及二维核磁共振数据确定其结构，骨架类型为克罗烷型，将其命名为Scuteformoid>1H和¹³C>1H)，100MHz(¹³C)，溶剂：CDCl₃]。

化合物III：(1R,4R,5S,6S,7R,8S,9R,10R,12S,13R)-1,6-二乙酰氧基-7,12-二苯甲酰氧基 -4,18；8,13-二环氧-新克罗烷-15,16-内酯为无色晶状物，易溶于氯仿。经HRESI(+)MS(m/z 713.3372[M+Na]⁺，理论值713.3374)确定其分子式为C₃₈H₄₂O₁₂；根据¹H，¹³C及二维核磁共振数据确定其结构，骨架类型为克罗烷型，将其命名为Scuteformoid>1H和¹³C>1H)，100MHz(¹³C)，溶剂：CDCl₃]。

化合物IV：(1R,4R,5S,6S,7R,8S,9R,10R,12S,13R)-1,6,7-三乙酰氧基-12-苯甲酰氧基 -4,18；8,13-二环氧-新克罗烷-15,16-内酯为无定形粉末，易溶于氯仿。经HRESI(+)MS(m/z 651.2428[M+Na]⁺，理论值651.2412)确定其分子式为C₃₃H₄₀O₁₂；根据¹H，¹³C及二维核磁共振数据确定其结构，骨架类型为克罗烷型，将其命名为Scuteformoid>1H和¹³C>1H)，100MHz(¹³C)，溶剂：CDCl₃]。

化合物V：(1R,4R,5S,6S,7R,8S,9R,10R,12S,13R)-1-羟基-6-乙酰氧基-7,12-二苯甲酰氧基-4,18；8,13-二环氧-新克罗烷-15,16-内酯为无定形粉末，易溶于氯仿。经HRESI(+)MS (m/z 671.2578[M+Na]⁺，理论值671.2577)确定其分子式为C₃₆H₄₀O₁₁；根据¹H，¹³C及二维核磁共振数据确定其结构，骨架类型为克罗烷型，将其命名为Scuteformoid>1H和¹³C>1H)，100MHz(¹³C)，溶剂：CDCl₃]。

化合物VI：(1R,4R,5S,6S,8S,9R,10R,12S,13R)-6,12-二乙酰氧基-1-苯甲酰氧基 -4,18；8,13-二环氧-新克罗烷-15,16-内酯为无色晶状物，易溶于氯仿。经HRESI(+)MS(m/z 593.2358[M+Na]⁺，理论值593.2357)确定其分子式为C₃₁H₃₈O₁₀；根据¹H，¹³C及二维核磁共振数据确定其结构，骨架类型为克罗烷型，将其命名为Scuteformoid>1H和¹³C>1H)，100MHz(¹³C)，溶剂：CDCl₃]。

化合物VII：(1R,4R,5S,6S,7R,8S,9R,10R,12S,13R)-6,7,12-三乙酰氧基-1-苯甲酰氧基 -4,18；8,13-二环氧-新克罗烷-15,16-内酯为无色晶状物，易溶于氯仿。经HRESI(+)MS(m/z 651.2428[M+Na]⁺，理论值651.2412)确定其分子式为C₃₃H₄₀O₁₂；根据¹H，¹³C及二维核磁共振数据确定其结构，骨架类型为克罗烷型，将其命名为Scuteformoid>1H和¹³C>1H)，100MHz(¹³C)，溶剂：CDCl₃]。

化合物VIII：(1R,4R,5S,6S,7R,8S,9R,10R,12S,13R)-1,6,12-三乙酰氧基-7-苯甲酰氧基 -4,18；8,13-二环氧-新克罗烷-15,16-内酯为无定形粉末，易溶于氯仿。经HRESI(+)MS(m/z 651.2428[M+Na]⁺，理论值651.2412)确定其分子式为C₃₃H₄₀O₁₂；根据¹H，¹³C及二维核磁共振数据确定其结构，骨架类型为克罗烷型，将其命名为Scuteformoid>1H和¹³C>1H)，100MHz(¹³C)，溶剂：CDCl₃]。

表1.化合物II的¹H-NMR和¹³C-NMR数据[δ(ppm),J(Hz)]

表2.化合物III、IV、VI的¹H-NMR和¹³C-NMR数据[δ(ppm),J(Hz)]

表3.化合物V、VII、VIII的¹H-NMR和¹³C-NMR数据[δ(ppm),J(Hz)]

实施例2

(1)将阴干的蓝花黄芩全草(2.0kg)粉碎，用95％的乙醇溶液(4L)加热50-60℃提取2次，每次提取3h，合并提取液，减压浓缩得粗提物(约310g)；

(2)将步骤(1)得到的粗提物用适量的水(930mL)稀释制成悬浮液后，依次用等体积的石油醚(930mL)萃取3次，合并石油醚相，减压浓缩得浸膏(约22g)；

(3)将步骤(2)得到的浸膏，先经减压硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂作为洗脱剂进行梯度洗脱，洗脱梯度分别为100:0、90:10、80:20、70:30、60:40， 50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100，每个梯度收集两个柱体积，根据极性大小分成10个组分，其中梯度100:0～90:10洗脱得到的为组分1，梯度90:10～80:20洗脱得到的为组分2，梯度80:20～70:30洗脱得到的为组分3，梯度70:30～60:40洗脱得到的为组分4，梯度60:40～50:50洗脱得到的为组分5，梯度50:50～40:60洗脱得到的为组分6，梯度 40:60～30:70洗脱得到的为组分7，梯度30:70～20:80洗脱得到的为组分8，梯度20:80～10:90 洗脱得到的为组分9，梯度10:90～0:100洗脱得到的为组分10，其中组分4先经正相硅胶柱层析，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝15:1-5:1的混合溶剂，洗脱2-5个柱体积，减压浓缩后再经Sephadex LH-20凝胶柱层析，洗脱剂为CHCl₃:MeOH＝1:1的混合溶剂，洗脱3-6>2O＝55:45，依次得到化合物II(20.2mg)、IV(2.6 mg)、VI(11.0mg)，组分5先经Sephadex LH-20凝胶柱层析，洗脱剂为MeOH，洗脱3-6>2O＝75:25，依次得到化合物III(19.0mg)、VIII(2.5mg)，组分6经高效液相色谱HPLC制备，色谱柱为Waters>2O＝75:25，依次得到化合物VII(3.2mg)、V(2.9mg)。

化合物II-VIII的结构确证数据与实施例1一致。

实施例3：药理活性实验

实验材料

细胞：人体T淋巴细胞C8166、MT-4,实验病毒株HIV-1_IIIB。

细胞培养液：含10％胎牛血清(FBS)，RPMI-1640完全培养基，2mM L-谷氨酰胺，10mM HEPES，100,000IU/L青霉素，50μM 2-巯基乙醇，100μg/ml链霉素。

试剂：HEPES(N-2(2-Hydroxyothyl)piperazine-N′-(2-ethanesufonic acid),MTT [3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide]、谷氨酰胺(Glutamine)、青霉素(Penicillin)、硫酸链霉素(Streptomycinsulfate)均购自Sigma公司；RPMI-1640 和胎牛血清(FBS)为Invitrogen公司产品；2-巯基乙醇(2-ME,2-Mercaptoethanol)为 Bio-Rad公司产品；LDH试剂盒(Takara)，Poly(A)×[dT]₁₅(Roche)，3H-dTTP>TM>

实验方法

HIV-1感染性滴定

将HIV-1_IIIB贮存液在96孔板上作4倍稀释，分10个梯度，每梯度6个重复孔，同时设置对照孔6孔。每孔加入C8166细胞50μl，每孔终体积为200μl。在37℃,5％CO₂培养。第3天补加新鲜RPMI-1640完全培养基100μl，第7天在倒置显微镜下观察每孔中HIV-1_IIIB诱导的细胞病变效应(Cytopathic>

细胞毒性实验

将4×10⁵个/ml>2的条件下培养3天，采用MTT比色法检测细胞毒性。ELx800酶标仪测定OD值，测定波长为570nm。计算得到CC₅₀值(50％Cytotoxic>

HIV-1致细胞病变(CPE)的抑制实验

将8×10⁵个/ml正常人体T淋巴细胞系C8166移取50μL/孔接种到含有100μL/孔梯度倍比稀释药物的96孔细胞培养板上，然后滴加50μL的HIV-1_IIIB稀释上清液，1300>2的条件下培养3天，倒置显微镜下>50(50％Effective>

统计方法

根据实验结果，采用Origin7.5绘制折线图，按Reed&Muench法计算出样品抑制病毒的50％有效浓度(EC₅₀)，50％抑制细胞生长浓度(CC₅₀)及抗HIV-1活性的治疗指数TI值(Therapeutic>50/EC₅₀.

(1)细胞生长存活率(％)＝实验孔OD值/对照孔OD值×100

(2)HIV-1致细胞病变的抑制率(％)＝(1-实验孔合胞体数/对照孔合胞体数)×10

实验结果

对HIV-1致细胞病变的抑制作用结果见下表4.。结果表明蓝花黄芩石油醚部位的乙醇粗提物表现出较好的抗HIV-1活性，从石油醚部位分离的新克罗烷型二萜对HIV-1 病毒有微弱的抑制作用。

表4.本发明化合物II-VIII及步骤(1)得到的粗提物的抗HIV-1活性

^b>50/EC₅₀.

^c阳性对照药物:3'-叠氮-3'-脱氧胸苷。