一种银杏叶提纯物中内酯类成分高纯单体的工业制备方法

摘要

本发明公开了一种银杏叶提纯物中内酯类成分高纯单体的制备方法，包括以下步骤：原料的预处理、高速逆流萃取、减压液相色谱分离、高效制备液相色谱分离、溶剂重结晶，最终得到银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、银杏内酯J、银杏内酯M和白果内酯的高纯单体。本发明的制备方法简单，制备出的银杏内酯纯度均能达99％以上，且分离效率高、溶剂消耗少、适合工业化生产。

说明书

技术领域

本发明属于化工医药技术领域，具体涉及一种银杏叶提纯物中内酯类成分高纯单体的工业制备方法。

背景技术

银杏，又名白果树、公孙树，是我国特有树种。银杏的叶、果、树皮均可入药，尤以叶的药用价值最高。银杏叶的化学成分较为复杂，其提取物中主要含有黄酮类化合物和萜内酯类化合物，具有扩张心脑血管、改善微循环、抑制血小板聚集、抗氧化、清除和抑制氧自由基、延缓衰老、抗病毒、抗菌消炎、调节内分泌失调等生理作用。

银杏内酯属于萜类化合物，由倍半萜内酯和二萜内酯组成，是银杏叶中一类重要的活性成分。银杏内酯分子具有独特的十二碳骨架结构，嵌有一个叔丁基和六个五元环，包括一个螺壬烷，一个四氢呋喃环和三个内酯环。银杏内酯对血小板活化因子(PAF)受体有强大的特异性抑制作用，抗PAF活性很强，因此，迄今对银杏内酯B的药理作用研究是最为集中的。

银杏内酯的提取及纯化方法主要有溶剂萃取法、柱色谱法、溶剂萃取-柱色谱法、超临界提取法及色谱或柱层析纯化等方法，上述各种方法虽然得到了较高纯度的银杏内酯单体，但大都工艺路线长、分离效率低、溶剂消耗大、有毒物质银杏酸存在使产品品质受到影响。

发明内容

本发明提供了一种银杏叶提纯物中内酯类成分高纯单体的工业制备方法，解决了现有技术中银杏内酯的提取及纯化方法工艺路线长、分离效率低、溶剂消耗大、有毒物质银杏酸存在使产品品质受到影响的问题。

本发明提供的一种银杏叶提纯物中内酯类成分高纯单体的工业制备方法，包括以下步骤：

步骤1，原料的预处理：取标准银杏叶提取物，往其中加入相当于标准银杏叶提取物重量5～8倍的去离子水，于40～70℃下搅拌至标准银杏叶提取物完全溶解，然后往其中加入浓度为10％的稀盐酸，调节体系pH为4～6，得到预处理银杏叶提取物；

步骤2，高速逆流萃取：将预处理银杏叶提取物抽入萃取塔内，然后按照预处理银杏叶提取物与萃取溶剂体积比为1：1.5～3.0比例往萃取塔内均匀导入萃取溶剂进行循环高速逆流萃取，控制萃取温度为40～60℃，循环萃取3～5次后，得到萃取液，将萃取液浓缩、干燥、粉碎后，得到银杏总内酯粗品；

其中，所述萃取溶剂由乙酸乙酯与二氯甲烷按照80：20的体积比混合配制而成；

步骤3，减压液相色谱分离：将银杏总内酯粗品与乙醇按照1g：3～5mL的比例混合、溶解，得到银杏总内酯粗品的乙醇溶液，往银杏总内酯粗品的乙醇溶液中加入相当于银杏总内酯粗品重量1.5～2倍的硅胶拌样，同时用相当于银杏总内酯粗品重量20～30倍的硅胶湿法装柱，径高比为1：4～6，装柱完毕后，控制柱压为-0.3～-0.1Mpa，上样，进行硅胶柱层析，并用石油醚和乙酸乙酯的混合溶液作为洗脱剂进行梯度洗脱，收集各梯度馏分，所得各馏分通过薄层色谱检测后，合并相同馏分，并将合并后的各相同馏分分别浓缩、干燥，得各馏分内酯粗品；

步骤4，高效制备液相色谱分离：将各馏分内酯粗品和甲醇均按照1g：10mL的比例混合、溶解后过0.45μm的滤膜，分别得到各馏分内酯粗品的甲醇溶液，将各馏分内酯粗品的甲醇溶液分别注入到高效制备液相色谱仪中，采用甲醇水混合溶液洗脱，洗脱过程中收集单一组分，并将各单一组分分别浓缩、结晶、真空干燥，得到各组分内酯单体；

步骤5，溶剂重结晶：将各组分内酯单体和丙酮均按照1g：3mL的比例进行重结晶，得到第一次重结晶产物，将第一次重结晶产物与浓度为98％的乙醇按照1g：3mL的比例进行第二次重结晶，得到各组分内酯高纯单体；

其中，所述各组分内酯高纯单体分别为银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、银杏内酯J、银杏内酯M和白果内酯的高纯单体。

优选的，所述标准银杏叶提取物中总黄酮含量≥24％，总内酯含量≥6％，总银杏酸含量≤10ppm。

优选的，所述步骤3中所用硅胶的规格为200～300目。

优选的，所述步骤3中石油醚与乙酸乙酯分别按照体积比为10：3、10：4、10：5、10：6、10：7以及0：1的梯度进行洗脱。

优选的，所述步骤4中用来洗脱的甲醇水混合溶液中甲醇和水的体积比为60：40或70：30。

优选的，所述步骤4各单一组分分别浓缩至固液比1：3～5后再降温至3～6℃进行结晶。

优选的，所述步骤5中第一次重结晶以及第二次重结晶的温度均为3～6℃。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明采用溶解、高速逆流萃取、减压液相色谱分离、高效制备液相色谱分离和溶剂重结晶组合工艺，对银杏叶提取物中内酯类成分进行分离，获得银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、银杏内酯J、银杏内酯M和白果内酯的高纯单体，高效液相色谱法检测其纯度均可达99％以上，此外，本发明的工艺路线短、分离效率高、溶剂消耗少、避免了有毒物质银杏酸对产品品质的影响，适合工业化生产。

具体实施方式

为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。

本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1

一种银杏叶提纯物中内酯类成分高纯单体的工业制备方法，包括以下步骤：

步骤1，原料的预处理：取标准银杏叶提取物1.0kg(采用现有技术制备的符合质量标准的银杏提取物均可以)，总内酯含量为7.12％(含总内酯约71.2g)，往其中加入5.0L去离子水，于70℃下搅拌至标准银杏叶提取物完全溶解，然后往其中加入浓度为10％的稀盐酸，调节体系pH为4，得到预处理银杏叶提取物；

步骤2，高速逆流萃取：将预处理银杏叶提取物抽入萃取塔内，再往萃取塔内均匀导入7.5L萃取溶剂进行循环高速逆流萃取，控制萃取温度为40℃，循环萃取3次后，得到萃取液，将萃取液60℃减压浓缩、干燥、粉碎后，得到61.52g银杏总内酯粗品；

其中，萃取溶剂由乙酸乙酯与二氯甲烷按照80：20的体积比混合配制而成；

步骤3，减压液相色谱分离：将61.52g银杏总内酯粗品用300mL乙醇溶解，得到银杏总内酯粗品的乙醇溶液，往银杏总内酯粗品的乙醇溶液中加入100g规格为200目的硅胶拌样，得到样品的硅胶拌样，将样品的硅胶拌样减压浓缩至干后备用；

取1230g规格为200目的硅胶，105℃干燥1h，湿法装柱，径高比1：5.3，装柱完毕后，控制柱压为-0.1Mpa，上样，进行硅胶柱层析，然后用石油醚和乙酸乙酯的混合溶液作为洗脱剂进行梯度洗脱，并按照石油醚与乙酸乙酯的体积比分别为10：3、10：4、10：5、10：6、10：7以及0：1的梯度进行洗脱，每种梯度的洗脱液均为5.0L，每500mL为1个梯度馏分进行收集，所得各馏分通过薄层色谱检测后，合并相同馏分，并将合并后的各相同馏分分别浓缩、干燥，得各馏分内酯粗品；

步骤4，高效制备液相色谱分离：将各馏分内酯粗品和甲醇均按照1g：10mL的比例混合、溶解后过0.45μm的滤膜，分别得到各馏分内酯粗品的甲醇溶液，将各馏分内酯粗品的甲醇溶液分别注入到高效制备液相色谱仪中，采用甲醇与水的体积比为70：30的甲醇水混合溶液进行洗脱，洗脱过程中收集单一组分，并将各单一组分分别浓缩至固液比为1：3后于3℃下结晶，母液浓缩浓缩至1/2体积后降温至3℃结晶2次，合并所有晶体，真空干燥，得到各组分内酯单体；

步骤5，溶剂重结晶：将各组分内酯单体和丙酮均按照1g：3mL的比例进行重结晶，得到第一次重结晶产物，将第一次重结晶产物与浓度为98％的乙醇按照1g：3mL的比例进行第二次重结晶，收集两次重结晶的母液，将其浓缩至1/2体积后降温至4℃结晶2次，抽滤，合并所有晶体并真空冷冻干燥，最后得到3.45g银杏内酯A，纯度为99.37％；得到12.65g银杏内酯B，纯度为99.21％；得到14.84g银杏内酯C，纯度为99.18％；得到7.02g白果内酯，纯度为99.36％；得到0.84g银杏内酯J，纯度为99.12％；得到0.32g银杏内酯M，纯度为99.19％。

实施例2

一种银杏叶提纯物中内酯类成分高纯单体的工业制备方法，包括以下步骤：

步骤1，原料的预处理：取标准银杏叶提取物1.2kg，总内酯含量为7.12％(含总内酯约85.44g)，往其中加入7.2L去离子水，于60℃下搅拌至标准银杏叶提取物完全溶解，然后往其中加入浓度为10％的稀盐酸，调节体系pH为4.5，得到预处理银杏叶提取物；

步骤2，高速逆流萃取：将预处理银杏叶提取物抽入萃取塔内，再往萃取塔内均匀导入14.4L萃取溶剂进行循环高速逆流萃取，控制萃取温度为45℃，循环萃取4次后，得到萃取液，将萃取液65℃减压浓缩、干燥、粉碎后，得到70.58g银杏总内酯粗品；

其中，萃取溶剂由乙酸乙酯与二氯甲烷按照80：20的体积比混合配制而成；

步骤3，减压液相色谱分离：将70.58g银杏总内酯粗品用300mL乙醇溶解，得到银杏总内酯粗品的乙醇溶液，往银杏总内酯粗品的乙醇溶液中加入120g规格为250目的硅胶拌样，得到样品的硅胶拌样，将样品的硅胶拌样减压浓缩至干后备用；

取1552g规格为250目的硅胶，105℃干燥1h，湿法装柱，径高比1：4.5，装柱完毕后，控制柱压为-0.15Mpa，上样，进行硅胶柱层析，然后用石油醚和乙酸乙酯的混合溶液作为洗脱剂进行梯度洗脱，并按照石油醚与乙酸乙酯的体积比分别为10：3、10：4、10：5、10：6、10：7以及0：1的梯度进行洗脱，每种梯度的洗脱液均为6.0L，每500mL为1个梯度馏分进行收集，所得各馏分通过薄层色谱检测后，合并相同馏分，并将合并后的各相同馏分分别浓缩、干燥，得各馏分内酯粗品；

步骤4，高效制备液相色谱分离：将各馏分内酯粗品和甲醇均按照1g：10mL的比例混合、溶解后过0.45μm的滤膜，分别得到各馏分内酯粗品的甲醇溶液，将各馏分内酯粗品的甲醇溶液分别注入到高效制备液相色谱仪中，采用甲醇与水的体积比为70：30的甲醇水混合溶液进行洗脱，洗脱过程中收集单一组分，并将各单一组分分别浓缩至固液比为1：3.5后于4℃下结晶，母液浓缩浓缩至1/2体积后降温至4℃结晶2次，合并所有晶体，真空干燥，得到各组分内酯单体；

步骤5，溶剂重结晶：将各组分内酯单体和丙酮均按照1g：3.5mL的比例进行重结晶，得到第一次重结晶产物，将第一次重结晶产物与浓度为98％的乙醇按照1g：3.5mL的比例进行第二次重结晶，收集两次重结晶的母液，将其浓缩至1/2体积后降温至4℃结晶2次，抽滤，合并所有晶体并真空冷冻干燥，最后得到4.18g银杏内酯A，纯度为99.15％；得到15.34g银杏内酯B，纯度为99.34％；得到17.26g银杏内酯C，纯度为99.57％；得到8.39g白果内酯，纯度为99.13％；得到0.96g银杏内酯J，纯度为99.45％；得到0.41g银杏内酯M，纯度为99.08％。

实施例3

一种银杏叶提纯物中内酯类成分高纯单体的工业制备方法，包括以下步骤：

步骤1，原料的预处理：取标准银杏叶提取物1.5kg，总内酯含量为7.12％(含总内酯约106.8g)，往其中加入10.5L去离子水，于50℃下搅拌至标准银杏叶提取物完全溶解，然后往其中加入浓度为10％的稀盐酸，调节体系pH为5.0，得到预处理银杏叶提取物；

步骤2，高速逆流萃取：将预处理银杏叶提取物抽入萃取塔内，再往萃取塔内均匀导入26.25L萃取溶剂进行循环高速逆流萃取，控制萃取温度为50℃，循环萃取5次后，得到萃取液，将萃取液70℃减压浓缩、干燥、粉碎后，得到88.32g银杏总内酯粗品；

其中，萃取溶剂由乙酸乙酯与二氯甲烷按照80：20的体积比混合配制而成；

步骤3，减压液相色谱分离：将88.32g银杏总内酯粗品用350mL乙醇溶解，得到银杏总内酯粗品的乙醇溶液，往银杏总内酯粗品的乙醇溶液中加入150g规格为250目的硅胶拌样，得到样品的硅胶拌样，将样品的硅胶拌样减压浓缩至干后备用；

取2208g规格为250目的硅胶，105℃干燥1h，湿法装柱，径高比1：5.7，装柱完毕后，控制柱压为-0.2Mpa，上样，进行硅胶柱层析，然后用石油醚和乙酸乙酯的混合溶液作为洗脱剂进行梯度洗脱，并按照石油醚与乙酸乙酯体积比分别为10：3、10：4、10：5、10：6、10：7以及0：1的梯度进行洗脱，每种梯度的洗脱液均为7.2L，每600mL为1个梯度馏分进行收集，所得各馏分通过薄层色谱检测后，合并相同馏分，并将合并后的各相同馏分分别浓缩、干燥，得各馏分内酯粗品；

步骤4，高效制备液相色谱分离：将各馏分内酯粗品和甲醇均按照1g：10mL的比例混合、溶解后过0.45μm的滤膜，分别得到各馏分内酯粗品的甲醇溶液，将各馏分内酯粗品的甲醇溶液分别注入到高效制备液相色谱仪中，采用甲醇与水的体积比为60：40的甲醇水混合溶液进行洗脱，洗脱过程中收集单一组分，并将各单一组分分别浓缩至固液比为1：4后于4℃下结晶，母液浓缩浓缩至1/2体积后降温至4℃结晶2次，合并所有晶体，真空干燥，得到各组分内酯单体；

步骤5，溶剂重结晶：将各组分内酯单体和丙酮均按照1g：4mL的比例进行重结晶，得到第一次重结晶产物，将第一次重结晶产物与浓度为98％的乙醇按照1g：4mL的比例进行第二次重结晶，收集两次重结晶的母液，将其浓缩至1/2体积后降温至4℃结晶2次，抽滤，合并所有晶体并真空冷冻干燥，最后得到5.26g银杏内酯A，纯度为99.26％；得到19.13g银杏内酯B，纯度为99.30％；得到21.38g银杏内酯C，纯度为99.28％；得到9.89g白果内酯，纯度为99.08％；得到1.17g银杏内酯J，纯度为99.41％；得到0.51g银杏内酯M，纯度为99.21％。

实施例4

一种银杏叶提纯物中内酯类成分高纯单体的工业制备方法，包括以下步骤：

步骤1，原料的预处理：取标准银杏叶提取物2.0kg，总内酯含量为7.12％(含总内酯约142.4g)，往其中加入16.0L去离子水，于40℃下搅拌至标准银杏叶提取物完全溶解，然后往其中加入浓度为10％的稀盐酸，调节体系pH为5.5，得到预处理银杏叶提取物；

步骤2，高速逆流萃取：将预处理银杏叶提取物抽入萃取塔内，再往萃取塔内均匀导入48L萃取溶剂进行循环高速逆流萃取，控制萃取温度为55℃，循环萃取5次后，得到萃取液，将萃取液75℃减压浓缩、干燥、粉碎后，得到112.68g银杏总内酯粗品；

其中，萃取溶剂由乙酸乙酯与二氯甲烷按照80：20的体积比混合配制而成；

步骤3，减压液相色谱分离：将112.68g银杏总内酯粗品用500mL乙醇溶解，得到银杏总内酯粗品的乙醇溶液，往银杏总内酯粗品的乙醇溶液中加入200g规格为300目的硅胶拌样，得到样品的硅胶拌样，将样品的硅胶拌样减压浓缩至干后备用；

取3155g规格为300目的硅胶，105℃干燥1h，湿法装柱，径高比1：5.2，装柱完毕后，控制柱压为-0.25Mpa，上样，进行硅胶柱层析，然后用石油醚和乙酸乙酯的混合溶液作为洗脱剂进行梯度洗脱，并按照石油醚与乙酸乙酯体积比分别为10：3、10：4、10：5、10：6、10：7以及0：1的梯度进行洗脱，每种梯度的洗脱液均为9.6L，每800mL为1个梯度馏分进行收集，所得各馏分通过薄层色谱检测后，合并相同馏分，并将合并后的各相同馏分分别浓缩、干燥，得各馏分内酯粗品；

步骤4，高效制备液相色谱分离：将各馏分内酯粗品和甲醇均按照1g：10mL的比例混合、溶解后过0.45μm的滤膜，分别得到各馏分内酯粗品的甲醇溶液，将各馏分内酯粗品的甲醇溶液分别注入到高效制备液相色谱仪中，采用甲醇与水的体积比为60：40的甲醇水混合溶液进行洗脱，洗脱过程中收集单一组分，并将各单一组分分别浓缩至固液比为1：5后于5℃下结晶，母液浓缩浓缩至1/2体积后降温至5℃结晶2次，合并所有晶体，真空干燥，得到各组分内酯单体；

步骤5，溶剂重结晶：将各组分内酯单体和丙酮均按照1g：5mL的比例进行重结晶，得到第一次重结晶产物，将第一次重结晶产物与浓度为98％的乙醇按照1g：5mL的比例进行第二次重结晶，收集两次重结晶的母液，将其浓缩至1/2体积后降温至5℃结晶2次，抽滤，合并所有晶体并真空冷冻干燥，最后得到6.89g银杏内酯A，纯度为99.38％；得到26.37g银杏内酯B，纯度为99.12％；得到31.23g银杏内酯C，纯度为99.19％；得到13.59g白果内酯，纯度为99.28％；得到1.62g银杏内酯J，纯度为99.16％；得到0.62g银杏内酯M，纯度为99.18％。

实施例5

一种银杏叶提纯物中内酯类成分高纯单体的工业制备方法，包括以下步骤：

步骤1，原料的预处理：取标准银杏叶提取物2.5kg，总内酯含量为7.12％(含总内酯约178.0g)，往其中加入15.0L去离子水，于55℃下搅拌至标准银杏叶提取物完全溶解，然后往其中加入浓度为10％的稀盐酸，调节体系pH为6.0，得到预处理银杏叶提取物；

步骤2，高速逆流萃取：将预处理银杏叶提取物抽入萃取塔内，再往萃取塔内均匀导入37.5L萃取溶剂进行循环高速逆流萃取，控制萃取温度为50℃，循环萃取4次后，得到萃取液，将萃取液70℃减压浓缩、干燥、粉碎后，得到145.96g银杏总内酯粗品；

其中，萃取溶剂由乙酸乙酯与二氯甲烷按照80：20的体积比混合配制而成；

步骤3，减压液相色谱分离：将145.96g银杏总内酯粗品用600mL乙醇溶解，得到银杏总内酯粗品的乙醇溶液，往银杏总内酯粗品的乙醇溶液中加入250g规格为300目的硅胶拌样，得到样品的硅胶拌样，将样品的硅胶拌样减压浓缩至干后备用；

取4379g规格为300目的硅胶，105℃干燥1h，湿法装柱，径高比1：6.5，装柱完毕后，控制柱压为-0.30Mpa，上样，进行硅胶柱层析，然后用石油醚和乙酸乙酯的混合溶液作为洗脱剂进行梯度洗脱，并按照石油醚与乙酸乙酯体积比分别为10：3、10：4、10：5、10：6、10：7以及0：1的梯度进行洗脱，每种梯度的洗脱液均为10.8L，每900mL为1个梯度馏分进行收集，所得各馏分通过薄层色谱检测后，合并相同馏分，并将合并后的各相同馏分分别浓缩、干燥，得各馏分内酯粗品；

步骤4，高效制备液相色谱分离：将各馏分内酯粗品和甲醇均按照1g：10mL的比例混合、溶解后过0.45μm的滤膜，分别得到各馏分内酯粗品的甲醇溶液，将各馏分内酯粗品的甲醇溶液分别注入到高效制备液相色谱仪中，采用甲醇与水的体积比为60：40的甲醇水混合溶液进行洗脱，洗脱过程中收集单一组分，并将各单一组分分别浓缩至固液比为1：5后于6℃下结晶，母液浓缩浓缩至1/2体积后降温至6℃结晶2次，合并所有晶体，真空干燥，得到各组分内酯单体；

步骤5，溶剂重结晶：将各组分内酯单体和丙酮均按照1g：5mL的比例进行重结晶，得到第一次重结晶产物，将第一次重结晶产物与浓度为98％的乙醇按照1g：5mL的比例进行第二次重结晶，收集两次重结晶的母液，将其浓缩至1/2体积后降温至6℃结晶2次，抽滤，合并所有晶体并真空冷冻干燥，最后得到8.46g银杏内酯A，纯度为99.26％；得到30.13g银杏内酯B，纯度为99.27％；得到35.58g银杏内酯C，纯度为99.20％；得到16.21g白果内酯，纯度为99.04％；得到1.96g银杏内酯J，纯度为99.38％；得到0.69g银杏内酯M，纯度为99.22％。

本发明中采用了减压液相色谱对银杏叶提纯物中内酯类成分进行了分离，减压柱色谱分离可以加快层析速度，缩短洗脱时间，同时在完成一个溶剂梯度展开，抽干后还可用另一梯度溶液再次对其展开，有效的防止了各馏分之间的相互交叉和影响，极大的提高了分离效率，从而使同时分离出银杏叶提纯物中6种内酯类成分成为可能。此外，相比于常规的常压柱色谱和快速柱色谱分离而言，设备简单、操作简便、分离速度快、分辨率高、分离容量大、溶剂消耗少。

高效制备液相色谱分离方法采用了高柱效制备型色谱柱，由于高柱效制备型色谱柱中采用了颗粒度较小的吸附剂，使其具有更高的分离因子，因此能够完成难度很大的分离工作，并且分离效率高，对各种化合物均具有较好的分离效果，分离容量也大，直径为5cm的色谱柱即可实现克级样品的在线分离、检测和制备收集。

需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例1-5相同，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。