一种利用花序轴高效诱导大蒜胚性愈伤组织的方法

摘要

本发明公开了一种利用花序轴高效诱导大蒜胚性愈伤组织的方法。此技术首次利用大蒜花序轴为外植体诱导出体细胞胚，并构建了一套短时间内获得大量大蒜体细胞胚的优化体系，具有外植体取材广泛、体胚诱导效率高、数量多、速度快、结构完整和遗传稳定性好的优点，此外，对体细胞胚进行悬浮培养不仅可以缩短培养周期，建立快速繁殖体系，还可为品种改良、转基因受体和突变体筛选等提供良好的无性繁殖试验体系，将体胚制成人工种子，实现种苗规模化生产，应用价值和发展前景广阔。

说明书

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术，具体设计一种利用花序轴高效诱导大蒜胚性愈伤组织的方法。

背景技术

大蒜(Allium sativum L.)别名蒜、胡蒜，为百合科(Liliaceae)葱属(Allium)二年生草本植物，主要以嫩叶(蒜苗或青蒜)、花茎(蒜薹)、鳞茎(蒜头)为食用产品，营养价值极高，是我国栽培历史悠久的重要经济作物之一，也是重要的出口创汇蔬菜。我国绝大部分栽培大蒜不能形成种子，主要靠鳞茎进行无性繁殖，它的不育性也给品种遗传改良造成了困难，不利于新品种选育，同时常年的无形繁殖也导致种性退化，导致大蒜的产量和品质逐年下降。

利用组织培养技术，可以有效改善种性退化的问题，大大增加繁殖效率，进而提高大蒜产量和品质。大蒜组织培养主要有2种途径：器官发生途径和体细胞胚发生途径。相比器官发生途径，通过体细胞胚发生途径形成再生植株具有数量多、速度快、结构完整、遗传稳定性强等优点，其中对体细胞胚进行悬浮培养不仅可以缩短培养周期，建立快速繁殖体系，还可为品种改良、转基因受体和突变体筛选等提供良好的无性繁殖试验体系，将体胚制成人工种子，实现种苗规模化生产，应用价值和发展前景广阔。

目前，国内外的大蒜体细胞胚发生体系普遍存在着体胚发生频率低的问题。我国尚未形成一套完善的胚性愈伤组织诱导技术体系，有关品种和不同外植体对体胚发生影响的研究还不够深入系统，现有体系具有体胚发生频率低、再生时间长、和快繁成本高等问题急需建立了一种高效诱导胚性愈伤组织和体胚发生的再生体系。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用花序轴高效诱导大蒜胚性愈伤组织的方法，解决现有技术中存在的愈伤组织诱导率低、诱导时间长、和快繁成本高等问题。

本发明的目的可以通过以下措施达到：

一种利用花序轴高效诱导大蒜胚性愈伤组织的方法，包括以下步骤：

步骤(1)：在花序轴上表面直径0.3-0.5cm，蒜薹的花茎发育相对高度即花茎高度/假茎高度为0.5-3.0时，陆续采收蒜薹，然后剪下总苞带4-6cm蔓段，浸泡在饱和洗衣粉溶液中25-35min，然后用流水冲洗25-35min；

步骤(2)：将充分冲洗的材料在超净工作台上，以70-75％乙醇表面消毒60-90s，2％次氯酸钠溶液浸泡消毒10-15min后，用无菌水冲洗4-5次，最后置于无菌滤纸上吸干表面水分进行愈伤组织诱导试验；

步骤(3)：剥去无菌花序轴外层苞叶，除去表面退化的花原基残留物和膜质苞片及花茎部分，按十字型纵切为4块，接种在胚性愈伤组织诱导培养基中；

步骤(4)：挑选黄白色颗粒状、质地坚硬且易破碎的胚性愈伤组织，将其接入20-40mL愈伤组织增殖培养基中悬浮振荡培养，振荡转速为160-200r/min，每6-8d更换1次新鲜培养基；

步骤(5)：选择增殖后大小一致的胚性愈伤组织为材料，在添加6.0-7.0g·L^-1琼脂的体细胞胚萌发培养基上进行培养，每瓶接种4-6g的愈伤团，每4-5周继代1次。

本发明步骤(1)中取花序轴上表面直径0.3-0.5cm，蒜薹的花茎发育相对高度(花茎高度/假茎高度)约为0.5-3.0时的大蒜花序轴作为外植体，优选表面直径为0.5cm和蒜薹花茎发育相对高度为1的花序轴，选用花序轴，其出愈时间和诱导率均显著优于其他外植体类型，且适用品种广泛。

本发明步骤(2)花序轴的灭菌处理时，70～75％酒精表面消毒时间为60～90秒，2％次氯酸钠溶液处理时间为10-15分钟，以确保灭菌彻底。优选75％的酒精灭菌90s，2％的次氯酸钠灭菌12分钟。

本发明步骤(3)中灭菌后，剥去无菌花序轴外层苞叶，除去表面退化的花原基残留物等部分，可促进花序轴表面愈伤组织的诱导。

本发明步骤(3)中所采用的胚性愈伤组织诱导培养基所用的基本培养基可以为组培中常用的基础培养基之一或其混合，如MS、B₅或MS+B₅，但为了获得更高的胚性愈伤组织的诱导率，优选采用B₅培养基。一种更优选的配比为：1倍B₅培养基，2.0-3.0mg·L^-12,4-D，0.3-0.6mg·L^-1KT，30-40g·L^-1蔗糖，6.0-7.0g·L^-1琼脂，pH5.8～6.2，更优选的配比为：1倍B₅培养基，2.5mg·L^-1>-1KT，30g·L^-1蔗糖，6.5g·L^-1琼脂，pH5.8。当选用2.5mg·L^-1>-1KT时，愈伤组织诱导率更高。

本发明步骤(4)愈伤组织在液体悬浮培养中增值培养能快速增重，四周后，愈伤组织增重率可达44.30％。

本发明步骤(4)中所采用的胚性愈伤组织增殖培养基的配比为1倍B5培养基，1.0-1.5mg·L^-1的6-BA，0-0.5mg·L^-1的KT，20-40g·L^-1的蔗糖，pH为5.8-6.0或1倍B5培养基，1.0-1.5mg·L^-1的6-BA，0-0.1mg·L^-1的NAA，20-40g·L^-1的蔗糖，pH为5.8-6.0；优选的配比为1.0mg·L^-16-BA，0.5mg·L^-1KT，30g·L^-1蔗糖，6.5g·L^-1琼脂，pH5.8，在此条件下，增重率最大。

本发明步骤(4)中胚性愈伤组织增殖过程中置于23-27℃，光照强度为50-200μmol·m^-2·s^-1，光周期12-14h·d^-1光照条件下培养。

本发明步骤(5)中体细胞胚萌发培养基中包含：6-BA的浓度为1.5-2.5mg·L^-1，KT的浓度为0.5-1.0mg·L^-1，优选的配比为2.0mg·L^-16-BA，0.5mg·L^-1KT。每克愈伤组织萌发的芽数可达6.67。

本发明步骤(5)中的体细胞胚萌发培养基所用的基本培养基可以为组培中常用的基础培养基之一或其混合，如MS、B₅或MS+B₅，但为了获得更高的萌发率，优选采用MS培养基。步骤(5)中所述体细胞胚萌发培养基中还优选包括含有25-35g·L^-1的蔗糖。

本发明的有益效果：

1、取材广泛：首次利用大蒜花序轴为外植体诱导出体细胞胚，大蒜蒜薹上花序轴一般不作为食用器官，外植体来源丰富，进一步提高了大蒜产品器官的利用率。

2、体细胞胚诱导率高：4个品种在的愈伤诱导率为88％-90％，其中以‘二水早’为外植体最高，愈伤组织诱导率高达90.18％。

3、再生时间短：本发明利用花序轴为外植体，平均出愈时间为9d。

4、遗传稳定性强：和一般的愈伤组织比较，体细胞胚能保持较好的母细胞形状，变异系数低。

5、培养周期短：花序轴直接诱导体细胞胚的时间最短只有9天，而利用其它外植体诱导的培养时间长达1个月以上，有的甚至需要2-3个月；利用悬浮培养大大缩短了培养周期。

6、诱导成本低：外植体来源广泛，和蒜瓣等不同，花序轴的采收对大蒜产品器官售卖的影响不大，体胚诱导率高，再生时间短，大大降低了组织培养对温度、光照等控制的成本。

7、适用品种广泛：可适用于‘二水早’、‘徐州白’、‘正月早’、‘葡萄牙蒜’和‘早熟蒜’等多种品种。

8、对体细胞胚进行悬浮培养不仅可以缩短培养周期，建立快速繁殖体系，还可为品种改良、转基因受体和突变体筛选等提供良好的无性繁殖试验体系，将体胚制成人工种子，实现种苗规模化生产，应用价值和发展前景广阔。

附图说明

图1悬浮培养对胚性愈伤组织增殖影响；A.增殖前；B.增殖后；

图2不同激素组合对大蒜体细胞胚发育的影响；A.6-BA+KT；B.6-BA+NAA；C.KT+NAA；

图3大蒜体细胞胚发生；A.瘤状突起；B.结构松散的胚性愈伤组织；C.球形胚、盾形胚；D.成熟胚；

图4大蒜花序轴形成的胚性愈伤组织形态；A.底部白色形成物；B.顶部膨大突起；C.D.E.‘二水早’胚性愈伤组织；F.毛状根；

图5大蒜体细胞胚萌发情况；A.体胚中心变绿；B.C.绿点处萌发出根和芽；D.正常苗。

具体实施方式

通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1：

为了对比不同外植体类型对不同品种大蒜胚性愈伤组织诱导的影响，试验以花序轴、鳞茎盘(带茎尖)、试管苗的叶基部和根尖为材料，品种为‘二水早’、‘徐州白’、‘正月早’、‘葡萄牙蒜’和‘早熟蒜’。将花序轴剥去外层苞叶，除去表面退化的花原基残留物和膜质苞片及花茎部分，按十字型纵切为4块，接种在同一培养皿上；将灭菌处理过的蒜瓣去掉贮藏叶和营养叶，切去鳞茎盘上部6mm处的假茎和叶片，切去贴近茎盘底部的约l mm的木栓化组织，得到约5mm厚带发芽叶基的茎盘(带茎尖)，每培养皿接种4个；将试管苗发白的发芽叶基部切成约0.5cm²的小块，在叶脉中部横切几下，叶背向下接种到愈伤组织诱导培养基上；根尖切成1cm的小段，叶基部和根尖每培养皿分别接10个。3次重复，每重复接种10个培养皿。每天观察生长情况并统计愈伤组织诱导率。

愈伤组织诱导率(％)＝产生愈伤组织外植体数/(接种外植体数－死亡数－污染数)×100。

结果见表1和表2：不同的大蒜品种和取材部位对出愈有很大影响。同一品种的不同外植体之间，出愈时间和诱导率均有显著差异。

表1不同品种和外植体对大蒜胚性愈伤组织诱导的影响

注:表中不同字母表示在0.05水平上差异显著。

如表1所示，根尖和叶基部均以‘二水早’出愈最快且诱导率最高，其次是‘徐州白’、‘正月早’、‘早熟蒜’，‘葡萄牙蒜’最慢且诱导率最低；鳞茎盘则以‘徐州白’出愈最快(16d)，其次是‘早熟蒜’、‘正月早’、‘二水早’，‘葡萄牙蒜’最慢，需30d，彼此之间差异显著，但以上最快的出愈时间也需要至少16天，而诱导率以‘二水早’、‘徐州白’、‘正月早’较高，与‘早熟蒜’和‘葡萄牙蒜’差异显著，诱导率最高可达到25.01％。

如表2所示，本发明所采用的外植体花序轴，以‘二水早’和‘徐州白’出愈最快，为7-9d，‘正月早’和‘早熟蒜’为12-14d；不同品种诱导率均在90％左右，其出愈时间和诱导率均显著优于其他外植体类型，且适用品种广泛。大蒜‘二水早’花序轴诱导大蒜体细胞胚见图3。

表2不同品种对大蒜花序轴胚性愈伤组织诱导的影响

注:表中不同字母表示在0.05水平上差异显著。

实施例2：

为了对比不同基本培养基对不同品种大蒜胚性愈伤组织诱导的影响，选用MS、B₅和MS+B₅有机培养基，试验品种有‘二水早’、‘徐州白’、‘正月早’和‘早熟蒜’，激素选用2.5mg·L^-1>-1KT。花序轴为外植体诱导胚性愈伤组织的方法和诱导率计算方法同实施例1。

结果如表3：‘二水早’、‘徐州白’、‘正月早’和‘早熟蒜’在B₅基本培养基中与在MS和MS+B₅有机两种基本培养基中出愈时间无显著性差异，但4个品种在B₅培养基上的愈伤诱导率均高于其他基础培养基，为88％-90％，其中以‘二水早’最高，为90.18％。

表3不同品种和基本培养基对大蒜胚性愈伤组织诱导的影响

注:表中不同字母表示在0.05水平上差异显著。

实施例3：

为了对比不同激素种类和浓度对大蒜胚性愈伤组织诱导的影响，本试验的细胞分裂素选用KT(6-糖基氨基嘌呤)，设0.1、0.5、1.0mg·L^-1>-1>

结果如表4：本发明所优先采用2.5mg·L^-1>-1KT愈伤组织诱导率最高，为90.18％，优于其他组合浓度说明在此浓度下2,4-D与KT协同作用于大蒜花序轴愈伤诱导。此处理下，大蒜花序轴形成的胚性愈伤组织形态见图4。

表4不同激素对大蒜胚性愈伤组织诱导的影响

注:表中不同字母表示在0.05水平上差异显著。

实施例4：

为了对比不同蔗糖浓度和pH对大蒜胚性愈伤组织诱导的影响，蔗糖浓度设20、30和40g·L^-1，pH设5.4、5.8和6.2>

结果如表5所示：不同蔗糖浓度和pH对大蒜胚性愈伤组织诱导有影响，本发明选用的蔗糖30-40g·L^-1、pH值为5.8-6.2效果较好，特别是蔗糖为30g·L^-1、pH5.8时，愈伤组织诱导率最高，为90.18％。

表5不同蔗糖浓度和pH对大蒜胚性愈伤组织诱导的影响

注:表中不同字母表示在0.05水平上差异显著。

实施例5：

为了对比不同激素种类和浓度以及不同培养方式对大蒜胚性愈伤组织增殖的影响，挑选黄白色颗粒状、质地坚硬且易破碎的胚性愈伤组织，将其接入固体培养基和50mL三角瓶中(悬浮培养)，液体培养基体积为30mL。激素选用6-BA、KT、TDZ、NAA，具体浓度及组合见表6。每处理5瓶，测定愈伤组织接入前后的培养瓶重量。悬浮培养用HY-4A数显调速多用振荡器(常州市伟嘉仪器制造有限公司生产)，转速设定为180r/min，每7d更换1次新鲜培养基。4周后测定愈伤组织转出前后培养瓶重量，统计胚性愈伤组织的生长量和增殖倍数。

表6大蒜胚性愈伤组织增殖培养基

结果如表7所示：本发明所选用的液体培养中增重率最低的L3(1.5mg·L^-1>-1TDZ)仍然高于固体培养中增重率最高的S1，即本发明所选用的液体培养愈伤组织增殖效果更好；选用液体培养基对激素种类和浓度的要求略低，如L1或L2的组合均有较好的效果，优选的L1(1.0mg·L^-1>-1KT液体培养)增重率最大，达44.30％。悬浮培养4周后，愈伤组织增重情况见图1。

表7不同培养方式和激素对大蒜胚性愈伤组织增殖的影响

注:表中不同字母表示在0.05水平上差异显著。

实施例6：

为了对比不同激素种类和浓度对大蒜体胚萌发的影响，选择增殖后大小一致的胚性愈伤组织为材料，在添加6.5g·L^-1琼脂的固体培养基上培养，具体配方见表8。每处理3次重复，每重复10瓶，每瓶接种5g左右的愈伤团，每4周继代1次，光照下培养16周。观察体胚发育状况，统计再生根、苗数，计算萌发率。

萌发率(苗数/g)＝萌发苗数/胚性愈伤组织鲜重。

表8大蒜体细胞胚发育培养基

结果如表9和图2：本发明所选用的6-BA+KT体胚萌发率最高，优于对比组合，且苗正常；而6-BA+NAA的组合不仅萌发率较低，且有卷曲苗；KT+NAA的组合体胚萌发率同样较低，且部分体胚苗弱并稍有玻璃化。大蒜体细胞胚萌发情况见图5。

表9不同激素组合对大蒜体细胞胚发育的影响