BCR/ABL基因融合与ASS基因缺失检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种BCR/ABL基因融合与ASS基因缺失检测试剂盒，该试剂盒包括有染料标记的，针对ASS和ABL基因序列的第一组探针，针对BCR基因M‑BCR断裂位点上游基因序列的第二组探针，两组探针标记的染料的颜色都不同；所述两组探针为分别以人基因组DNA为模板，通过引物扩增得到的扩增产物。本发明FISH探针的长度是发明人经过大量实验，对实验结果进行比对和统计分析后得出的最优长度，能达到检测特异性和杂交时长之间的最优平衡，既能保证结果特异性和灵敏度，又能缩短杂交时间，使得检测能在7‑8个小时内完成，提高了检测效率。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种BCR/ABL基因融合与ASS基因缺失检测试剂盒。

背景技术

慢性粒细胞白血病(Chronic Myelogenous Leukemia,CML)是一种发生于造血干细胞的血液系统恶性克隆增生性疾病。在受累的细胞系中可找到费城染色体(Ph)或(和)BCR/ABL基因重排。由于t(9；22)(q34；q11.2)而产生的费城染色体或(和)BCR/ABL基因重排在血液肿瘤中具有重要的诊断和预后意义，出现于90％以上的CML、30％的成人急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia，ALL)、2％-10％的儿童ALL、以及少数的急性粒细胞白血病(Acute Myelogenous Leukemia，AML)和多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)患者。

位于22q11的BCR基因与位于9q34的ABL基因相互易位，形成BCR/ABL融合基因。BCR基因共23个外显子，主要有两种断裂热点：在CML中几乎都为M-BCR位点(跨越外显子12-16的58kb区域)，而在ALL中大约2/3为m-BCR位点(第一内含子的55kb区域)。ABL基因有1b、1a和2～11共12个外显子，上游与ASS基因相连，其断裂位于第1或第2内含子。因断裂点不一，BCR/ABL融合基因及其mRNA和蛋白产物呈多样，不同的融合产物与疾病的类型和疾病的进展相关，且具有不同的致癌能力。BCR/ABL融合基因是一种抗细胞凋亡的基因，具有高度酪氨酸激酶活性，激活多种信号传导途径，抑制细胞凋亡，使细胞过度增殖而使细胞调控发生紊乱。具有BCR/ABL融合基因的患者预后差，临床上可以根据患者是否存在BCR/ABL融合基因来选择性地使用分子靶向治疗药物。大约10-30％的患者在衍生的9号染色体上ABL/BCR融合基因出现部分或完全缺失，缺失区域位于ABL与BCR基因融合之处，可长达几MB，典型体现为包括ASS基因所在的区域。临床发现此区域出现缺失的患者意味着更短的无病生存期和总生存期，治疗效果及预后更差。因此，对BCR/ABL融合基因检测，能更好地指导患者分子靶向治疗及预后判断。

目前，常规的BCR/ABL融合基因检测方法主要包括以下3种：细胞遗传学检测、基于PCR方法的检测和FISH检测。细胞遗传学检测需培养细胞，耗时较长，只能检测中期的细胞，且成功率和灵敏度低，无法对Ph阴性但存在BCR/ABL融合基因的患者做出诊断和预后；基于PCR的检测如RT-PCR、Q-PCR等易污染，假阳性率高，且只能检测已知的断裂点，对未知或含少量转录本的BCR/ABL融合基因无法检出。FISH检测对病人外周血或骨髓的BCR/ABL融合基因具有极高的灵敏度和检测隐匿型易位的能力，其假阳性率远远低于PCR检测，能提供相对于核型分析更为可靠的分子遗传学证据，可用于预后判断、用药疗效、微小病灶残留及移植术后效果的监测。虽然目前FISH检测方法得到了广泛的应用和改良，但仍具有以下缺陷：(1)使用人工染色体制备的检测探针中存在较多的重复序列，影响杂交的特异性，同时造成较高的背景荧光；(2)检测步骤繁杂，探针序列过长，探针与样本杂交往往需要12-16h才能保证充分杂交，费时费力；(3)一些优化的探针序列过短，导致检测特异性降低且信号微弱难以被检测。因此，急需一种FISH检测方法，其探针不含重复序列、长度适宜，既能保证杂交反应的特异性和最佳的荧光检测强度，又能最大限度缩短FISH检测时长，提高检测特异性和检测效率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高和检测效率高的BCR/ABL融合基因检测试剂盒。

实现上述目的的技术方案如下。

一种BCR/ABL基因融合与ASS基因缺失检测试剂盒，包括有染料标记的，针对ASS和ABL基因序列的第一组探针，针对BCR基因M-BCR断裂位点上游基因序列的第二组探针，两组探针标记有染料，同一组探针的染料颜色相同，不同组探针的染料颜色不同；所述两组探针为分别以人基因组DNA为模板，通过引物扩增得到的扩增产物；

针对所述第一组探针的扩增引物为：选自SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14、SEQID NO.15和SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25和SEQ IDNO.26、SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30中的至少一对引物；

针对所述第二组探针的扩增引物为：选自SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32、SEQ IDNO.33和SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38、SEQID NO.39和SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49和SEQ IDNO.50、SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53和SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55和SEQID NO.56、SEQ ID NO.57和SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59和SEQ ID NO.60中的至少一对。

一种BCR/ABL基因突变检测试剂盒，包括有染料标记的，针对ABL基因序列的第一组探针，针对BCR全基因序列的第三组探针；两组探针标记的染料的颜色不同；所述两组探针为分别以人基因组DNA为模板，通过引物扩增得到的扩增产物；

针对所述第一组探针的扩增引物为：选自SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14、SEQID NO.15和SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25和SEQ IDNO.26、SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30中的至少一对引物；

针对所述第三组探针的扩增引物为：选自SEQ ID NO.61和SEQ ID NO.62、SEQ IDNO.63和SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65和SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.67和SEQ ID NO.68、SEQID NO.69和SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.71和SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.73和SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.75和SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.77和SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.79和SEQ IDNO.80、SEQ ID NO.81和SEQ ID NO.82、SEQ ID NO.83和SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.85和SEQID NO.86、SEQ ID NO.87和SEQ ID NO.88、SEQ ID NO.89和SEQ ID NO.90中的至少一对。

在其中的一个实施例中，所述第一组探针为由选自至少上述相应三对引物扩增得到的产物，第三组探针为由选自至少上述相应三对引物扩增得到的产物。

在其中的一个实施例中，所述第一组探针为由选自至少上述相应三对引物扩增得到的产物，所述第三组探针为由选自至少上述相应三对引物扩增得到的产物。

在其中的一个实施例中，得到的扩增产物的大小为100-500bp。

在其中一个实施例中，所述荧光染料选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、Cy5、LC RED705、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 750，且针对不同探针组的荧光染料互不相同。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明FISH探针是发明人经过序列比对之后，根据非重复且高度保守的序列设计引物扩增制备得来，具有很强的特异性，背景噪音更低。

(2)本发明FISH探针的长度是发明人经过大量实验，对实验结果进行比对和统计分析后得出的最优长度，能达到检测特异性和杂交时长之间的最优平衡，既能保证结果特异性和灵敏度，又能缩短杂交时间，使得检测能在7-8个小时内完成，提高了检测效率。

(3)常规的FISH探针标记方法不能是实现荧光信号的放大，因此需要较长的探针才能保证检测的灵敏度，从而导致杂交时间过长。本发明采用新的探针标记方法，能将探针上的荧光信号进行放大，大大提高检测灵敏度。本发明通过信号放大的探针标记方法与探针长度的优化，极大缩短了探针与目的基因充分杂交所需时长，提高了检测灵敏度和检测效率。

(4)本发明包含三组探针类型，不同探针类型的组合具有不同的检测效果：第一组探针和第二组探针联合使用，可区分BCR基因断裂位点，判断断裂类型，同时可检测ASS基因的缺失情况，为患者分子靶向治疗和预后判断提供更准确的依据；第一组探针和第三组探针联合使用，可检测ABL和BCR基因全部的变异类型，适合用于那些变异细胞比例较少的样本，如临床观察残留病灶时使用。

附图说明

图1是本发明试剂盒A信号计数指南-典型阳性细胞信号模式；

图2是本发明试剂盒信号计数指南-典型阴性细胞信号模式；

图3是本发明试剂盒B信号计数指南-典型阳性细胞信号模式。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例1试剂盒组成

本实施例所述的BCR/ABL融合基因检测试剂盒，主要包括有：

一、荧光染料标记的探针

所述探针包括有针对ASS和ABL基因的第一组探针、针对BCR基因M-BCR断裂位点上游基因序列的第二组探针和针对BCR全基因序列的第三组探针。所述探针以人基因组DNA为模板，利用90对特异性引物对进行PCR扩增反应而得到，其制备方法如下：

1、扩增引物的设计

为了检测9号染色体和22号染色体上ASS、ABL和BCR基因的变异情况，分别设计了3组扩增引物：针对ASS和ABL基因的第一组扩增引物、针对BCR基因M-BCR断裂位点上游基因序列的第二组扩增引物和针对BCR全基因序列的第三组扩增引物。所述扩增引物组的扩增区域分别为目标检测区域中非重复且高度保守的片段，片段长度大于1000bp。扩增引物相应的扩增产物长度在100-500bp之间，分别构成了第一组、第二组和第三组探针库。扩增引物序列信息及其相应的扩增产物见表1(注：1F/1R为一对引物，分别表示正向引物和反向引物；其他以此类推)。

表1扩增引物及扩增产物

引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，合成后的每条序列分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液，并做好标记。

2、探针库构建

利用上述设计的引物对，以人类基因组DNA为模板进行PCR扩增，相应的扩增产物分别构成了第一组、第二组和第三组探针库。

(1)人基因组DNA提取：根据本领域现有技术，可参考《分子克隆实验指导-第三版》(科学出版社)或按照市售外周血细胞DNA提取试剂盒产品说明书进行操作。

(2)配置PCR引物工作液：针对第一组探针库，将相应的扩增引物(1F/1R-15F/15R)分为3个扩增引物组，对ASS和ABL基因的3个非重复且高度保守区域进展扩增：分别取相应的扩增引物(1F/1R-5F/5R、6F/6R-10F/10R、和11F/11R-15F/15R)储存液50ul置于3支1.5ml离心管中，使用10mmol/L Tris Buffer配制成终浓度各为10pmol/mL的3支扩增引物工作液，相应做好标记；针对第二组探针库，将相应的扩增引物(16F/16R-30F/30R)分为3个扩增引物组，对BCR基因M-BCR断裂位点上游基因的3个非重复且高度保守区域进行扩增：分别取相应的扩增引物(16F/16R-20F/20R、21F/21R-25F/25R、和26F/26R-30F/30R)储存液50ul置于3支1.5ml离心管中，使用10mmol/L Tris Buffer配制成终浓度各为10pmol/mL的3支扩增引物工作液，相应做好标记；针对第三组探针库，将相应的扩增引物(31F/31R-45F/45R)分为3个扩增引物组，对BCR全基因的3个非重复且高度保守区域进行扩增：分别取相应的扩增引物(31F/31R-35F/35R、36F/36R-40F/40R、41F/41R-45F/45R)储存液50ul置于3支1.5ml离心管中，使用10mmol/L Tris Buffer配制成终浓度各为10pmol/mL的3支扩增引物工作液，相应做好标记。

(3)配置PCR扩增体系：分别进行上述9个体系的扩增，扩增体系试剂组成如下：

(4)PCR扩增：配置好体系后轻轻混合均匀，瞬时离心5-10s，按如下程序进行扩增：95℃5min，95℃30s，58℃30s，72℃30s，从第二步开始30个循环，72℃5min，4℃保持。

(5)产物鉴定和纯化：将针对ASS和ABL基因3个非重复且高度保守区域的扩增产物混合均匀，得到第一组探针库；将针对BCR基因M-BCR断裂位点上游基因3个非重复且高度保守区域的扩增产物混合均匀，得到第二组探针库；将针对BCR全基因的3个非重复且高度保守区域的扩增产物混合均匀，得到第三组探针库；通过2％琼脂糖凝胶电泳对两组探针库进行鉴定，切割大小在100-500bp之间的产物，并对产物进行回收，即得到第一组和第二组探针库，相应做好标记。

3、染料标记探针

本实施例优选Cy3(红色荧光)标记第一组探针，优选Alexa Fluor 488(绿色荧光)标记第二组探针，优选Alexa Fluor 488(绿色荧光)标记第三组探针。人工合成Cy3标记和Alexa Fluor 488标记的polyA序列，所述polyA序列包含1-30个碱基，优选的是包含10-20个碱基，更优选的是包含2-8个碱基，polyA序列末端修饰有链霉亲和素。将Cy3标记和AlexaFluor 488标记的polyA序列分别与修饰有生物素的第一组、第二组和第三组探针库混合(每100ug探针库加入20uL荧光标记的polyA序列)，于37℃缓慢摇动孵育30min，得到相应荧光标记的探针。探针经纯化和沉淀，溶解在TE缓冲液中，即获得红色标记的第一组探针和绿色标记的第二组及第三组探针，将探针于-20℃避光保存。

二、试剂盒其他组分

1、SSC缓冲贮存液(20×SSC，pH5.3)：氯化钠88g、柠檬酸钠44g、超纯水400mL，充分溶解混匀，室温下将溶液pH值调至5.3，用超纯水将溶液定容至500mL，0.45μm滤器过滤。

2、乙醇溶液(70％和85％)：无水乙醇700mL/850mL、超纯水300mL/150mL，充分混匀。

3、洗涤缓冲液Ⅰ：20×SSC(pH5.3)35mL、乙基苯基聚乙二醇(NP-40)3mL、超纯水912mL，充分混匀，室温下将溶液pH值调至7.0，用超纯水将溶液定容至1000mL，0.45μm滤器过滤。

4、洗涤缓冲液Ⅱ：20×SSC(pH5.3)100mL、乙基苯基聚乙二醇(NP-40)1mL、超纯水849mL，充分混匀，室温下将溶液pH值调至7.0，用超纯水将溶液定容至1000mL，0.45μm滤器过滤。

本实施例优选第一组探针和第二组探针联合使用，组成试剂盒A，用于检测BCR/ABL融合基因断裂类型以及ASS基因缺失情况；

本实施例优选第一组探针和第三组探针联合使用，组成试剂盒B，用于检测ABL和BCR基因全部的变异类型。

实施例2利用实施例1试剂盒A对临床样品进行检测

一、样本预处理

1、用肝素钠抗凝管采集患者外周血1-1.5ml，2000rpm离心5min；

2、弃上清，加入5-10ml 0.075M的KCl溶液，吹打均匀，37℃低渗处理30min；

3、加入1ml新鲜固定液(甲醇/冰醋酸3:1)，吹打均匀，静置5min；

4、2000rpm离心5min，弃上清；

5、加入10ml新鲜固定液(甲醇/冰醋酸3:1)，吹打均匀，静置10min；

6、2000rpm离心5min，弃上清；

7、加入10ml新鲜固定液(甲醇/冰醋酸3:1)，吹打均匀，2000rpm离心5min，弃上清；

8、重复步骤7两次，最后加10ul新鲜固定液(甲醇/冰醋酸3:1)重悬细胞；

9、将制备好的细胞悬液滴加到玻片上。

二、FISH检测

FISH检测主要包括预变性、变性、杂交和复染四个步骤，从杂交开始的操作步骤均需要在避光条件下进行：

1、准备工作：探针平衡至室温，涡旋混匀后置于微量离心机中离心2-3s；开启并预热杂交仪，将湿条浸入蒸馏水中备用(至少浸泡2h)，杂交时放入杂交仪；使用玻璃刀在切片反面圈出样本杂交区域。

2、预变性：将玻片在室温2×SSC液中浸泡2min，随后将玻片依次置于70％、85％、100％乙醇中脱水各2min。置于烤片机上2-5min烘干。

3、杂交(避光操作)：在玻片样本杂交区域加入10ul探针溶液(探针浓度15ng/ul，每一标准人份探针量，对应检测的样本面积约为20mm×20mm，样本区域较大的样本可根据实际情况增加用量)，盖上盖玻片，确保盖玻片下无气泡、探针均匀分布。使用封片胶覆盖盖玻片四周位置，形成闭合的密封圈。将切片放入已安装好湿条的杂交仪中，设置杂交反应程序：85℃变性8min，42℃杂交4h。

4、杂交后洗涤(避光操作)：开启水浴锅(76±1℃)，将洗涤缓冲液Ⅱ置于水浴锅预热。将杂交后的切片从杂交仪中取出，去除封片胶，置于室温的洗涤缓冲液Ⅰ中5min，洗掉盖玻片，再置于76±1℃的洗涤缓冲液Ⅱ中5min，期间可轻轻晃动切片1-3s；重复上述洗涤步骤1次，最后用洗涤冲液Ⅰ再重复洗涤一次，每种洗涤缓冲液重复洗涤时的时间与第一次用该缓冲液洗涤时时间相同。洗涤后将切片直立风干。

5、DAPI复染(避光操作)：在样本杂交区域加入10μL复染液，盖上盖玻片，室温避光5-10min后即可显微镜下观察荧光信号。DAPI复染后的切片也可置于-25℃至-18℃避光保存(保存时间不超过72h)，需要检测时将玻片放至室温后进行观察。

三、结果判定标准

本发明试剂盒A结果判定标准如下：

1、每例样本计数100个细胞，若阳性细胞数小于3个(3/100或＜3％)，该样本判定为阴性。

2、每例样本计数100个细胞，若阳性细胞数大于5个(5/100或＞5％)，该样本判定为阳性。

3、每例样本计数100个细胞，若阳性细胞数介于3-5个(3-5％)，需另一阅片人另外计数100个细胞。汇总两位阅片人计数细胞数与阳性细胞数，即总计200个细胞中，若阳性细胞总数小于8个(＜4％)，该样本判定为阴性，若阳性细胞总数大于等于8个(≥4％)，该样本判定为阳性。

细胞的阳性与阴性判定：

上下移动显微镜视野，查找所有存在于细胞核内的信号。

ABL为红色信号(Red,O)，BCR为绿色信号(Green,G)，红色信号和绿色信号重叠或者接触为融合信号(F)，代表BCR-ABL或者ABL-BCR融合基因。

1、以下信号模式可判定为BCR/ABL融合基因阳性细胞(详见图1)：

(1)M型断裂(M-BCR)：典型Ph染色体易位的间期核中出现的是2个红色、1个绿色和1个红绿融合杂交信号(2R1G1F)；

(2)m型断裂(m-BCR)：典型Ph染色体易位的间期核中出现的是1个红色、1个绿色和2个红绿融合杂交信号(1R1G2F)；

(3)M型断裂伴有变异的Ph染色体出现：间期核中出现的是2个红色、1个绿色和2个红绿融合杂交信号(2R1G2F)；

(4)m型断裂伴有变异的Ph染色体出现：间期核中出现的是1个红色、1个绿色和3个红绿融合杂交信号(1R1G3F)；

(5)M型断裂伴有ASS基因缺失：间期核中出现的是1个红色、1个绿色和1个红绿融合杂交信号(1R1G1F)；

(6)m型断裂伴有ASS基因缺失：间期核中出现的是1个红色、2个绿色和1个红绿融合杂交信号(1R2G1F)。

2、以下信号模式可判定为BCR/ABL融合基因阴性细胞(详见图2)：间期核中出现的是2个红色和2个绿色随机分散的4个杂交信号(2R2G)。

注：附图中黑色代表红色点，白色代表绿色点。

四、检测结果分析

利用实施例1试剂盒A对15例白血病患者外周血样本(编号1-15)进行检测，同时选用K562细胞株作为阳性对照、NB4细胞株作为阴性对照，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。分别各取约2000个K562和NB4细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为5份，编号16-20和21-25。具体检测结果如表3：

表3样本检测结果

由上述检测结果可知，本发明试剂盒对BCR-ABL融合基因的检测具有很好的灵敏度和特异性，能实现白血病患者外周血样本的检测和断裂位点分型，同时还能检测ASS基因的缺失情况。本实施例所有的阳性对照K562细胞均为BCR-ABL融合基因阳性，而所有的阴性对照NB4细胞均为BCR-ABL融合基因阴性。说明本试剂盒设计的探针能特异性地与目标基因序列发生杂交反应，产生的荧光信号强并且稳定，保证了检测结果的特异性和准确性。

实施例3利用实施例1试剂盒B对临床样品进行检测

一、样本预处理

与实施例2一致

二、FISH检测

与实施例2一致。

三、结果判定标准

本发明试剂盒B结果判定标准如下：

1、每例样本计数100个细胞，若阳性细胞数小于3个(3/100或＜3％)，该样本判定为阴性。

2、每例样本计数100个细胞，若阳性细胞数大于5个(5/100或＞5％)，该样本判定为阳性。

3、每例样本计数100个细胞，若阳性细胞数介于3-5个(3-5％)，需另一阅片人另外计数100个细胞。汇总两位阅片人计数细胞数与阳性细胞数，即总计200个细胞中，若阳性细胞总数小于8个(＜4％)，该样本判定为阴性，若阳性细胞总数大于等于8个(≥4％)，该样本判定为阳性。

细胞的阳性与阴性判定：

上下移动显微镜视野，查找所有存在于细胞核内的信号。

ABL为红色信号(Red,O)，BCR为绿色信号(Green,G)，红色信号和绿色信号重叠或者接触为融合信号(F)，代表BCR-ABL或者ABL-BCR融合基因。

1、以下信号模式可判定为BCR/ABL融合基因阳性细胞(详见图3)：

(1)典型Ph染色体易位：间期核中出现的是1个红色、1个绿色和2个红绿融合杂交信号(1R1G2F)；

(2)变异Ph染色体易位：间期核中出现的是2个红色、2个绿色和1个红绿融合杂交信号(2R2G1F)；

(3)9号染色体断裂点附近的ABL和BCR部分序列同时缺失：间期核中出现的是1个红色、1个绿色和1个红绿融合杂交信号(1R1G1F)；

(4)9号染色体断裂点附近的ABL部分序列缺失：间期核中出现的是1个红色、2个绿色和1个红绿融合杂交信号(1R2G1F)；

(5)9号染色体断裂点附近的BCR部分序列缺失：间期核中出现的是2个红色、1个绿色和1个红绿融合杂交信号(2R1G1F)；

2、以下信号模式可判定为BCR/ABL基因突变阴性细胞(详见图2)：间期核中出现的是2个红色和2个绿色随机分散的4个杂交信号(2R2G)。

注：附图中黑色代表红色点，白色代表绿色点。

四、检测结果分析

利用实施例1试剂盒B对15例白血病患者外周血样本(编号26-40)进行检测，同时选用K562细胞株作为阳性对照、NB4细胞株作为阴性对照，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。分别各取约2000个K562和NB4细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为5份，编号41-45和46-50。具体检测结果如表3：

表4样本检测结果

由上述检测结果可知，本发明试剂盒对BCR-ABL基因突变的检测具有很好的灵敏度和特异性，能实现白血病患者外周血样本9号染色体和21号染色体各种变异类型的检测。本实施例所有的阳性对照K562细胞均为BCR-ABL基因突变阳性，而所有的阴性对照NB4细胞均为BCR-ABL基因突变阴性。说明本试剂盒设计的探针能特异性地与目标基因序列发生杂交反应，产生的荧光信号强并且稳定，保证了检测结果的特异性和准确性。

实施例4杂交时长对试剂盒检测效果的影响

一、杂交时间

本发明试剂盒探针长度和染料标记方法的设计是发明人经过大量实验，对实验结果进行比对和统计分析后得出的最优方案，能达到检测特异性和杂交时间之间的最优平衡，既能保证结果特异性和灵敏度，又能缩短杂交时间，提高检测效率。

为验证杂交时间对本发明检测结果的影响，本实施例以试剂盒A为例，设置了不同杂交时间的4个实验组，具体见表5，所用检测探针和试剂与实施例1试剂盒A一致。

表5杂交时长

分组实验组1实验组2实验组3实验组4杂交时间2h4h8h16h

二、样本检测

采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对白血病患者外周血样本51-65进行检测，其中各实验组杂交时间与表5杂交时间一致，具体实验结果如下：

表6杂交时间对检测结果的影响

对比4个实验组的检测结果可知，实验组6使用100-500bp的探针，在4h内即可与样本目标基因充分杂交，实现样本的检测并保证结果的特异性和准确性。2h的杂交时间由于探针不能与样本充分杂交，而导致一些阳性细胞漏检，造成假阴性结果，且检测结果不稳定；而8h和16h的杂交时长检测结果与4h完全一致，且荧光信号强度基本一致。说明本发明探针长度和染料标记方式能显著减短探针与目标基因的杂交时间，提高检测效果，同时保证检测的特异性和准确性。杂交时间对试剂盒B检测结果的影响与试剂盒A一致，具体数据省略。

实施例5探针长度对试剂盒检测效果的影响

一、探针长度

本发明试剂盒探针长度和染料标记方法的设计是发明人经过大量实验，对实验结果进行比对和统计分析后得出的最优方案，能达到检测特异性和杂交时长之间的最优平衡，既能保证结果特异性和灵敏度，又能缩短杂交时间，提高检测效率。

为验证探针长度对本发明检测结果的影响，本实施例以试剂盒A为例，设置了不同探针长度的4个实验组，具体见表7，4个实验组扩增区域位置相同。所用检测探针制备方法和试剂与实施例1试剂盒A一致。

表7探针长度

分组实验组5实验组6实验组7实验组8探针长度20-100bp100-500bp500-1000bp＞1000bp

二、样本检测

采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对白血病患者外周血样本61-75进行检测，具体实验结果如下：

表8探针长度对检测结果的影响

对比4个实验组的检测结果可知，实验组6使用100-500bp的探针，在4h内即可与样本目标基因充分杂交，实现样本的检测并保证结果的特异性和准确性。探针长度过短(实验组5)，会降低检测特异性，造成较高的背景噪音，同时产生的荧光信号很弱，造成结果的误判；探针长度过长(实验组7和8)会降低细胞对探针的摄取能力，同时延长杂交所需要的时间，导致在4h探针不能与目标基因充分杂交，影响检测结果的准确性和稳定性。探针长度对试剂盒B检测结果的影响与试剂盒A一致，具体数据省略。

实施例6构建探针库引物对种类和数量对试剂盒检测效果的影响

一、引物对的选择

本发明试剂盒包括三组探针库，每组探针库分别由15对引物扩增得到，扩增区域分别为目标检测区域中非重复且高度保守的片段，本发明针对每组探针库的构建分别优选了目标检测区域中非重复且高度保守的3个扩增区域，针对每个区域设计了5对特异性基因。

为检测构建探针库所使用的引物对种类和数量对本发明检测结果的影响，本实施例以第一组探针库的构建为例，本实施例以试剂盒A为例，设置了3个实验组，具体见表9，所用检测探针制备方法和试剂与实施例1一致。

表9引物对的选择

二、样本检测

采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对白血病患者外周血样本76-90进行检测，具体实验结果如下：

表10构建探针库引物对种类和数量对检测结果的影响

比较上述3个实验组的检测结果可知，当目标基因每个扩增区域选用1对、2对和5对扩增引物，即探针库使用3对、6对和15对引物进行探针库构建时，均可完成检测。当使用6对或以上引物对进行建库时，其特异性和稳定性都很好。其中，当使用全部15条的建库引物对时，信号更强更稳定，检测效果最佳。其他针对第一组、第二组和第三组探针库建立引物对种类和数量的选择实验结果与上述结果一致，具体数据省略。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。