一种解淀粉芽孢杆菌在酱香风味烟上的应用

摘要

本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌在酱香风味烟上的应用，是以保藏号为CGMCC No.8720的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)为生产菌种，生产酱香风味烟。本发明具有改善卷烟香型、丰富香烟种类，提高市场竞争力的特点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种解淀粉芽孢杆菌的应用，特别是一种解淀粉芽孢杆菌在 酱香风味烟上的应用。

背景技术

酱香风味的研究包括酱香的香气成分的分析、形成机制的以及产酱香功 能菌的分离。

最初，横冢认为4-乙基愈创木酚为酱油的主体香味物质。以此为依据， 1964年到1966年轻工部组织科技人员在贵州茅台酒厂进行研究试点，首次 报道了不同风格酒的香气成分，最早提出4-乙基愈创木酚是茅台酒的主体 香成分。然而，直到1997年胡国栋在茅台酒中监测到其他酚类，推翻了之 前的4-乙基愈创木酚是茅台酒的主体香成分的观点。1982年，贵州轻工业 局对三种单型酒的气相色谱分析，认为酱香为复合香，包括前香和后香。周 良彦从酱香就中检测到7种呋喃酮，3种麦芽酚，8种吡喃酮，4种环戊二 烯酮，1种环戊烯酮，并在文章中提出酱香型白酒的主体香味物质可能主要 是呋喃类以及呋喃类衍生物。季克良，郭坤亮等用气相色谱在酱香型白酒中 检测出963个峰，其中有酸类，酯类，醇类，酮类，醛类等。赵书圣从酒醅 中测出9种呋喃类物质，包括大量糠醛。王传荣研究表明，茅台酒的香味成 分多达1400余种,但酱香型白酒的主体香味成分至今尚未定论。

Maillard L.C.于1912年提出美拉德反应，又称为羰氨反应，是以羰 基化合物(还原糖)和氨基化合物(氨基酸和蛋白质)为反应物，在高温条 件发生的复杂的化学反应并生成棕色或黑色的大分子物质类黑精或拟黑精， 并附带产生一定香味的“非酶促褐变反应”。美拉德反应最终会生成棕褐色 的化合物。大量的研究表明，在生产酱香型白酒的过程中，大曲堆积时会发 生美拉德反应，但是，已经有研究证明，酱香型白酒中所发生的美拉德反应 与其他食物中发生的“非酶促反映”不完全一致，它更加依赖于产酱香功能 的菌。

对产酱香功能菌的研究最早开始于上世纪60年代，有研究人员就对茅 台酒高温曲的微生物进行了研究，认为茅台酒的曲中含有大量的细菌，其中 芽孢杆菌数量众多，并用这些芽孢杆菌发酵碎麦，可以产生像茅台酒曲的香 味。1975年贵州轻工业研究所从酱香酒曲中分离坚定出17株枯草芽孢杆菌， 其中有5株能产酱香。1982年贵州轻工业研究所从酱香酒酒曲中分离出95 种微生物菌株，其中6株细菌和7株酵母菌能产酱香。1992年谢和等从茅 台高温大曲中分离出产酱香的嗜热芽孢杆菌。2012年，罗建超等人从贵州 省赤水县茅台酒厂的不同生产环节中选择25个采样时间点，无菌操作采集 样品25份，从中筛选出产酱香风味物质的菌株25株。本发明的S1011菌株 就是从茅台酒厂的制曲车间里分离出的。罗建超等人对S1011菌株做了形态 学、生理生化以及分子鉴定，确定S1011菌株是解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

贵州是我国烤烟四大产区之一,仅次于云南,其产量、质量都在全国占有 重要的地位。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种解淀粉芽孢杆菌在酱香风味烟上的应用。 本发明具有改善卷烟香型、丰富香烟种类，提高市场竞争力的特点。

本发明的技术方案：一种解淀粉芽孢杆菌在酱香风味烟上的应用， 是以保藏号为CGMCC No.8720的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)为生产菌种，生产酱香风味烟，所述解淀粉芽孢 杆菌于2014年01月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

前述的解淀粉芽孢杆菌在酱香风味烟上的应用，所述风味香烟具有酱香 风味。

前述的解淀粉芽孢杆菌在酱香风味烟上的应用，所述风味烟的制备方法 包括如下步骤：

步骤一：活化；将所述解淀粉芽孢杆菌接种到分离培养基上，经多次转 接以活化菌种；

步骤二：发酵；挑取步骤一中的菌落接种到种子培养基，制作菌悬液， 按1-3％的比列接种到发酵培养基，以30℃-35℃-40℃-45℃-50℃-55℃程序 升温各发酵15-30h；

步骤三：提取；往发酵后的培养基中加入无水乙醇溶液，浸提8-15h， 再将提取液以3000-4000r/min离心10-30min；

步骤四：喷加提取液；按烤烟质量的0.01-1％往烟叶中喷施提取液，并 混匀；

步骤五：干燥；将喷加了提取液的烤烟放入30-40℃干燥箱中至完全干 燥。

前述的解淀粉芽孢杆菌在酱香风味香上的应用，所述步骤一中，是将解 淀粉芽孢杆菌接种到牛肉膏蛋白胨平板上。

前述的解淀粉芽孢杆菌在酱香风味香上的应用，所述步骤一中，转接次 数为2-3次。

前述的解淀粉芽孢杆菌在酱香风味烟上的应用，所述步骤二中，是选择 步骤一中的单菌落接种到种子培养基，按2％的比例接种到发酵培养基中， 并升温各发酵24h。

前述的解淀粉芽孢杆菌在酱香风味烟上的应用，所述步骤三中，是浸提 12h后，再将提取液以4000r/min离心20min。

前述的解淀粉芽孢杆菌在酱香风味烟上的应用，所述步骤四中，按烟叶 的质量百分比喷加提取液的量为0.1％。

前述的解淀粉芽孢杆菌在酱香风味烟上的应用，所述步骤五中，干燥温 度为35℃。

一种酱香风味的烟，该酱香风味烟由前述方法制得。

本发明的有益效果：

本发明主要利用解淀粉芽孢杆菌发酵的方式制作酱香风味烟，大大降低 了生产成本，目前，市场上销售的酱香烟其酱香主要来源于酱香酒，其成本 较高，而本发明为了降低成本，利用产酱香解淀粉芽孢杆菌发酵产香，达到 了降低成本的目的，并且利用本发明的生产方式可以使酱香留香更持久。

本发明在贵州茅台酒厂制曲车间分离到一株解淀粉芽孢杆菌，其于2014 年1月保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为 北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.8720，gyrB基因序列号为gb|DQ309311.1。名称为：解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens)S1011。

一、S1011菌株的分离方法

(一)采样的地点

贵州茅台酒厂制曲车间

(二)解淀粉芽孢杆菌S1011的分离步骤

1、先称取样品10g放入盛有90mL无菌水的三角瓶中，充分振荡均匀， 制成10-1的菌悬液。再稀释成10-2-10-7不同稀释度的样品悬液，选择10-3 至10-74个稀释度涂布于分离培养基平板中。30℃倒置培养24h。挑取单 菌落用无菌生理盐水适当稀释后经平板划线纯化，简单染色镜检为纯种后接 种于牛肉膏蛋白胨固体培养基斜面，30℃恒温培养24h，4℃冰箱保存备用。

2、将分离得到的菌株经两次活化，接种于种子培养基(50mL/250mL)， 30℃、150r/min摇床培养24h，按2％的量接种于已灭菌发酵培养基，30℃ -35℃-40℃-45℃-50℃-55℃升温发酵各24h，发酵结束后筛选出产香菌株， 对初筛获得的S1011菌株进行多次重复纯种发酵，确定其是发酵结果稳定的 产酱香的细菌。

(三)主要培养基

分离培养基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L， 自来水1000mL,pH7.2-7.4，121℃，0.1Mpa，灭菌30min。

种子培养基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，自来水1000mL,pH 7.2-7.4，121℃，0.1Mpa，灭菌30min。

发酵培养基：黄豆用水浸泡3-8h，去皮，分装三角瓶(100g/500mL)， 121℃，0.1Mpa，灭菌30min。

(四)菌种的保种与传代

用15×150mm的试管，盛牛肉膏蛋白胨固体培养基5mL，做成斜面，接 种细菌，28℃培养2-3天，置4℃保存，3个月转种一次。

(五)菌种的形态特征

将本发明菌种接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上，30℃，培养 16-18h，菌体呈杆状，两端钝圆，细胞大小为0.7-0.8x1.8-3.0um，革兰氏 阳性。芽孢呈圆形或柱形，芽孢近中生，孢囊不膨大。

(六)细菌的生理生化特征

本发明的菌种能利用多种糖，如D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露醇、L-阿 拉伯糖。耐盐性为2％-10％，生长温度为10℃到55℃。VP反应呈阳性。能生 成氧化酶、接触酶、淀粉酶。

(七)分子鉴定

对该菌的gyrB基因进行PCR扩增，回收扩增产物测序，序列与GenBank 数据库中已登记的序列进行同源性比较，该菌株的gyrB基因序列与解淀粉 芽孢杆菌同源性达99％。

(八)鉴定结果

参照伯杰氏细菌鉴定手册描述，并结合分子鉴定的结果，将这一菌株鉴 定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

二、实验例

按烟叶的质量百分比喷加提取液的量分别为0.01％、0.1％和1％，按照本 发明相同的方法制备出3批香烟，如表1所示，并给专家品评。

品评结果显示，实验组1和2只有较淡的酱香味，几乎被烟的本味掩盖。 实验组3的整体效果较好，酱香味浓郁，且几乎没有杂味，酱香味和烟的本 味能够很好的融合，整体香味较和谐。实验组4和5除了有浓郁的酱香味及 烟的本味外，还有大量杂味，影响了整体的味道。经品评，最终选择实验组 3为最佳的结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的 依据。

本发明的实施例

实施例1：一种解淀粉芽孢杆菌在风味香烟上的应用，是以保藏号为 CGMCC No.8720的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)为生产 菌种，然后根据下列步骤生产：

步骤一：活化；将所述解淀粉芽孢杆菌接种到牛肉膏蛋白胨平板上，经 2次转接以活化菌种；

步骤二：发酵；挑取步骤一中的菌落接种到种子培养基，制作菌悬液， 按2％的比列接种到100g发酵培养基，以30℃-35℃-40℃-45℃-50℃-55℃ 升温方式发酵24h；

步骤三：提取；往发酵后的培养基中加入100mL无水乙醇溶液，浸提 12h，再将提取液以4000r/min离心20min；

步骤四：喷加提取液；按烤烟质量的0.1％往烟叶中喷施提取液，并混 匀；

步骤五：干燥；将喷加了提取液的烤烟放入35℃干燥箱中至完全干燥。

实施例2：一种解淀粉芽孢杆菌在风味香烟上的应用，是以保藏号为 CGMCC No.8720的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)为生产 菌种，然后根据下列步骤生产：

步骤一：活化；将所述解淀粉芽孢杆菌接种到牛肉膏蛋白胨平板上，经 3次转接以活化菌种；

步骤二：发酵；挑取步骤一中的菌落接种到种子培养基，制作菌悬液， 按1％的比列接种到100g发酵培养基，以30℃-35℃-40℃-45℃-50℃-55℃ 升温方式发酵15h；

步骤三：提取；往发酵后的培养基中加入100mL无水乙醇溶液，浸提 8h，再将提取液以3000r/min离心30min；

步骤四：喷加提取液；按烤烟质量的0.01％往烟叶中喷施提取液，并混 匀；

步骤五：干燥；将喷加了提取液的烤烟放入30℃干燥箱中至完全干燥。

实施例3：一种解淀粉芽孢杆菌在风味香烟上的应用，是以保藏号为 CGMCC No.8720的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)为生产 菌种，然后根据下列步骤生产：

步骤一：活化；将所述解淀粉芽孢杆菌接种到牛肉膏蛋白胨平板上，经 4次转接以活化菌种；

步骤二：发酵；挑取步骤一中的菌落接种到种子培养基，制作菌悬液， 按3％的比列接种到100g发酵培养基，以30℃-35℃-40℃-45℃-50℃-55℃ 升温方式发酵30h；

步骤三：提取；往发酵后的培养基中加入100mL无水乙醇溶液，浸提 15h，再将提取液以4500r/min离心10min；

步骤四：喷加提取液；按烤烟质量的1％往烟叶中喷施提取液，并混匀；

步骤五：干燥；将喷加了提取液的烤烟放入40℃干燥箱中至完全干燥。

实施例4：一种酱香风味的烟，该酱香风味烟由上述方法制得。

SEQUENCE LISTING

<110> 贵州大学

<120> 一种产酱香的解淀粉芽孢杆菌及其在酱香风味烟上的利用

<130> 2017

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1171

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢杆菌

<400> 1

ggaagcggat ataaagtatc cggcggtctt cacggtgttg gggcgtctgt cgtaaacgcc 60

ttatcgacca ctcttgacgt tacggttcat cgtgacggga aaatccatta tcaggcgtat 120

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agcaacattt attctttcac gaataacatc aacacatacg aaggcggcac gcacgaagcc 540

ggatttaaaa ccggtttgac ccgtgtcata aacgactatg caagaagaaa agggattttc 600

aaagaaaatg atccgaatct gagcggtgat gatgtgagag aagggctgac tgccatcatt 660

tcaattaagc accctgatcc gcaattcgaa gggcagacga aaacgaagct cggcaactct 720

gaagcgagaa cgattactga tacgctgttt tcttccgcac tggaaacatt ccttcttgaa 780

aatccggact cagcccgtaa aatcgttgaa aagggcttaa tggccgcaag agcgcggatg 840

gcggcgaaaa aagcgcggga attgacccgg cgtaaaagcg cacttgagat ttccaatttg 900

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ctgccgctgc ggggtaagat tctgaacgtt gagaaagcaa gacttgataa gattctctca 1080

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