一种可体外保持骨髓间充质干细胞多能性的方法

摘要

本发明公开了一种可体外保持骨髓间充质干细胞多能性的方法，包括以下步骤：1)提取、原代培养和传代培养骨髓间充质干细胞；2)通过摩擦取向与附生结晶相结合的方法制备表面具有取向微结构的复合膜培养基底；3)在步骤2)制备的复合膜培养基底上培养骨髓间充质干细胞。本发明所述方法操作简单、成本低、易于大面积实施，可用于大批量获得具有多向分化潜能的骨髓间充质干细胞，在组织工程领域具有很高的潜在临床应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及组织工程领域。更具体地，涉及一种可体外保持骨髓间充质干细胞多能性的方法。

背景技术

针对临床器官移植面对的可移植器官匮乏和异体移植排异反应大的问题，研究者们致力于人工组织和器官的研究。由于骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal MarrowStem Cells,BMMSCs)可以向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等多种细胞分化而受到了研究者们的广泛关注。但是BMMSCs用于临床治疗首先需要解决的一个问题就是如何获得足够数量的BMMSCs。人体骨髓中BMMSCs数量只占0.001％-0.01％，远远少于临床治疗所需的干细胞数量，所以要想将BMMSCs用于临床治疗方面，必须要经过体外增殖这一过程。最初的临床研究是通过收集患者的自体干细胞，体外扩增培养数周达一定数量后再使用，然而自体干细胞在应用过程中逐渐暴露了诸多不便，例如扩增能力个体差异大、潜在的肿瘤细胞污染风险、不能及时适应病情的需要等，从而严重制约了自体干细胞的使用，并且由于生长环境的改变，体外培养过程中干细胞很容易老化，即出现细胞形态改变、内稳态破坏以及多能性降低的情况，以致最终失去干细胞多能性，失去临床应用的价值，所以在BMMSCs体外增殖培养过程中保持其良好生长状态尤其是多向分化潜能就变得非常重要。

BMMSCs体外培养过程中主要受到相邻细胞和所接触培养基底的直接作用，而培养基底由于其化学组成、拓扑结构、机械性能、表面生物活性分子等因素的复杂性而受到了研究者们的广泛关注与深入研究。从形态学上分析原代提取的BMMSCs贴壁生长，呈长梭形，形态均一，光学显微镜下观察细胞较为立体。随着培养时间增长、传代次数增加，BMMSCs会出现细胞尺寸变大、变宽、细胞核增大、伪足增多、形态多样化，光学显微镜下也较难观察出其立体结构。研究发现骨髓间充质干细胞形态的变化对于细胞是否老化是具有一定参考价值的，所以有研究者利用拓扑结构反应(Topographic Reaction)的概念，通过控制培养基底表面微结构从而调控骨髓间充质干细胞的形态和多能性，且取得了一些初步研究结果(McMurray R J,Gadegaard N,Tsimbouri P M,et al.Nanoscale surfaces for thelong-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency[J].Nature materials,2011,10(8):637-644.)。

现已报道的研究较多的制备表面微结构的方法主要包括传统光刻技术、微接触印刷、喷墨印刷、自组装方法和静电纺丝技术等，但这些技术虽然在基础研究中应用较多，应用于临床研究仍然有很多问题需要解决。传统光刻技术与其他几种方法相比，虽然对仪器设备要求低，但其分辨率较低；微接触印刷等方法制备的微结构虽然分辨率较光刻法有所提高，但实现大面积制备较为困难；而静电纺丝技术不仅需要高压电源设备，对材料及环境要求较高而且制备所得表面微结构可控性较差；自组装方法制备的表面微结构虽然分辨率可调范围大，但通常稳定性较差、难以大面积制备。所以要想通过控制培养基底表面微结构从而达到体外促进BMMSCs保持多能性的目的，并且这种培养基底可以实现低成本、大批量制备从而满足临床应用需求，还需要探索新的方法。

因此，需要提供一种通过控制基底表面的取向微结构在骨髓间充质干细胞体外扩增培养过程中保持其多向分化潜能的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以在骨髓间充质干细胞体外增殖培养的过程中保持骨髓间充质干细胞多能性的方法。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

本发明一种可体外保持骨髓间充质干细胞多能性的方法，包括以下步骤：

1)骨髓间充质干细胞的提取、原代培养和传代培养；

2)制备表面具有取向微结构的复合膜培养基底；

3)在步骤2)制备的复合膜培养基底上培养骨髓间充质干细胞。

进一步地，所述骨髓间充质干细胞可以来源于鼠、兔、人及其他各类动物骨髓。

进一步地，所述骨髓间充质干细胞的提取可以采用全骨髓培养法，也可采用梯度离心法等方法提取。

进一步地，所述原代培养是在35-40℃、5％CO₂细胞培养箱中培养，24-48小时内首次半换液，36-72小时内首次全换液，之后每24-48小时换液一次。

所述传代培养是待细胞融合比例达80％及以上，用胰蛋白酶按每10⁵-10⁶个细胞0.5ml-1ml胰蛋白酶比例25-40℃消化1-2分钟至细胞收缩变圆，之后用培养基中和，吹打下细胞，于750-1000rpm室温离心3-10分钟，按1:2至1:4比例传代，后放于35-40℃、5％CO₂细胞培养箱中培养，每36-48小时换液。

进一步地，所述传代培养是传代培养至第2-5代。

进一步地，所述骨髓间充质干细胞的提取、原代培养和传代培养所用的培养基为α-MEM，DMEM或DMEM/F12，所述培养基中含有5-15％胎牛血清(FBS)，0.5-2％青霉素-链霉素双抗(P/S)。

进一步地，所述2)步骤是利用摩擦取向与附生结晶相结合的方法：首先，在温度低于聚合物熔点的热台上在基底上以恒速恒力摩擦聚合物棒；之后降至室温，于生物高分子溶液中提拉负载聚合物的基底，得到生物高分子/聚合物复合膜；最后在低于生物高分子材料熔点温度5-15℃加热制备的复合膜基底实现附生结晶，得到大面积表面具有取向微结构的复合膜培养基底。通过本方法制备得到的复合膜基底表面微结构的凹槽深度可达50nm及以上，可以诱导骨髓间充质干细胞大面积取向生长。

其中，所述基底可为载玻片、盖玻片等玻璃材质材料，且使用前应用食人鱼洗液等浸泡清洗。

所述聚合物可以为聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚苯乙烯等，且摩擦过程中热台加热温度低于聚合物熔点，具体视聚合物种类而定。

所述生物高分子为聚己内酯、聚乳酸等生物相容性好的高分子材料，且提拉成膜过程中高分子溶液浓度和所用溶剂视聚合物种类而定；所述聚己内酯浓度为0.1-0.01g/ml，溶剂为三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、二甲基亚砜；聚乳酸浓度为0.2-0.01g/ml，溶剂为三氯甲烷、二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、四氢呋喃；后处理加热过程中热台温度低于高分子材料熔点温度5-15℃，具体视高分子材料种类而定。

进一步地，步骤3)所述骨髓间充质干细胞的接种密度为2000-10,000个/平方厘米；培养条件为35-40℃，5％CO₂细胞培养箱中培养，每36-48小时更换新鲜培养基一次。

本发明骨髓间充质干细胞在复合取向膜基底上培养生长过程中，由于复合膜基底的表面取向微结构和机械硬度等因素共同作用，使得骨髓间充质干细胞培养达4周时在形态上仍然保持骨髓间充质干细胞典型形态，功能上仍然保持其多向分化潜能，且细胞增殖活力较好。

本发明的有益效果如下：

本发明操作简单，原料价廉易得，且不需要大型设备，经济投入小，可以实现获得大面积具有良好增殖活力的骨髓间充质干细胞的目的。

本发明可以为组织工程研究和骨髓间充质干细胞研究提供更多的依据，也为骨髓间充质干细胞的临床应用提供了更多可能性。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1示出实施例1中表面具有取向微结构的培养基底的制备过程与骨髓间充质干细胞培养过程的示意图。

图2a示出实施例1制备的表面具有取向微结构的复合培养基底的偏光显微镜图像(右上角为摩擦诱导取向部分)；2b示出实施例1制备得到表面具有取向微结构的复合培养基底的原子力显微镜高度图像。

图3a示出实施例1中在表面具有取向微结构的培养基底上生长的骨髓间充质干细胞荧光共聚焦图像，3b为表面没有取向微结构培养基底上干细胞(对照组)，(蓝色：细胞核；绿色：肌动蛋白)。

图4示出实施例1中骨髓间充质干细胞在表面具有取向微结构的培养基底上培养4周后qRT-PCR数据，以在表面没有取向微结构的基底上培养4周的干细胞作为对照(Nanog，Sox-2，Pou5f1为干细胞多能性标志基因，以管家基因GAPDH为参照)。

图5a-b示出实施例1中第3代骨髓间充质干细胞成骨与成脂诱导光学图像(a.成骨，b.成脂)；图5c-d示出实施例1中在表面具有取向微结构的培养基底上培养4周的骨髓间充质干细胞成骨与成脂诱导光学图像(c.成骨，d.成脂)。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例1一种可体外保持骨髓间充质干细胞多能性的方法

一种可以体外保持骨髓间充质干细胞多能性的方法，主要包括以下内容：

1)利用3周SD大鼠，断颈分离出股骨和胫骨，在无菌操作台中于PBS(pH 7.4)中进一步除去附着的肌肉组织；除去骨两端，用5毫升注射器吸取足量α-MEM(含10％FBS，1％P/S)培养基将全骨髓吹出，直至骨髓腔发白，将全骨髓用2毫升注射器吹散；转移入37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养，48小时后首次半换液，72小时后首次全量换液，之后每48小时换液一次；待细胞融合至80-90％，用胰蛋白酶按照每10⁶细胞1ml胰蛋白酶比例37℃消化1分钟，之后用α-MEM(含10％FBS，1％P/S)培养基中和，吹打下细胞，于800rpm室温离心5分钟，按1:3比例传代，后放于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养，每48小时换液，待融合达80％-90％，重复传代操作，至骨髓间充质干细胞第三代。

2)在280℃热台上于食人鱼洗液处理过的干净载玻片上摩擦聚四氟乙烯(PTFE)棒，得到负载有取向PTFE层的载玻片基底；在数均分子量为80,000、浓度为0.02g/ml的聚己内酯(PCL)的三氯甲烷溶液中快速提拉负载有取向PTFE层的载玻片基底，得到了PCL/PTFE取向复合膜；待溶剂蒸发后，于45℃上加热2小时，促进高分子聚合物进一步结晶，最终得到了PCL/PTFE取向复合培养基底(具体步骤如图1所示)；作为对比，未取向基底则直接在同浓度PCL的三氯甲烷溶液中提拉经食人鱼洗液处理的干净载玻片，待溶剂挥发后，于45℃热台上处理2h，最终得到表面没有取向微结构的PCL薄膜基底。

比较表面具有取向微结构的复合培养基底和表面没有取向微结构培养基底的结构，如图2所示，从图2a的偏光显微镜图像中可以看出，与PCL本身的球晶结构相比，在取向聚四氟乙烯分子诱导下PCL沿着PTFE取向方向形成片晶，结晶较均匀，高分子材料成膜性好；从图2b的表面具有取向微结构的复合培养基底的原子力显微镜高度图像可以看出，制备得到的复合膜基底表面取向微结构的凹槽深度可达50nm，完全可以诱导细胞沿凹槽方向取向。

3)将得到的表面取向或未取向培养基底于紫外灯下紫外照射灭菌24h；将灭菌后的培养基底分别用PBS(pH 7.4)和α-MEM(含10％FBS，1％P/S)浸泡24h；将提取的第3代骨髓间充质干细胞以4000个/平方厘米的密度接种于表面取向或未取向培养基底上，于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养，每48小时更换新鲜培养基一次。

4)培养四周后提取取向复合膜基底上培养的骨髓间充质干细胞的总RNA，然后反转录为cDNA，之后用qRT-PCR对骨髓间充质干细胞中Nanog、Sox-2和Pou5f1多能性标志基因的表达进行相对定量(以管家基因GAPDH为参照)，同时以没有表面取向微结构基底上培养4周的骨髓间充质干细胞作为对比；进一步，将在PCL/PTFE基底培养达4周的骨髓间充质干细胞利用胰蛋白酶消化，按5000个/平方厘米密度种于12孔板中，待细胞融合比例达80％，利用成骨或成脂诱导剂进行成骨或成脂诱导，再利用茜素红S或油红O进行染色，以第三代骨髓间充质干细胞为对比，定性骨髓间充质干细胞是否具有多能性。

图3给出了骨髓间充干细胞在PCL/PTFE或PCL上生长5天的荧光共聚焦图像，从图中可知骨髓间充质干细胞沿着PCL/PTFE复合膜表面取向微结构的凹槽方向实现大面积取向。图4给出了骨髓间充质干细胞在PCL/PTFE或PCL基底上培养4周后qRT-PCR数据(Nanog，Sox-2，Pou5f1为干细胞多能性标志基因，以管家基因GAPDH为参照)；图5a-b给出了第3代骨髓间充质干细胞成骨与成脂诱导光学图像(a.成骨，b.成脂)；图5c-d给出了在表面具有取向结构的基底上培养4周的骨髓间充质干细胞成骨与成脂诱导光学图像(c.成骨，d.成脂)；由图4-5可知，采用本发明的方法可以使骨髓间充质干细胞培养四周后仍然保持其多能性。

实施例2一种可体外保持骨髓间充质干细胞多能性的方法

步骤与实施例1相同，区别在于步骤2)中利用摩擦取向方法得到负载取向聚四氟乙烯载玻片，紫外灭菌后直接用于细胞培养，不进行聚己内酯提拉成膜步骤，以紫外灭菌的干净载玻片为对照。

结果表明聚己内酯提拉成膜得到的取向复合培养基底更利于骨髓间充质干细胞多能性的保持。

实施例3一种可体外保持骨髓间充质干细胞多能性的方法

步骤与实施例1相同，区别在于步骤1)骨髓间充质干细胞来源由3周SD大鼠替换为2周SD大鼠、3周KM小鼠、12周新西兰兔，骨髓间充质干细胞选用第3代至第5代。

实施例4一种可体外保持骨髓间充质干细胞多能性的方法

步骤与实施例1相同，区别在于步骤1)的骨髓间充质干细胞的提取采取梯度离心法，得到第2代至第5代骨髓间充质干细胞用于培养。

实施例5一种可体外保持骨髓间充质干细胞多能性的方法

步骤与实施例1相同，区别在于将α-MEM(含10％FBS，1％P/S)培养基替换为DMEM/F12(含8％FBS，1％P/S)培养基或DMEM(含15％FBS，2％P/S)培养基。

实施例6一种可体外保持骨髓间充质干细胞多能性的方法

步骤与实施例1相同，区别在于聚四氟乙烯替换为聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚偏氟乙烯或聚碳酸酯；步骤2)摩擦取向过程中热台温度分别为聚乙烯(75℃)、聚丙烯(140℃)、聚苯乙烯(200℃)、聚偏氟乙烯(130℃)、聚碳酸酯(190℃)。

实施例7一种可体外保持骨髓间充质干细胞多能性的方法

步骤与实施例1相同，区别在于将浓度为0.02g/ml的聚己内酯(PCL)的三氯甲烷溶液替换为浓度为0.01g/ml-0.02g/ml的聚己内酯的二氯甲烷溶液。

实施例8一种可体外保持骨髓间充质干细胞多能性的方法

步骤与实施例1相同，区别在于生物高分子由聚己内酯替换为聚乳酸，步骤2)提拉成膜后热处理过程中热台温度为90℃。

实施例3-8的实验结果显示，与实施例1相同均可以使骨髓间充质干细胞培养四周后仍然保持其多能性。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。