细菌性荚膜多糖的纯化方法

摘要

本发明公开细菌性荚膜多糖的纯化方法，灭活剂处理肺炎链球菌发酵培养液，加酸调节pH值≤6.5，沉淀杂质，离心和微滤去除沉淀物获得多糖澄清液；用截留分子量10—100KDa的膜对多糖澄清液进行超滤换液并浓缩，获得的荚膜多糖溶液组合使用复合型离子交换层析和羟基磷酸灰质盐层析进行色谱层析，获得纯化的荚膜多糖溶液；浓缩及超滤荚膜多糖溶液，并进行无菌过滤、保存。通过组合使用复合型离子交换层析和羟基磷酸灰质盐层析，可有效降低蛋白质及核酸杂质到低于1％，纯化的多糖产品质量高于欧盟药典标准要求，回收率在60％以上，本发明工艺简单快捷，容易放大进行工业化生产。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地讲，涉及对细菌性荚膜多糖粗制品的纯化方法。

背景技术

肺炎链球菌为革兰氏阳性菌，有90多种血清型，其中大部分肺炎链球菌细菌表面包裹一层荚膜多糖。荚膜多糖可逃避免疫系统的识别，防止免疫细胞的吞噬作用，因而使得细菌能够在体内繁殖而致病。多年的研究和临床证明，肺炎链球菌的荚膜多糖作为疫苗能诱导特异性抗体，对相应的肺炎链球菌具有很好的免疫保护作用。不同血清型的肺炎链球菌的荚膜多糖的成分和结构都不一样，因而通常需要使用不同血清型的肺炎链球菌的多糖组合作为疫苗来预防主要肺炎链球菌的致病性。

用于制备多糖疫苗的肺炎链球菌在发酵培养过程中，除了产生荚膜多糖之外，还产生大量代谢产物。为了满足疫苗制备所必须的荚膜多糖纯度，发酵液通常必须经过多个纯化步骤处理，将多糖粗制品中的蛋白、核酸、内毒素等杂质去除，从而避免后续接种疫苗可能引起的副反应。

细菌荚膜多糖纯化工艺的建立经历了多年的发展，传统细菌荚膜多糖纯化工艺采用冷酚萃取法去除蛋白质，该方法需要较长的离心时间，且苯酚作为有一种具有极强腐蚀的试剂，可能腐蚀操作者的皮肤、粘膜甚至抑制操作者的中枢神经或损害肝、肾功能；且废弃苯酚的处理，对环境保护来说存在着较严重的威胁。

乙醇分沉淀法通常能够有效地去除多糖中的蛋白污染物，但是难以达到用于注射用的疫苗纯度的要求。另外，乙醇的使用还会带来以下问题：1)乙醇的使用需要防火设施，而设计这样的设施成本很高；2)需要的乙醇量巨大，每升加工材料几乎需要4-6L乙醇，并且废液处理非常困难；3)处理后的多糖复溶困难，需要冻干等步骤。

专利US5714354提出了一种用无乙醇沉淀来纯化肺炎球菌荚膜多糖的改进方法。该方法是通过用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)来沉淀23种肺炎球菌血清型中的20个荚膜多糖，然后用活性炭过滤、羟基磷酸灰质盐(Hydroxyapatite)色谱法和阴离子交换色谱法来进一步分离多糖中的杂质，该纯化工艺步骤能够纯化出大部分血清型荚膜多糖。该方法纯化出来的所有23个血清型荚膜多糖的质量达到多糖疫苗的质量指标。目前，CTAB已被广泛用来选择性的沉淀多糖，从而达到与蛋白及核酸分离的目的，如专利CN201510012526以及CN200910128141。然而，由于形成的CTAB-多糖复合物解离较为困难，工艺步骤多且繁琐，影响了荚膜多糖的回收率。因此，在专利CN200910128141中，仍然采用纯的乙醇或乙醇和水混合物来溶解CTAB-多糖复合物。

降低多糖发酵溶液的pH值也被专利CN200880012946以及CN201210112391公开用于选择性沉淀蛋白质、核酸，而不严重影响多糖产率。这样纯化方法的特点在于通过酸化这一步来将大部分的污染物(如蛋白、核酸等)和溶液中的荚膜多糖分离，简化了后续工艺，缩短了纯化时间。然而，我们发现获得的制备的多糖不能符合药典标准，仍然需要进一步纯化，包括使用层析色谱吸附残留的杂质，以及微滤、超滤来获得合格多糖。

在多糖纯化过程中，多糖溶液不管是经多步乙醇分级沉淀、还是CTAB沉淀，以及简化纯化步骤的酸化处理得到的多糖(粗糖)都不能达到药典标准，还需进一步通过单个或多个色谱步骤处理获得合格精糖。如专利CN201180071029报导在多糖纯化过程使用疏水作用色谱(HIC)或离子交换色谱(IEX)去除溶液中C-多糖。由于部分血清型荚膜多糖糖基带有磷酸根离子(如6A、6B、19F等)，在层析过程中填料会大量结合这类多糖分子，导致流出液中需要回收的多糖显著降低。专利CN200610048875则使用Sepharose 4FF凝胶对细菌多糖进行精纯，但由于所选填料的性质，处理的溶液体积明显受到限制，不适合放大生产。季宇等(中国新药杂志2016年第25卷第10期)采用DOE设计建立了一种基于Capto Adhere的肺炎多糖纯化工艺，但依然有少部分蛋白未能有效去除，色谱纯化参数控制要求非常严格，通常蛋白、核酸含量很难达标，不利于实际生产。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种不需要乙醇沉淀，操作简单，回收效率高的色谱层析纯化细菌性荚膜多糖的纯化方法。

本发明的第二个目的在于提供组合使用复合型离子交换层析和羟基磷酸灰质盐层析在细菌性荚膜多糖纯化方法中的应用。

为实现本发明第一个目的，本发明公开以下技术方案：细菌性荚膜多糖的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)灭活剂处理肺炎链球菌发酵培养液，得到包含有细胞碎片、蛋白质、核酸和多糖的细菌溶解液；

(2)在步骤(1)获得的细菌溶解液中加酸调节pH值6.5，沉淀杂质，离心和微滤去除沉淀物获得多糖澄清液；

(3)用截留分子量10—100KDa的膜对步骤(2)获得的多糖澄清液进行超滤换液并浓缩，获得去除大部分可溶性蛋白质、核酸以及大颗粒杂质含量的荚膜多糖溶液；

(4)将步骤(3)获得的荚膜多糖溶液组合使用复合型离子交换层析和羟基磷酸灰质盐层析进行色谱层析，获得纯化的荚膜多糖溶液；

(5)浓缩及超滤步骤(4)获得的荚膜多糖溶液，并进行无菌过滤、保存。

作为一个优选方案，步骤(2)中所加的酸是磷酸、乙酸、盐酸、硫酸或硝酸中的一种或几种。

作为一个优选方案，步骤(2)中pH值的范围是3.0—6.5。

作为一个优选方案，步骤(2)中微滤所用微滤膜的膜孔径为0.22，0.45，0.65，1.0um中的任意一种。

作为一个优选方案，步骤(4)所述的组合使用是指先使用复合型离子交换层析，后使用羟基磷酸灰质盐层析或者先使用羟基磷酸灰质盐层析，后使用复合型离子交换层析。

作为一个优选方案，复合型离子交换层析填料选自Capto Adhere、TOYOPEARL MX-Trp-650M、Cellufine MAX AminoButyl，羟基磷酸灰质盐层析为CHT^TMCeramicHydroxyapatite。

为实现本发明第二个目的，本发明公开以下技术方案：组合使用复合型离子交换层析和羟基磷酸灰质盐层析在细菌性荚膜多糖纯化方法中的应用。

本发明可用于从含有肺炎链球菌不同血清型中纯化荚膜多糖，此处只是举例，而不限于这些血清型，包括1，2，3，4，5，6A，6B，7F，8，9N，9V，10A，11A，12F，14，15B，17F，18C，19A，19F，20，22F，23F和33F。

本发明的优点在于：通过组合使用复合型离子交换层析和羟基磷酸灰质盐层析，可有效降低蛋白质及核酸杂质到低于1％，纯化的多糖产品质量高于欧盟药典标准要求，回收率在60％以上。本发明工艺简单快捷，容易放大进行工业化生产，并且不需用到乙醇沉淀，具有操作简单，回收效率高，试剂消耗低、多糖中蛋白、核酸含量低等优点。

附图说明

图1离子交换层析(Capto DEAE)肺炎球菌多糖19F色谱图。

图2复合型离子交换层析(Capto adhere)肺炎球菌多糖19F色谱图。

图3羟基磷酸灰质盐层析(Hydroxyapatite)肺炎球菌多糖19F色谱图。

图4色谱层析过程中多糖溶液中蛋白杂质变化的SDS-PAGE图。

图5色谱层析过程中多糖溶液中蛋白质含量变化趋势图。

图6色谱层析过程中多糖溶液中核酸含量变化趋势图。

图7色谱层析过程中多糖回收率趋势图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1.肺炎链球菌多糖血清型1、3、4、7F、9v、15B、19A、19F、23F、33F荚膜粗多糖的制备

肺炎链球菌发酵培养液用脱氧胆酸钠(DOC)于4℃溶解12-24h。之后直接加酸至细菌溶解液中，调节含有荚膜多糖溶解液pH值至3—6.5之间，室温静置1小时以上，离心去除溶解剂、部分蛋白质和核酸，以及大量细胞碎片等杂质。在20℃下以大于10000g相对离心力将酸化液离心一小时，收集上清液并弃沉淀。获得上清液以分子截留为50-100kD膜超滤，用纯水进行洗滤进一步去除小分子杂质，最后浓缩获得粗制荚膜多糖溶液。

表1.不同血清型、生产批次蛋白和核酸含量以及多糖回收率情况

实施例2. 19F血清型荚膜多糖溶液经不同层析填料处理效果分析

实验操作

离子交换层析(Capto DEAE，GE)：经酸化处理后得到的粗多糖溶液使用截留分子量10-100kD膜，用5-50mM磷酸缓冲液，在pH6至8的pH下，进一步超滤换液，直到达到恒定电导。Capto DEAE层析柱用相同缓冲液平衡，随后将换液后的荚膜多糖溶液上柱，收集流穿液。上样完成后，用1-2个柱体积25mM磷酸缓冲液进一步洗涤，多糖在的流穿液和洗涤液中被回收。结合在Capto DEAE层析柱上的蛋白、核酸以及多糖用1M NaCl洗脱下来。

复合型离子交换层析(Capto adhere，GE)：经酸化处理后得到的粗多糖溶液使用截留分子量10-100kD膜，用5-50mM磷酸缓冲液，盐离子浓度(NaCl、KCl)优选地在100-300mM下，进一步超滤换液，直到达到恒定电导。Capto adhere层析柱用相同缓冲液平衡，随后将换液后的荚膜多糖溶液上柱，收集流穿液。上样完成后，用1-2个柱体积磷酸缓冲液，含相同盐离子浓度的缓冲液进一步洗涤，多糖在的流穿液和洗涤液中被回收。结合在Captoadhere层析柱上的蛋白、核酸以及多糖用0.1M乙酸洗脱下来。

羟基磷酸灰质盐层析(Hydroxyapatite，Bio-Rad)：经酸化处理后得到的粗多糖溶液使用截留分子量10-100kD膜，用5-50mM磷酸缓冲液，盐离子浓度(NaCl)优选地在100-300mM下，进一步超滤换液，直到达到恒定电导。Hydroxyapatite层析柱用相同缓冲液平衡，随后将换液后的荚膜多糖溶液上柱，收集流穿液。上样完成后，用1-2个柱体积相同盐离子缓冲液进一步洗涤，多糖在的流穿液和洗涤液中被回收。结合在Hydroxyapatite层析柱上的蛋白、核酸以及多糖用0.5M磷酸缓冲液洗脱下来。

组合使用复合型离子交换层析(Capto adhere，GE)和羟基磷酸灰质盐层析(Hydroxyapatite，Bio-Rad)经酸化处理后得到的粗多糖溶液使用截留分子量10-100kD膜，用5-50mM磷酸缓冲液，盐离子浓度(NaCl)优选地在100-300mM下，进一步超滤换液，直到达到恒定电导。Hydroxyapatite层析柱优选的串联Capto adhere层析柱之后用用相同缓冲液平衡，随后将换液后的荚膜多糖溶液上柱，收集流穿液。上样完成后，用1-2个柱体积相同盐离子缓冲液进一步洗涤，多糖在的流穿液和洗涤液中被回收。分别洗脱结合在Captoadhere层析柱上和在Hydroxyapatite层析柱上的蛋白、核酸以及多糖。另外，Capto adhere层析后回收的含有荚膜多糖溶液，经超滤换液调节(或不调节)溶液盐离子浓度后，接着继续上Hydroxyapatite层析柱，收集含多糖的流穿液。反之，经酸化处理后的粗糖液经调节缓冲液盐浓度后上Hydroxyapatite层析柱后再上Capto adhere层析柱亦可。

结果分析

从图1肺炎球菌多糖血清型19F离子交换层析(Capto DEAE)色谱图可以看出，Capto DEAE层析流穿液中的多糖峰明显低于Capto Adhere层析(图2)和Hydroxyapatite层析(图3)，推测很大一部分荚膜多糖吸附到Capto DEAE填料上，从而导致流穿液中多糖浓度降低。因为，在碱性到中性pH条件下，血清型19F荚膜多糖由于糖基上含有磷酸根离子而带负电荷而吸附到Capto DEAE上。这表明，Capto DEAE并不适用于这类含有磷酸根离子血清型多糖的纯化。

有报道显示Capto Adhere层析被用于肺炎多糖纯化工艺的开发(中国新药杂志2016年第25卷第10期)，但从图4多糖溶液中蛋白质SDS-PAGE图谱可以看出，Capto Adhere层析后多糖溶液中依然有部分蛋白残留(含量约为10-20％)。而Hydroxyapatite层析后的多糖溶液中残留的蛋白条带少于Capto Adhere层析。两种不同层析方法处理后，残留的蛋白条带大小也有明显不同，显示两种层析填料对蛋白的吸附有一定差异性。因而，组合使用Capto Adhere以及Hydroxyapatite层析后，几乎在多糖溶液中看不到蛋白残留。以上结果表明，组合使用复合型离子交换层析和羟基磷酸灰质盐层析两个色谱步骤可有效用于细菌荚膜多糖纯化。

表2. 19F荚膜多糖经不同色谱层析处理结果

纯化方法蛋白含量％核酸含量％多糖回收率％Capto DEAE9.60.315.4Capto Adhere14.30.685Hydroxyapatite6.70.578.1Capto Adhere，Hydroxyapatite0.50.163.6

实施例3.肺炎链球菌多糖血清型1、3、4、7F、9v、15B、19A、19F、23F、33F精糖的制备

经酸化处理后得到的粗多糖溶液使用截留分子量10-100kD膜，用5-50mM磷酸缓冲液，盐离子浓度(NaCl)优选地在100-300mM下，进一步超滤换液，直到达到恒定电导。Hydroxyapatite层析柱优选的串联Capto adhere层析柱之后用用相同缓冲液平衡，随后将换液后的荚膜多糖溶液上柱，收集流穿液。上样完成后，用1-2个柱体积相同盐离子缓冲液进一步洗涤，多糖在的流穿液和洗涤液中被回收。

表3.不同血清型经Capto Adhere以及Hydroxyapatite层析后，蛋白和核酸含量以及多糖回收率情况

本发明是一种基于色谱层析纯化肺炎链球菌多糖的方法，通过使用复合型离子交换层析能够避免普通离子交换层析非特异性吸附带磷酸根离子基团类血清多糖(如6A、6B、19F等)。结合羟基磷酸灰质盐层析有利于进一步减少多糖溶液中的蛋白质等杂质。通过本方法制备的荚膜多糖有约60至80％的回收率，其中蛋白质含量少于1％，且核酸含量少于1％。所述的方法已经在研究、中试规模实现。此方法与基于CTAB或酒精沉淀的方法相比，纯化多糖能节约50-90％的时间以及降低90％的成本。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。