14型肺炎球菌荚膜多糖纯化工艺的建立与优化

摘要

肺炎球菌(Streptococcus Pneumoniae，SP)，简称肺炎球菌，是一种具有荚膜的革兰氏阳性菌，是导致全球人类发病和死亡的主要致病菌之一，主要引起社区获得性肺炎、中耳炎、脑膜炎以及败血症等疾病。目前已有利用其保护性抗原—肺炎球菌荚膜多糖(PnPS)制备的23价肺炎球菌荚膜多糖疫苗和7价、13价肺炎球菌多糖结合疫苗上市，以防御肺炎球菌对成人和婴幼儿造成的感染。
　　论文以14型肺炎球菌为实验材料，采用常规细菌学检定方法对其进行了筛选，挑出生物学特性典型、荚膜结构完整丰厚、与14型分型诊断血清凝集作用较强的31601-5菌株建立发酵的工作种子库；以细菌生长菌密度、荚膜多糖产率等指标为依据，通过细菌发酵罐培养，对其适宜培养基成分、菌液接种量以及通气方式等条件进行筛选与优化。结果表明，以添加了天冬氨酸和谷氨酰胺的氨基酸培养基为基础，在培养温度为37℃，菌种接种量为10％、培养基pH值7.2、CO22 L/min及压缩空气3 L/min共同通气培养的条件下，14型肺炎球菌生长较好，菌密度达13.068，荚膜多糖产率可达到0.4 g/L。
　　其次，对14型肺炎球菌培养液的裂解工艺进行了优化和验证，通过观察裂解浓度、裂解时间、裂解温度对裂解效果的影响，最终确立了14型肺炎球菌发酵培养液的裂解工艺为：细菌光密度OD600值≤12时，细菌培养结束后，于培养液中加入脱氧胆酸钠，使其终浓度为0.12%，置于18~22℃环境下静置12~18h。
　　然后，将裂解液分别用乙醇分级沉淀法和CTAB沉淀法进行纯化，并检测氨基己糖含量、蛋白质含量、核酸含量及免疫双扩散法确定抗原活性，全面评价各种方法的纯化效果，结果表明，乙醇分级沉淀法更适于14型肺炎球菌粗多糖的纯化。
　　最后，对裂解液中的粗多糖分别用脱氧胆酸钠法和苯酚抽提法进行处理后超滤、干燥。收获冻干后的荚膜多糖，经全面分析后，确定14型肺炎球菌粗多糖的去蛋白质工艺为脱氧胆酸钠法。工艺参数为：加入脱氧胆酸钠，终浓度0.5%，调pH至5.0以下，离心取上清液，经100Kd膜堆超滤后冷冻干燥收获液。
　　论文还应用响应面法对14型肺炎球菌荚膜多糖的超滤工艺进行优化。根据实际操作情况及经验选取跨膜压力、切向流量和多糖浓度作为自变量，以膜包处理能力作为响应值，先进行单因素试验，考察跨膜压力、切向流量、多糖浓度对膜包处理能力的影响，并初步确定曲线的拐点和试验步长，再以单因素试验为基础，利用Box-Behnken设计进行响应面优化组合，采用Design Expert软件分析数据，确定最佳超滤工艺参数为：跨膜压力12.8Psi、切向流量66L/h、多糖浓度0.86g/L；最适透析倍数为5倍。
　　本实验最终建立了一种稳定、可适用于大规模生产需求的14型肺炎球菌荚膜多糖纯化方法。

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缩 略 词

第 1 章 引 言

1.1 课题意义及国内外研究现状综述

1.2 课题研究目标和研究内容

第 2 章 14型肺炎球菌发酵培养工艺的建立

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论

第 3 章 14型肺炎球菌发酵液裂解工艺的建立

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 结论

第 4 章 14型肺炎球菌荚膜多糖粗提工艺的建立

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

4.3 讨论

第 5 章 14型肺炎球菌荚膜多糖去蛋白工艺的建立

5.1 材料与方法

5.2 结果与分析

5.3 讨论

第 6 章 14型肺炎球菌荚膜多糖超滤、干燥工艺的建立

6.1 材料与方法

6.2 结果与分析

6.3 讨论

结论

参考文献

致谢

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