一种桃肉总蛋白的提取液及提取工艺

摘要

本发明公开了一种桃肉总蛋白的提取液及提取工艺，属于植物蛋白提取领域。该提取液包括200mM Tris‑Base、200mM NaCl、50mM抗坏血酸钠、1mg/100mL脱氧胆酸盐、1mL/100mL NP‑40、1g/100mL吐温20、1mL/100mL Triton X‑100、5mM EDTA、10mL/100mL甘油、50mM四硼酸钠和1g/100mL PVPP。所述的提取工艺包括配制裂解液，样品称量、研磨、裂解和离心、超滤和透析等步骤。本发明优化了提取液的配方，包括加入相适应的试剂、含量的选择、延长样品裂解时间和优化透析、超滤步骤，明显提高了桃肉天然总蛋白的提取效率，达到千分之一点五。

说明书

技术领域

本发明属于植物蛋白提取技术领域，具体涉及一种桃肉天然可溶性总蛋白的提取液以及利用该提取液提取桃肉总蛋白的工艺。

背景技术

RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)是一种传统的细胞组织快速裂解液，主要用于从动物组织或动物细胞中抽取可溶性天然蛋白。目前，很多公司推出了这种商业化的RIPABuffer Kit，这些商业化的Kit对动物细胞或动物组织天然蛋白抽提效果一般比较显著，但对植物细胞尤其是特殊物种或者特殊组织类型的细胞天然蛋白的提取效率经常较低，其中可能原因是由于植物细胞存在细胞壁以及物种的特殊性。

使用商业化天然蛋白抽提试剂盒来抽提桃肉天然总蛋白效率很低，如1g桃肉样品只能抽提得到0.1mg总蛋白，提取效率为万分之零点一；常规文献上报道的植物蛋白抽提方法大多数是变性蛋白提取方法，比如酚抽法和TCA丙酮沉淀法，这些方法对于研究天然蛋白质之间相互作用会有很大的影响。因此，对已有的RIPA裂解液作出改进和创新，以适应桃肉总蛋白的提取，提高总蛋白的提取效率，将有重大的研究开发意义。

发明内容

本发明提供一种桃肉总蛋白的提取液，通过优化提取液的配方，包括加入相适应的试剂及对含量的选择，以解决现有技术的上述缺陷，明显提高了桃肉天然总蛋白的提取效率，提取效率达到千分之一点五，即1g桃肉样品可以提取得到1.5mg总蛋白。

本发明还提供了一种利用上述提取液提取桃肉总蛋白的工艺，包括延长样品裂解时间，提高抽提效率，和优化透析和超滤步骤，保证得到的蛋白质质量符合下游研发需求。

本发明的技术方案如下：

一种桃肉总蛋白的提取液，包括由以下原料制得：200mM的Tris-Base、200mM的NaCl、50mM的抗坏血酸钠、1mg/100mL的脱氧胆酸盐、1mL/100mL的NP-40、1g/100mL的吐温20、1mL/100mL的Triton X-100、5mM的EDTA、10mL/100mL的甘油、50mM的四硼酸钠和1g/100mL的PVPP；所述的提取液的pH值为7.5～8.0。

本发明还公开了一种利用上述的提取液提取桃肉总蛋白的工艺，包括以下步骤：

(1)配制裂解液

按权利要求1所述的含量组成配制提取液，4℃保存；

(2)样品称量和研磨

称取不少于0.5g的桃肉组织于研钵中，在液氮环境下充分研磨；待液氮挥发完后，聚集桃肉组织粉末；

(3)样品裂解和离心

将桃肉组织粉末和提取液置于离心管中，并加入蛋白酶抑制剂，混匀后，在4℃层析柜中旋转裂解4-6小时，裂解后，离心，取上清液；

(4)透析和超滤

配制PBS溶液，并提前备好透析袋、超滤滤膜、超滤离心管及所需工具，将上清液置于透析袋中透析，然后在超滤离心管中，3000rpm离心10-30分钟，收集蛋白溶液，检测蛋白含量及纯度，即完成桃肉总蛋白的提取。

优选为，步骤(3)中，桃肉组织粉末和提取液的加入比例为1g桃肉样品和2mL提取液。

优选为，步骤(3)中，当上清液掺入杂质时，在12500rpm离心30分钟，取上清液，并丢弃沉淀。

优选为，步骤(3)中还包括蛋白含量测定步骤，计算蛋白抽提效率。

优选为，步骤(3)中的蛋白酶抑制剂为PMSF和Cocktail。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

一、现有技术的提取液Tris-Cl浓度较低，缓冲能力较弱，不能保证蛋白生存环境的pH值，本发明的一种桃肉总蛋白的提取液，通过提高提取液的Tris-Cl浓度，增强提取液缓冲能力，为蛋白质提供一个更为稳定的环境；

二、现有技术不能够有效去除顽拗性植物组织中大分子难溶性物质，如多糖和多酚等，本发明通过在提取液中添加四硼酸钠，能够有效去除这些大分子难溶性物质；

三、本发明的提取桃肉总蛋白的工艺，延长了样品裂解时间，使蛋白抽提效率得到了很大的提高，具体地说，利用本发明提取工艺的蛋白抽提效率相比现有技术至少提高了10倍以上；

四、现有技术没有纯化和浓缩步骤，难以保证所得蛋白质的质量，如浓度和纯度等；本发明的提取工艺通过增加超滤和透析步骤，并量化超滤和透析标准，使之更为严格，从而保证得到蛋白质的质量符合下游研发需求。

附图说明

图1为本发明的一种利用所述提取液提取桃肉总蛋白的工艺流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应该理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的保护范围。在实际应用中本领域技术人员根据本发明做出的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

本发明的一种桃肉总蛋白的提取液，所述的提取液的pH值为7.5～8.0，包括由以下原料制得：200mM的Tris-Base、200mM的NaCl、50mM的抗坏血酸钠、1mg/100mL的脱氧胆酸盐、1mL/100mL的NP-40、1g/100mL的吐温20、1mL/100mL的Triton X-100、5mM的EDTA、10mL/100mL的甘油、50mM的四硼酸钠和1g/100mL的PVPP。具体含量组成及相应成分的作用，见表一。

本发明提取液的原理：样品经过充分研磨后，在提取液中经过非离子去垢剂破解细胞膜，使细胞裂解释放出蛋白。提取液中抗氧化剂提供一个抗氧化环境，一方面防止蛋白质被氧化，另一方面防止细胞裂解物中多酚等有机会被氧化而与蛋白结合。提取液中现加的蛋白质抑制剂主要是抑制蛋白酶活性，防止它们将蛋白质降解。保护剂PVPP可以防止多酚类物质与蛋白质结合并使之失活。然后通过高速离心使细胞裂解物沉淀，天然可溶性总蛋白存在于上清液中。上清液通过透析去除盐离子等小分子杂质，然后经过超滤浓缩至符合下游实验要求的浓度。

表一

本发明还公开了一种利用上述的提取液提取桃肉总蛋白的工艺，如图1所示，具体包括以下步骤：

(1)配制裂解液

提前准备好相关试剂，按照上述含量组成配制提取液，在4℃保存；PMSF配制得到10mL溶液后，分装，一次用1.5mL EP管分装10管，分装后-20℃保存，分装管可反复冻融数次；Cocktail蛋白酶抑制剂每次取出1g溶于1mL水，然后按1000X比例使用；其他特定类型的蛋白酶抑制剂根据项目要求和目的准备而添加；

(2)样品称量和研磨

取出新鲜的组织或冻存的组织，在电子天平上称重，并记录其重量；将装有组织的容器插到冰盒里，待用，组织重量不小于0.5g；

带上厚手套，打开液氮罐，用事先准备好的搪瓷勺伸入液氮罐取出一定量的液氮(注意不要将手碰到液氮，以免冻伤)放入保温杯中；

用干净的镊子从铝饭盒内取出与裂解组织相同数目的灭菌5mL EP管，盖上盖子，将组织名称标记到各个EP管的盖子上，将管子在冰上预冷。同时准备一批1.5mL EP管，盖上盖子，插到冰盒里待用；

事先准备干净的卷筒纸，倾斜保温杯，使杯口紧贴搪瓷研钵倒入一半容积液氮，将搪瓷棒和铝药勺放入液氮中预冷；预冷后，将搪瓷棒和铝药勺放在卷筒纸上待用；

将事先称量好的桃肉样品放入研钵之中，可以加入一些石英砂增强研磨效果；

倾斜保温杯，使杯口紧贴搪瓷研钵倒入一半容积液氮，待液氮汽化后，用搪瓷棒敲击组织并不断研磨，在研磨过程中，液氮挥发完之后要再次补充液氮并继续研磨，直至组织完全变成粉末状；在此过程中，用手遮挡住研钵的开口，以免组织在粉碎过程中飞溅；

倾斜保温杯，使杯口紧贴搪瓷研钵倒入1/4容积液氮，将铝药勺放入装有液氮的研钵中充分搅拌，使液氮快速汽化。待液氮挥发完之后，用铝药勺沿一个方向将搪瓷研钵壁上的粉末聚集在一起，时间控制在10秒中内；

(3)样品裂解和离心

按1∶2(1g桃肉样品准备2mL提取液)的比例准备提取液，放入预先准备好的5mL离心管中，且加入蛋白酶抑制剂PMSF和Cocktail，加完后立即放回-20℃冰箱保存；如果具体项目因为特殊要求和目的需要添加特定类型蛋白酶抑制剂，那就按照相关蛋白酶抑制剂使用说明添加之；

将研钵中样品粉末添加到提取液中，盖上离心管盖子并且用封口膜封好，防止液体漏出；然后放置振荡器震荡5分钟左右，保证粉末在裂解液中充分混匀；最后置于4℃层析柜中旋转裂解4-6小时；

待样品充分裂解后，12500rpm离心三十分钟，取上清，细胞裂解物沉淀可以暂时置于4℃冰箱，待确定蛋白抽提成功后再丢弃；

如果上清液有杂质，可以再次12500rpm离心30分钟，取上清，丢弃沉淀。上清液如果不立即使用，可以暂时放置于4℃；

测定此上清液蛋白浓度，计算蛋白抽提效率。如果抽提效率很低，则可以取出前面细胞裂解物沉淀重新裂解抽提蛋白；如果抽提效率正常，则可以丢弃细胞裂解物沉淀；

(4)透析和超滤

提前配置好PBS溶液，并且洗涤干净透析袋和透析所需实验器具；随后准备好蛋白浓缩所需要的超滤滤膜超滤离心管，洗涤干净，提前放入双蒸水中保持湿润状态；

根据项目目的计算蛋白所需用量和满足实验要求的蛋白浓度，然后取相应体积的蛋白溶液于透析袋中，4℃层析柜中透析过夜；

完成透析后，取出蛋白溶液于超滤离心管中，3000rpm离心10到30分钟；反复超滤，保证蛋白浓度符合实验要求；

完成超滤后，收集蛋白溶液，取出少量用于蛋白溶液浓度测定，计算蛋白得量。如果蛋白浓度和得量符合下游实验要求，提供给下游平台完成实验。

蛋白定量和质检应该在多个工艺流程中实现。如前所述，在上清液透析和超虑前先完成蛋白定量和质检，评判蛋白抽提成功与否。随后蛋白完成透析和超滤后，在提供给下游平台前，也应该实现蛋白定量和质检，保证用于下游实验的蛋白溶液质量和浓度符合实验要求。

蛋白质检最基本工艺包括考染跑胶检测和western blot检测，同时还应该根据样品特点和顶目要求等情况作出特殊质检，保证所抽提蛋白样品满足项目目的。

实施例1本发明的一种利用上述的提取液提取桃肉总蛋白的工艺，包括以下步骤：

(1)样品称量和研磨：称量成熟桃肉样品40g，在液氮中充分研磨，使样品以粉末形式存在；

(2)样品裂解和离心：将桃肉样品粉末添加到80mL提取液中，振荡器中震荡5分钟，然后4℃冰箱中旋转裂解4-6小时；这一步操作中，现有技术主要使用商业化的RIPA裂解液，这些RIPA裂解液对于裂解动物细胞效果比较好，但对于很多植物细胞和组织裂解效果其实并不好，因为这些商业化的RIPA裂解液配方并没有重视对植物细胞壁的破坏；再次，现有技术在添加提取溶液后只是震荡5到10分钟，并没有意识到为了使细胞被充分裂解而延长裂解时间，本发明通过增加4℃冰箱裂解4-6小时这一操作来保证细胞被充分裂解；

(3)透析和超滤：高速离心获取上清液，上清液大约有80mL，所提取总蛋白浓度大约在0.5到0.7mg/mL之间，然后通过反复超滤来浓缩所抽提蛋白，将上清液体积浓缩到30-40mL之间；然后在PSB中透析过夜，最后测量蛋白浓度。根据本实施例的数据结果，蛋白溶液体积最终为40mL，蛋白浓度为1.39mg/mL，因此，抽提得到总蛋白为55.64毫克，抽提效率大约为千分之一点六；而采用碧云天公司提供的商业化RIPA裂解液和对应的操作工艺来抽提桃肉天然总蛋白时，抽提效率不到万分之一。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。