一种松叶化学成分的分离方法

摘要

本发明涉及一种松叶化学成分的分离方法，其中，所述化学成分为桦木糖苷和massonianoside C，其特征在于包含以下步骤：供试品溶液的制备，分离，纯化，再次分离等，本发明分离方法减少了有机溶剂的使用量，溶剂易于回收利用，方法简单易于放大。

说明书

技术领域

本发明涉及药物化学领域，具体涉及一种松叶化学成分的分离方法。

背景技术

松叶(松针)为松科(Pinaceae)植物最主要的副产物，是松属药用的代表部位。我国松科植物主要有马尾松、油松、华山松、樟子松、湿地松等等，其中，马尾松是我国南方最主要的松属植物。近百年的研究发现，松针提取物具有镇痛、抗炎、镇静、镇咳、祛痰、平喘、降血脂、抗氧化、抗衰老、抗突变、抗肿瘤等一系列药理活性，由于其资源丰富、功效多样而引起学者们对松针化学成分的深入研究。近些年对松针中主药的化学成分的研究主药集中在挥发油、黄酮类化合物、原花青素、木脂素、莽草酸、维生素、酚类等物质上；分离制备松针中具有代表性的高纯度化合物单体成为一个重要的研究内容，尤其是松针中的部分专属性化学成分的提取分离对于松针药材的质量研究具有重要意义。目前松针中单体化学成分的分离方法主要是从植物原料中提取分离，所涉及的分离手段以硅胶和凝胶柱层析为基础，这些传统方法制备得到的单体化合物纯度较低，且步骤繁琐、周期长、重复性较差，难以应用于工业大生产。因此松针中化合物单体的分离方法急需改善，需要有一种快速、高效、重现性好的分离手段来满足对松针中高纯度单体化合物制备的需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简便、快速、高效地从松针中提取分离单体化合物的方法，其技术方案如下：

本发明一方面提供一种松叶化学成分的分离方法，其中，所述化学成分为桦木糖苷和massonianoside C，具体方法包含以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：称取松叶提取物适量，加入有机溶剂提取，提取液静止沉淀，取上清液，浓缩后冷冻干燥，将干燥产物溶解于超纯水中，过滤后收集滤液即得；

(2)分离：取步骤(1)中供试品溶液，以极性反相十八烷基硅烷色谱柱为固定相，以含有甲酸的甲醇溶液-含有甲酸的水溶液为流动相，进行梯度洗脱，分别收集保留时间为8.0-9.0min的馏分F1和保留时间为20.5-22min的馏分F2；

(3)纯化：取步骤(2)中馏分F1和F2，分别以反相十八烷基硅烷色谱柱为固定相，20:80的含有甲酸的乙腈溶液-含有甲酸的水溶液为流动相，等度洗脱，分别收集保留时间为3.8-4.6min的馏分F1-1和保留时间为14.6-15.5min的馏分F2-1；

(4)分离：取步骤(3)中馏分F1-1和馏分F2-1，分别以亲水性填料色谱柱为固定相，90:10的含有甲酸的乙腈溶液-含有甲酸的水溶液为流动相，进行等度洗脱，收集F1-1中保留时间为12.3-12.7min的馏分F1-2和F2-1中保留时间为16.7-17.3min的馏分F2-2；其中F1-2为桦木糖苷，F2-2为massonianoside C。

其中，步骤(2)中所述含有甲酸的甲醇溶液优选为含有0.1％甲酸的甲醇溶液；所述含有甲酸的水溶液优选为含有0.1％甲酸的水溶液；所述梯度洗脱条件优选为：0-35min，25％-60％含有0.1％甲酸的甲醇溶液，35-36min，60％-95％含有0.1％甲酸的甲醇溶液，36-55min，95％-95％含有0.1％甲酸的甲醇溶液。

所述步骤(3)或(4)中所述含有甲酸的乙腈溶液优选为含有0.1％甲酸的乙腈溶液；所述含有甲酸的水溶液优选为含有0.1％甲酸的水溶液。

所述步骤(2)、(3)、(4)检测波长优选为280nm；

所述步骤(1)中所述有机溶剂优选为自甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、乙酸乙酯、水中的一种或多种的混合物，更优选为甲醇溶液或70％的乙醇溶液；所述过滤方式优选为微孔滤膜，其中微孔过滤的孔径为0.22μm或0.45μm；所述提取步骤优选为回流提取或超声提取。

所述步骤(1)最优选为称取松叶提取物，分两次各加入甲醇，每次超声1小时，静置沉淀，取上清液，60℃下真空旋转蒸发，浓缩后冷冻干燥，将干燥产物溶解于水中，过0.45μm滤膜，即得；其中松叶提取物与每次超声提取所用甲醇的质量体积比为7:100；或最优选为称取松叶提取物350g，加入70％乙醇，加热回流1小时，静置沉淀，取上清液，60℃下真空旋转蒸发，浓缩后冷冻干燥，将干燥产物溶解于400mL超纯水中，过0.45μm滤膜，即得，其中松叶提取物与70％的乙醇的质量体积比为7:100。所述步骤(2)中极性反相十八烷基硅烷色谱柱优选为硅胶表面同时具有极性官能团和十八烷基官能团的色谱柱，符合条件的填料柱可自制或选择市售成品柱，如选自Atlantis dC18系列，Ultimate AQ-C18系列，XBridge C18系列，XAqua C18系列的色谱柱均可满足本发明的实施目的，其中尤以XAqua C18系列效果最好，所述色谱柱填料粒径为5-60μm，优选10μm；

步骤(3)中反相十八烷基硅烷色谱柱优选为硅胶表面键合十八烷基官能团的色谱柱，可自制或选择市售成品柱，如选自Xterra MS系列，Inertsil ODS-SP系列，Zorbax SB C18系列，SunFire C18系列等；最优选SunFire C18系列，色谱柱填料粒径为5-60μm，优选5μm；

所述步骤(4)中亲水性填料色谱柱优选为硅胶表面键合极性官能团的色谱柱或硅胶色谱柱，可自制或选择市售成品柱，如选自Atlantis HILIC Silica系列，Venusil HILIC系列、XAmide系列，ClickXIon系列等，最优选为ClickXIon系列，色谱柱填料粒径为5-60μm，优选10μm。

本发明分离方法中所述松叶提取物是指以松针为原料，以水或含水醇溶剂为提取溶液；申请人研究发现水、50％甲醇或乙醇、70％甲醇或乙醇、95％甲醇或乙醇、甲醇、乙醇均可以做本发明的提取溶剂，尤以甲醇或70％乙醇效果最优；优选取鲜松叶，加水煎煮两次，第一次加8倍量溶剂，煎煮1.5小时，第二次加6倍量溶剂，煎煮1.5小时；滤液减压浓缩成相对密度在70℃时检测为1.2的浸膏；喷雾干燥，即得。

由于松针中桦木糖苷(betuloside)和massonianoside C这两种成分的含量较低，一般的提取分离方法很难得到高纯度的单体成分，且目前尚无可行的化学合成方法用于制备这两种化合物单体。采用传统植化研究的系统分离方法虽能分离得到少量的单体成分，但方法步骤繁琐，分离周期极长，且收率极低，无法满足工业大生产的需求。本申请人经过长期的摸索研究，获得了本发明制备桦木糖苷和massonianoside C的方法，该方法分离效率高，产物纯度高达95％以上，其同等纯度化合物的收率为传统方法的3-4倍左右，制备时间周期仅为传统方法的9％；且随着制备量的加大，其快速分离的效果更明显。同时，本发明分离方法大大减少了有机溶剂的使用量，其分离环境相对密闭，溶剂易于回收，因此更加环保安全；并且，本发明简单方便、易于放大，可实现全仪器自动化分离，大大节约了产品制备的时间、人力和经济成本，适合于工业大生产应用。本发明的松针化学成分分离方法可应用于马尾松、湿地松等松针原料中的桦木糖苷和massonianoside C提取分离，是制备桦木糖苷和massonianoside C对照品的理想途径，弥补了目前这两种化合物对照品市场空白。

具体实施方式

松针原料：

松针药材采自中国四川省自贡市富顺县、广元市朝天区、巴中市南江县的松科松属马尾松(Pinus massoniana Lamb.)的松针。

试剂及材料：

甲醇：HPLC，4L/瓶，Merck(Darmstadt,德国)；

乙腈：HPLC，4L/瓶，Merck(Darmstadt,德国)；

甲酸：HPLC，500ml/瓶，Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,美国).；

去离子水由Milli-Q water purification system(Billerica,MA,美国)制备；

纯水来自娃哈哈公司；

大孔树脂，供应商：成都科龙化工试剂厂，型号：D101，(60-16目)0.3-1.25mm≧90％；

小孔树脂凝胶(MCI)，供应商：成都科普生物有限公司，型号：SBC MCI GEL反相色谱填料F型，75-150μm；

葡聚糖凝胶，供应商：GE Healthcare Life Sciences，型号：sephadex G₂₅medium，50μm；

C18键合硅胶(ODS)，供应商：sepax Technologies，Inc，型号：GP-C18，50μm；

色谱柱：Sunfire 50*150mm*10μm(Waters,美国)；XAqua C18 20*250mm*10μm(华谱ACCHROM色谱柱,中国)；Click XIon 4.6*250mm*10μm(华谱ACCHROM色谱柱,中国)；Click XIon 50*250mm*10μm(华谱ACCHROM色谱柱,中国)。

仪器：

ZNTD-50提取浓缩机组：长沙市岳麓区中南制药机械厂，中国

B-191喷雾干燥机：BUCHI，瑞士

纯化工厂：Waters，美国。包括一个2525二元高压制备泵、一个2777自动进样器、2757馏分收集器和一个2489双波长检测器。

分析色谱：Waters，美国。包括Alliance e2695液相系统与2998二极管阵列检测器。

液相色谱：Agilent，美国。包括一套1260液相分离及DAD检测器。

高分辨质谱：Agilent，6450超高解析度四级杆-飞行时间质谱仪(Q-Tof)，美国。

固体核磁共振仪：Bruker Avance II 600MHz，德国。

实施例一 松叶提取物的制备

鲜松叶，加入ZNTD-50提取浓缩机组，加水煎煮两次，第一次加8倍量水，煎煮1.5小时，第二次加6倍量水，煎煮1.5小时；滤液减压浓缩成相对密度在70℃时检测为1.2的浸膏；喷雾干燥，即得。

实施例二 传统植化分离方法制备松针化合物

(1)供试品溶液制备

取松叶提取物1200g，依次用醋酸乙酯、水饱和正丁醇萃取，分别得到醋酸乙酯萃取浸膏、水饱和正丁醇萃取浸膏以及水层剩余浸膏，编号为Pr.1～3。耗时5d。

(3)粗分

取Pr.2(水饱和正丁醇浸膏)，经大孔树脂D101吸附，3倍柱体积水洗脱，再经SBC MCI凝胶分离，以3倍柱体积30％乙醇洗脱分离得到Pr.2A1，以3倍柱体积40％乙醇洗脱分离得到Pr.2A2。耗时3d。

取Pr.2A2(40％乙醇洗脱液)经Sephadex G25柱，3倍柱体积水洗脱，得到3个部分Pr.2A2A、Pr.2A2B、Pr.2A2C。耗时2d。

(4)精分

①massonianoside C

Pr.2A2B经SBC MCI柱，3倍柱体积20％乙醇洗脱，得到1个部分Pr.2A2B1。耗时1.5d。

②桦木糖苷

Pr.2A2C经SBC MCI柱，20％-30％乙醇梯度洗脱，以3倍柱体积20％乙醇洗脱分离得到得到Pr.2A2C1，以3倍柱体积30％乙醇洗脱分离得到Pr.2A2C2。耗时2d。

取Pr.2A2C2经C18键合硅胶(ODS)色谱分离，用3倍柱体积的20％乙醇洗脱，得到Pr.2A2C3。耗时0.5d。

(5)纯化

①massonianoside C

Pr.2A2B1经硅胶柱色谱，依次用3倍柱体积.的二氯甲烷-乙醇(5∶1)、石油醚-丙酮(1∶3)洗脱，收集石油醚-丙酮(1:3)洗脱液，得到化合物massonianoside C，纯度为95％(HPLC，37mg)。耗时1d。

②桦木糖苷

取Pr.2A2C3洗脱液经硅胶柱色谱，依次用3倍柱体积的二氯甲烷-乙醇(5∶1)、石油醚-丙酮(1∶3)洗脱，收集石油醚-丙酮(1:3)洗脱液，得到化合物桦木糖苷，纯度为95％(HPLC，93.67mg)。耗时1d。

实验证明，采用系统植化分离方法从松针中制备massonianoside C和桦木糖苷存在操作过程复杂，实验步骤较多，有机溶剂用量大等问题，且涉及到二氯甲烷、石油醚、丙酮等有毒试剂，安全性较低。并且，该方法单独分离得到2个化合物，总共需时19天，制备周期较长，且产物收率极低，massonianoside C收率(相对于松叶提取物)约为十万分之三，桦木糖苷收率(相对于松叶提取物)约为十万分之八。

实施例三 松针化合物的制备

(1)供试品溶液制备

称取松叶提取物35g，分两次各加入500mL甲醇，每次超声1小时，静置沉淀，取上清液，60℃下真空旋转蒸发，浓缩后冷冻干燥，将干燥产物溶解于40mL超纯水中，过0.45μm滤膜，即得。耗时9h。

(2)一维制备液相分离

仪器：Waters纯化工厂，色谱柱：XAqua C18(250mm×20mm×10μm)，每次进样量为8mL。用含有0.1％甲酸的水(水相)和含有0.1％甲酸的甲醇(有机相)作为流动相进行梯度洗脱，洗脱条件为0-35min，25％-60％的有机相，35-36min，60％-95％有机相，36-55min，95％-95％有机相，流速为20mL/min，检测波长为280nm。取供试品溶液按照上述色谱条件进行分离，分别收集保留时间8.0-9.0min的馏分F1和保留时间20.5-22min的馏分F2。耗时7h。

(3)反相十八烷基硅烷纯化

仪器：Waters纯化工厂，色谱柱：SunFire(150mm×50mm×5μm)，每次进样量为20mL。流动相：20:80的乙腈/水，双相加0.1％甲酸(v/v)，等度洗脱，流速为80mL/min,检测波长为280nm。取馏分F1和F2按上述色谱条件进行分离纯化，分别收集保留时间为3.8-4.6min的馏分F1-1和保留时间为14.6-15.5min的馏分F2-1。耗时3.5h。

(3)二维制备液相分离

仪器：Waters纯化工厂，色谱柱：ClickXIon(250mm×20mm×10μm)，每次进样量为8mL。用含有0.1％甲酸的水(水相)和含有0.1％甲酸的乙腈(有机相)溶液作为流动相进行等度洗脱，有机相:水相(90:10)，流速80ml/min，检测波长280nm。取馏分F1-1和F2-1分别按上述色谱条件进行分离，收F1-1中保留时间12.5-13.5min的馏分，得到桦木糖苷(F1-2)11.15mg，纯度98％(HPLC)，收率(相对于松叶提取物)0.032％，耗时13h。

收集F2-1中1保留时间16.5-17.5min的馏分，得到massonianoside C(F2-2)3.8mg,纯度95％(HPLC)，收率(相对于松叶提取物)0.011％，耗时17h。

实施例四 松针化合物的制备

(1)供试品溶液的制备

称取松叶提取物350g，加入5L的70％乙醇，加热回流1小时，静置沉淀，取上清液，60℃下真空旋转蒸发，浓缩后冷冻干燥，将干燥产物溶解于400mL超纯水中，过0.45μm滤膜，即得。耗时10h。

(2)一维制备液相分离

制备液相仪：Waters纯化工厂，色谱柱：XAqua C18(250mm×100mm×10μm)，每次进样量为40mL。用含有0.1％甲酸的水(水相)和含有0.1％甲酸的甲醇(有机相)作为流动相进行梯度洗脱，洗脱条件为：0-35min，25％-60％的有机相，35-36min，60％-95％的有机相，36-55min，95％-95％的有机相，流速为300mL/min，检测波长为280nm，取供试品溶液按照上述色谱条件进行分离，分别收集保留时间8.0-9.0min的馏分F1和保留时间20.5-22min的馏分F2。耗时12h。

(3)反相十八烷基硅烷纯化

仪器：Waters纯化工厂，色谱柱：SunFire(150mm×50mm×5μm)，每次进样量为20mL。流动相：20:80的乙腈/水，双相加0.1％甲酸(v/v)，等度洗脱，流速为80mL/min,检测波长为280nm。取馏分F1和F2按上述色谱条件进行分离纯化，收集F1中保留时间为3.8-4.6min的馏分F1-1和F2中保留时间为14.6-15.5min的馏分F2-1。耗时12h。

(4)二维制备液相分离

仪器：Waters纯化工厂，色谱柱：ClickXIon(250mm×50mm×10μm)，每次进样量为20mL。用含有0.1％甲酸的水(水相)和含有0.1％甲酸的乙腈(有机相)溶液作为流动相进行等度洗脱，有机相:水相＝10:90，流速80ml/min，检测波长280nm。分别取馏分F1-1和F2-1按上述色谱条件分离，收集F1-1中保留时间12.5-13.5min的馏分，得到桦木糖苷(F1-2)100.8mg，化合物纯度97％(HPLC)，收率(相对于松叶提取物)0.03％。收集F2-1中保留时间16.5-17.5min的馏分，得到massonianoside C(F2-2)35.4mg，纯度96％(HPLC)，收率(相对于松叶提取物)0.01％。耗时12h。

实施例五 化合物结构验证

(1)液相和质谱

取实施例三、四中分离得到的化合物，利用Agilent 1260液相色谱仪进行分析。色谱柱：ClickXIon column(4.6×250mm,10μm)，用含有0.1％甲酸的水溶液(水相)和含有0.1％甲酸的乙腈溶液(有机相)作为流动相进行等度洗脱，有机相:水相(90:10)，流速1.0ml/min。液相分析物直接接入Agilent 6540Q-TOF MS。气体温度设定为325℃,雾化气压力设定在30psi，干燥气体流速设定为8L/min.毛细管电压设定在3.5kV。.

纯度和液相色谱数据分析软件为Waters Empower software(version 3.0)和Masslynxsoftware(version 4.1)(Milford,MA,USA)

质谱数据分析软件为Agilent Masshunter software(version 4.0)(Santa Clara,CA,USA)

(2)核磁共振

采用Bruker Avance II 600MHz核磁共振仪进行分析。氢谱：600MHz，样品溶剂为MeOD。碳谱：150MHz，样品溶剂为MeOD。

1H NMR and 13C NMR核磁数据分析软件为Bruker Topspin software(version 3.0).

(3)鉴定结果

F1-2(桦木糖苷，betuloside)化合物光谱、质谱及核磁数据见下表1，化合物分子式如式Ⅰ所示：

表1 化合物F1-2结构鉴定数据

F2-2(massonianoside C)化合物光谱、质谱及核磁数据见下表2，化合物分子式如式Ⅱ所示：

表2 化合物F2-2结构鉴定数据