离子色谱法测定山楂中酒石酸、草酸和柠檬酸含量的方法

摘要

本发明公开了离子色谱法测定山楂中酒石酸、草酸和柠檬酸含量的方法，建立离子色谱法同时检测准噶尔山楂中有机酸的分析方法。以KOH溶液为提取剂超声辅助提取准噶尔山楂中的有机酸，用10mmol/L KOH和30mmol/L KOH梯度淋洗，流速为1.00mL/min准确测定了准噶尔山楂中的酒石酸、草酸和柠檬酸等成份。在测定浓度范围内，酒石酸、草酸和柠檬酸在检测条件下有良好的线性关系，测得样品中酒石酸、草酸和柠檬酸含量为8.7mg/g、3.5mg/g、43.2mg/g。回收率为90.7％～100.3％；本发明具有分析时间短、线性范围宽，灵敏和准确、简单快速、试剂用量少等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及成分检测领域，具体涉及一种离子色谱法测定山楂中酒石酸、草酸和柠檬酸含量的方法。

背景技术

准噶尔山楂(学名：Crataegus songorica)是蔷薇科山楂属的植物。分布在俄罗斯、阿富汗、伊朗以及中国大陆的新疆(伊犁、霍城)等地，生长于海拔500米至2,000米的地区，一般生于河谷以及峡谷灌木丛中，目前尚未由人工引种栽培。果实为瞢荚果、瘦果、梨果或核果，稀蒴果；种子通常不含胚乳，极稀具少量胚乳；子叶为肉质，背部隆起，稀对褶或呈席卷状。山楂的干燥成熟果实，味酸、甘，微温，归脾、胃、肝经，具有消食健胃、行气散瘀、化浊降脂的功效。到目前为止，从山楂中发现且分离得到的物质主要有黄酮类、黄烷及其聚合物类、有机酸类，另外还有三萜类和甾体类等。山楂中所含的有机酸成分对调节血脂、预防肿瘤及改善记忆有明显的药理作用。

有机酸在中草药的叶、根、特别是果实中广泛分布，如乌梅、山楂，覆盆子等。常见的植物中的有机酸有脂肪族的一元、二元、多元羧酸如酒石酸、草酸、苹果酸、枸椽酸、抗坏血酸(即维生素C)等，芳香族有机酸如苯甲酸、水杨酸、咖啡酸(Caffelc acid)等。除少数以游离状态存在外，一般都与钾、钠、钙等结合成盐，有些与生物碱类结合成盐。脂肪酸多与甘油结合成酯或与高级醇结合成蜡。有的有机酸是挥发油与树脂的组成成分。一般认为脂肪族有机酸无特殊生物活性，但有些有机酸如酒石酸、枸椽酸作药用。有报告认为苹果酸、构椽酸、酒石酸、抗坏血酸等综合作用于中枢神经。有些特殊的酸是某些中草药的有效成分，如土槿皮中的土槿皮酸有抗真菌作用。咖啡酸的衍生物有一定的生物活性，如绿原酸(Chlorogenic acid)为许多中草药的有效成分。有抗菌、利胆、升高白血球等作用。

总有机酸的含量测定一般采用：酸碱滴定法、反相高效液相色谱法、高效毛细管电泳法、气相色谱法。离子色谱法是高效液相色谱法的一种，具有高速、高效、高灵敏、高选择的特点，可同时分析多种离子化合物。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种离子色谱法测定山楂中酒石酸、草酸和柠檬酸含量的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

离子色谱法测定山楂中酒石酸、草酸和柠檬酸含量的方法，包括如下步骤：

S1、将山楂去核留果皮与果肉粉碎，过40目筛，称取山楂粉末试样0.4000g，加入40mmol/L氢氧化钾溶液40.0mL，超声30min，温度20℃，功率100W；先用布氏漏斗过滤，将滤液转移至50mL容量瓶中，定容至刻度，最后用0.45μm微孔滤膜过滤；

S2、绿原酸标准储备溶液[ρ(C₁₆H₁₈O₉)＝1000mg/L]，准确称取0.1000g绿原酸标准物质于烧杯中，用40mmol/L>

苹果酸标准储备溶液[ρ(C₄H₆O₅)＝1000mg/L]，准确称取0.1000g苹果酸标准物质于烧杯中，用40mmol/L>

酒石酸标准储备溶液[ρ(C₄H₆O₆)＝1000mg/L]准确称取0.1000g经酒石酸标准物质于烧杯中，用40mmol/L>

草酸标准储备溶液[ρ(H₂C₂O₄)＝1000mg/L]准确称取0.1000g草酸标准物质于烧杯中，用40mmol/L>

柠檬酸标准储备溶液[ρ(C₆H₈O₇)＝1000mg/L]准确称取0.1000g柠檬酸标准物质于烧杯中，用40mmol/L>

S3、有机酸标准曲线工作溶液配制：分别配制浓度为20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L、250mg/L、300mg/L混合有机酸标准溶液待用；

S4、取IonPac AS-11型高效阴离子分离柱，DIONEX淋洗液发生器，KOH淋洗液梯度淋洗，0-12min KOH浓度为10mmol/L，15-23min KOH浓度为30mmol/L，淋洗液流速为1.000mL/min，样品进样环体积为25.0μL，抑制型电导检测；

S5、待仪器基线稳定后，将步骤S3配好的有机酸标准曲线工作溶液依次进行检测，以各个单标有机酸的出峰时间来定性，峰面积定量进行线性拟合，重复次数11。根据各有机酸标准曲线得线性方程、相关系数、线性范围，采用3s计算方法测定各阴离子的方法最低检出限(DL＝3s/k)；

S6、将步骤S1经0.45μm滤头过滤后的山楂样品，其中一份精密加入酒石酸、草酸和柠檬酸标准溶液，通过手动进样1.0mL测试，计算有机酸含量及加标回收率。

本发明具有以下有益效果：

建立离子色谱法同时检测准噶尔山楂中有机酸的分析方法。以KOH溶液为提取剂超声辅助提取准噶尔山楂中的有机酸，用10mmol/L KOH和30mmol/L KOH梯度淋洗，流速为1.00mL/min准确测定了准噶尔山楂中的酒石酸、草酸和柠檬酸等成份。最佳提取条件为提取时间为30min，KOH浓度为40mmol/L提取功率为100W。在测定浓度范围内，酒石酸、草酸和柠檬酸在检测条件下有良好的线性关系，相关系数R²＞0.99，检出限为0.4～2.2mg/L，测得样品中酒石酸、草酸和柠檬酸含量为8.7mg/g、3.5mg/g、43.2mg/g。回收率为90.7％～100.3％；本发明具有分析时间短、线性范围宽，灵敏和准确、简单快速、试剂用量少等优点。

附图说明

图1-a浓度为10.0mmol/L的淋洗液浓度对分离效果的影响。

图1-b浓度为20.0mmol/L的淋洗液浓度对分离效果的影响。

图1-c浓度为30.0mmol/L的淋洗液浓度对分离效果的影响。

图1-d浓度为40.0mmol/L的淋洗液浓度对分离效果的影响。

图1-e浓度为50.0mmol/L的淋洗液浓度对分离效果的影响。

图2-a流速条件为0.60mL/min时洗液流速对分离效果的影响

图2-b流速条件为0.80mL/min时洗液流速对分离效果的影响

图2-c流速条件为1.00mL/min时洗液流速对分离效果的影响

图2-d流速条件为1.20mL/min时洗液流速对分离效果的影响

图2-e流速条件为1.40mL/min时洗液流速对分离效果的影响.

图3-a梯度洗脱的标准溶液

图3-b梯度洗脱的样品

图4-a为不同浓度氢氧化钾对酒石酸和草酸的提取率。

图4-b为不同浓度氢氧化钾对柠檬酸的提取率。

图5-a不同提取时间对酒石酸的提取率。

图5-b不同提取时间对草酸的提取率。

图5-c不同提取时间对柠檬酸的提取率。

图6-a不同提取功率对酒石酸的提取率。

图6-b不同提取功率对草酸的提取率。

图6-c不同提取功率对柠檬酸的提取率。

图7-a酒石酸的标准曲线。

图7-b草酸的标准曲线。

图7-c柠檬酸的标准曲线。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

以下实施例的中的材料为：

山楂(新疆伊犁伊宁市霍城县小西沟)；绿原酸(BR，源叶生物)；苹果酸(AR，天津市光复精细化工研究所)；酒石酸(GR，北京化工厂)；草酸(AR，天津市科盟化工工贸有限公司)；柠檬酸(AR，成都市科龙化工试剂厂)；琥珀酸(AR，天津市北联精细化学品开发有限公司)；甲酸(AR，天津市科盟化工工贸有限公司)；乙酸(AR，天津市福晨化学试剂厂)；氢氧化钾(AR，天津市科盟化工工贸有限公司)；超纯水

色谱条件

IonPac AS-11型高效阴离子分离柱，DIONEX淋洗液发生器，KOH淋洗液梯度淋洗，0-12min KOH浓度为10mmol/L，15-23min KOH浓度为30mmol/L，淋洗液流速为1.000mL/min，样品进样环体积为25.0μL，抑制型电导检测。山楂样品经0.45μm滤头过滤后，按仪器优化条件通过手动进样1.0mL测试。

有机酸标准溶液配制

绿原酸标准储备溶液[ρ(C₁₆H₁₈O₉)＝1000mg/L]，准确称取0.1000g绿原酸标准物质于烧杯中，用40mmol/L>

苹果酸标准储备溶液[ρ(C₄H₆O₅)＝1000mg/L]，准确称取0.1000g苹果酸标准物质于烧杯中，用40mmol/L>

酒石酸标准储备溶液[ρ(C₄H₆O₆)＝1000mg/L]准确称取0.1000g经酒石酸标准物质于烧杯中，用40mmol/L>

草酸标准储备溶液[ρ(H₂C₂O₄)＝1000mg/L]准确称取0.1000g草酸标准物质于烧杯中，用40mmol/L>

柠檬酸标准储备溶液[ρ(C₆H₈O₇)＝1000mg/L]准确称取0.1000g柠檬酸标准物质于烧杯中，用40mmol/L>

有机酸标准曲线工作溶液配制：分别配制浓度为20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L、250mg/L、300mg/L混合有机酸标准溶液待用。

样品前处理

将山楂去核留果皮与果肉粉碎，过40目筛，称取山楂粉末试样0.4000g，加入40mmol/L氢氧化钾溶液40.0mL，超声30min，温度20℃，功率100W。先用布氏漏斗过滤，将滤液转移至50mL容量瓶中，定容至刻度，最后用0.45μm微孔滤膜过滤。

淋洗液浓度对分离效果的影响

依次使用10.0mmol/L、20.0mmol/L、30.0mmol/L、40.0mmol/L、50.0mmol/L的KOH淋洗液，对同一浓度的标准溶液进行条件测试；

从图2-a，图2-b，图2-c，图2-d，图2-e可以看出，各个有机酸在色谱柱中洗脱时间受淋洗液浓度影响较大，淋洗液浓度越高，分离速度越快；尤其柠檬酸表现比较活跃。在10.0mmol/L淋洗液条件下，各有机酸色谱峰能很好分离，但柠檬酸未出峰，若在此条件下检测样品会导致柠檬酸无法检测；在20.0mmol/L淋洗液条件下，苹果酸和酒石酸分离度较差，两峰不能完全分离，影响苹果酸和酒石酸浓度的测定；在30.0mmol/L淋洗液条件下，苹果酸和酒石酸部分峰重叠，但是草酸与柠檬酸出峰时间短，且分离度很好；在40.0mmol/L和50.0mmol/L淋洗液条件下，苹果酸和酒石酸完全重合，无法分离。

淋洗液流速对分离效果的影响

按照实验方法使用同一浓度标准溶液在淋洗液浓度20mmol/L KOH溶液条件下，通过仪器泵系统设置淋洗液流速依次0.60mL/min、0.80mL/min、1.00mL/min、1.20mL/min和1.40mL/min条件下进行流速对有机酸出峰时间试验。

通过对不同流速下标准溶液有机酸的色谱图进行比对，发现淋洗液流速决定着有机酸出峰时间，流速越快，检测时间越短。在流速为0.60mL/min和0.80mL/min的条件下，柠檬酸未出峰；在流速为1.00mL/min的条件下，柠檬酸出峰时间在19min左右；在流速为1.20mL/min和1.40mL/min的条件下，分析周期短，但是苹果酸与酒石酸没有完全分离。所以等度洗脱无法测定，因此选择梯度洗脱。根据以上研究结果实验选择在0-12min用10.0mmol/L KOH淋洗液，15-23min用30.0mmol/L KOH淋洗液条件下，有机酸能很好分离，且能在25min内完成样品检测。

由图3-a，图3-b可以看出，在梯b度淋洗的条件下绿原酸和苹果酸与其他物质依然无法分开，无法精确测定其含量，故只测定酒石酸、草酸和柠檬酸的含量。

氢氧化钾浓度对提取率的影响

称取0.4000g山楂粉末，分别加入10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L、40mmol/L、50mmol/L氢氧化钾溶液40.0mL，温度20℃，功率100W，超声时间分别为30min条件下提取。

从图4-a和图4-b可以看出不同浓度的提取液浓度对各个有机酸提取率的结果有影响，在KOH浓度为40mmol/L的条件下提取率最高。

提取时间对提取率的影响

称取0.4000g山楂粉末，加入40mmol/L氢氧化钾溶液40.0mL，温度20℃，功率100W，超声时间分别为20min、30min、40min、50min、60min条件下提取。

从图5-a，图5-b，图5-c可以看出不同提取时间对各个有机酸提取率的结果有影响，提取时间为20min时样品中酒石酸和草酸的总提取率最低，这可能是由于提取时间较短。在30min时达到最大值，随后总提取率略有降低，总提取率下降趋势可能是由于随着提取时间的延长，杂质的浸出率增大从而导致有机酸总提取率呈下降趋势。

提取功率对提取率的影响

称取0.4000g山楂粉末，加入40mmol/L氢氧化钾溶液40.0mL，温度20℃，超声时间为30min，功率分别设为100W、200W、300W、400W、500W条件下提取。仪器的可调范围最低100W。

从图6-a，图6-b，图6-c可以看出不同提取功率对各个有机酸提取率的结果有影响，当功率为100W时各个有机酸的提取率最大。

标准曲线的绘制

通过对仪器条件优化试验，得出最佳仪器工作条件为：0～12min KOH浓度为10mmol/L，15～23min KOH浓度为30mmol/L，流速1.00mL/min。待仪器基线稳定后，将2.2.2以配好的有机酸标准曲线工作溶液依次进行检测。以各个单标有机酸的出峰时间来定性，峰面积定量进行线性拟合，重复次数11。采用3s计算方法测定各阴离子的方法最低检出限(DL＝3s/k)，各有机酸标准曲线的线性方程、相关系数、线性范围和检出限见表1

表1 方法线性范围、相关系数和检出限(n＝11)

样品测定及回收实验

准确称取未知含量的山楂粉末，定容至50mL，其中一份精密加入酒石酸、草酸和柠檬酸标准溶液，按优化的色谱条件进样25μL。

表2 回收实验结果

表3 山楂样品分析结果

计算结果表明，酒石酸的回收率为90.7％、草酸的回收率为98.8％、柠檬酸的回收率为100.5％，此方法加样回收率较高，可用于酒石酸、草酸和柠檬酸的含量测定。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。