一种固态罗伊氏乳杆菌微生态制剂的制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种固态罗伊氏乳杆菌微生态制剂的制备方法，具体步骤如下：制备MRS培养基备用；将罗伊氏乳杆菌接种于MRS培养基上，37℃培养30‑36h，如此连续活化3‑5次后，再接种于MRS培养基中，37℃培养24h得到菌种罗伊氏乳杆菌种子液；将豆粕、豆粉、玉米粉、麸皮、甜菜碱、甘露糖混合均匀得到固态培养基；将种子液按照接种到固态培养基中，于37℃，固态发酵24‑28小时；烘干、装袋，密封保存。产物中罗伊氏乳杆菌活菌数达到3.2±0.5×10

说明书

技术领域

本发明属于微生态制剂领域，具体涉及一种固态罗伊氏乳杆菌微生态制剂的制备方法和应用。

背景技术

微生态制剂作为一种新型的无毒、无污染的微生物制品类饲料添加剂，在调节动物机体微生态平衡、预防疾病、提高饲料转化率、提高动物生产性能和保护生态环境等方面有着其他添加剂不可替代的作用。

乳酸菌是益生菌的最主要来源，关于乳酸菌在动物生产中的应用及相关机制的探索也逐渐深入。乳酸菌能够调节胃肠道的菌群平衡，中和病原菌所产生的毒素，降低肠pH值、乳酸菌除产生抗菌物质之外，有些乳酸菌产生类似于细菌素的抑菌物质，抑制病原菌和部分真菌的的粘附和定植生长，如罗伊氏乳杆菌能够减少及缓解各种腹泻疾病的发生；调节免疫：乳酸菌以免疫调节因子的形式起作用，刺激肠道某种局部免疫反应，提高动物抗体水平或提高巨噬细胞的活性，进而提高抗病力；增强消化：消化道内的乳酸菌可利用碳水化合物等发酵产生乳酸，乳酸可提高机体对钙、磷、铁的利用率，促进铁和维生素D的吸收，乳酸还能够抑制植酸对肠道中磷和钙的络合，增加机体对磷和钙的吸收。

随着人们生活水平的提高和对健康养殖的重视，开发适合大规模生产的高质量益生菌制剂，提高畜禽生产性能和健康水平，提高养殖效率具有重要的现实意义。

我国是世界第一养猪大国，但生产水平和欧美发达国家相比还有很大差距，特别是在母猪饲养管理上面，发达国家规模化养殖场母猪可以每年产出27头商品猪，而我国是18头左右。在养猪生产中，提高生产效率和降低生产成本是养猪业追求的目标。母猪的繁殖性能是养猪业至关重要的指标，其生产效率决定了整个养猪业的效益。母猪在养猪业中是一个特殊的群体，特别是在怀孕后身体机能会出现一系列的变化，如果营养没做好，会对产仔数和断奶重有很大的影响。由于人们对消化道中菌群平衡不够重视，动物消化道微生态的紊乱会导致动物发生疾病。而母猪的特殊生理期不宜使用抗生素和抗菌药物，给饲喂母猪益生菌显得尤为重要。

在日粮中添加一定剂量的益生菌制剂不仅对改善机体的免疫力、体质、生产性能而且对环境具有一定促进作用。目前国内在怀孕母猪上使用的益生菌制剂的报道较为少见，多在仔猪上应用。然而只有改善怀孕母猪的体质和免疫力才能使仔猪的体质和抗病力得到有效的改善。

益生菌作为饲料添加剂具有多种功能，但目前由于我国微生态制剂的使用不规范，致使应用效果不明显，作用或正或负。其主要原因有：①缺少源头性研究，菌种多数是引自国外，经反复扩培，逐渐失去优良特性，仍用于饲料中。②菌株的剂量和浓度不够，产品中必须含有相当数量的活菌数和一定添加量才能达到应用效果。③活菌进入消化道后，多数不易耐受胃酸和胆酸的作用，难有足够的数量到达肠道发挥作用，不能很好起到抑制致病菌的作用。④微生态制剂应用缺少针对性，较少考虑作用对象、没有考虑到菌种的同源筛分和同源饲喂。⑤安全性不够，有些芽孢杆菌如蜡样芽孢杆菌能污染食物，会产生毒素，引起食物中毒。

而现实中，乳酸菌制剂多为液态，其中所含的活菌数量达不到要求。这不仅妨碍在饲料中添加，且达不到使用效果。如何将发酵成熟的液态制剂变成固态，并保证活菌数量值得研究。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种一种固态罗伊氏乳杆菌微生态制剂的制备方法和应用。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种固态罗伊氏乳杆菌微生态制剂的制备方法，具体步骤如下：

(1)菌种的选择

选择罗伊氏乳杆菌在4℃条件下保存备用；

(2)MRS培养基的制备

将蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、吐温80、磷酸氢二钾、乙酸钠、柠檬酸氢二铵、硫酸镁、硫酸锰、蒸馏水，加热溶解，调节pH值为6.7，分装后，121℃高压蒸汽灭菌20min，备用；

(3)菌种的活化与种子液的获得

将保存在4℃的罗伊氏乳杆菌接种于MRS培养基上，37℃培养30-36h，如此连续活化3-5次后，再接种于MRS培养基中，37℃培养24h，得到菌种罗伊氏乳杆菌种子液；

(4)固态培养基的制备

将豆粕、豆粉、玉米粉、麸皮、甜菜碱、甘露糖混合均匀得到固态培养基；

(5)发酵

将菌种罗伊氏乳杆菌种子液按照5％的接种量接种到固态培养基中，并加入自来水，使得水分含量达50％，搅拌均匀后，放于37℃恒温箱中，固态发酵24-28小时；

(6)烘干：将固态发酵后的罗伊氏乳杆菌微生态制剂，放入恒温干燥箱中，干燥温度为37-45℃，摊开，使厚度不超过6厘米，烘至水份含量达到16-20％，即可装袋，密封保存。

优选地，步骤(2)中MRS培养基具体制备方法如下：将10.0g蛋白胨、10.0g牛肉膏、5.0g酵母膏、20.0g葡萄糖、1.0mL吐温80、2.0g磷酸氢二钾、5.0g乙酸钠，2.0g柠檬酸氢二铵、0.58g硫酸镁、0.25g硫酸锰、1000mL蒸馏水，加热溶解，调节pH值为6.7，分装后，121℃高压蒸汽灭菌20min，备用。

优选地，步骤(4)中固态培养基中个原料的重量百分比如下：豆粕：豆粉：玉米粉：麸皮：甜菜碱：甘露糖＝12-18:12-18:7-11:7.5-11.5:0.8-1.2:0.4-0.6。

进一步地，一种固态罗伊氏乳杆菌微生态制剂的应用，其能够用于猪饲料的添加剂。

本发明的有益效果在于：

1、本发明的产品质量稳定，适用于大规模生产。产品中罗伊氏乳杆菌活菌数达到3.2±0.5×10⁹活菌单位每克(CFU/g)，产品的pH值为3.41-3.61；将密封好的固态罗伊氏乳杆菌微生态制剂放在室温下保存，分别于7天、15天、30天后，检测其中罗伊氏乳杆菌活菌数量。结果表明7天后活菌数为3.0±0.2×10⁹CFU/g，14天后活菌数为2.7±0.2×10⁹CFU/g，30天后活菌数为1.8±0.3×10⁹CFU/g。数量均超过国家饲用微生态添加剂活菌含量要求(>10⁸CFU/g)。产品的酸碱度维持在3.50±0.15。

2、本发明的产品作为猪饲料添加剂，具有降低母猪流产发生率，减少人工授精的频率和成本，降低母猪的死亡率；提高母猪的生产性能；降低哺乳仔猪腹泻发生率等功效。

附图说明

图1为不同组的产仔数量柱形图；

图2为不同组的初生窝重柱形图；

图3为不同组的出生均重柱形图；

图4为不同组的仔猪在断奶时候的重量柱形图；

图5为不同组的仔猪死亡率柱形图；

图6为不同组的腹泻率柱形图。

具体实施例

实施例1

一种固态罗伊氏乳杆菌微生态制剂的制备方法，具体步骤如下：

(1)菌种的选择

选择罗伊氏乳杆菌(由中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)专利保藏，保藏编号为CCTCC M 2015660)在4℃条件下保存备用；

(2)MRS培养基的制备

将10.0g蛋白胨、10.0g牛肉膏、5.0g酵母膏、20.0g葡萄糖、1.0mL吐温80、2.0g磷酸氢二钾、5.0g乙酸钠，2.0g柠檬酸氢二铵、0.58g硫酸镁、0.25g硫酸锰、1000mL蒸馏水，加热溶解，调节pH值为6.7，分装后，121℃高压蒸汽灭菌20min，备用。

(3)菌种的活化与种子液的获得

将保存在4℃的罗伊氏乳杆菌接种于MRS培养基上，37℃培养30-36h，如此连续活化3-5次后，再接种于MRS培养基中，37℃培养24h，得到菌种罗伊氏乳杆菌种子液；

(4)固态培养基的制备

将豆粕、豆粉、玉米粉、麸皮、甜菜碱、甘露糖混合均匀得到固态培养基，其中，豆粕：豆粉：玉米粉：麸皮：甜菜碱：甘露糖的重量百分比为12-18:12-18:7-11:7.5-11.5:0.8-1.2:0.4-0.6。

(5)发酵

将菌种罗伊氏乳杆菌种子液按照5％的接种量接种到固态培养基中，并加入自来水，使得水分含量达50％，搅拌均匀后，放于37℃恒温箱中，固态发酵24-28小时。

(6)烘干：将固态发酵后的罗伊氏乳杆菌微生态制剂，放入恒温干燥箱中，37-45℃，摊开，使厚度不超过6厘米，烘至水份含量达到16-20％，即可装袋，密封保存。

产品的性能如下：

产品活菌数：用选择性计数培养基，采用平板计数法，检测烘干后罗伊氏乳杆菌活菌数，达到3.2±0.5×10⁹活菌单位每克(CFU/g)。

产品酸碱度：采用稀释过滤技术，使用pH计，检测产品的酸碱度，得出产品的pH值为3.41-3.61。

货架时间：将密封好的罗伊氏乳杆菌制剂放在室温下保存，分别于7天、15天、30天后，检测其中罗伊氏乳杆菌活菌数量。结果表明7天后活菌数为3.0±0.2×10⁹CFU/g，14天后活菌数为2.7±0.2×10⁹CFU/g，30天后活菌数为1.8±0.3×10⁹CFU/g。数量均超过国家饲用微生态添加剂活菌含量要求(>10⁸CFU/g)，产品的酸碱度维持在3.50±0.15。

实施例2

试验动物及分组

选择健康、体重均匀的80头(胎次相近的母猪)，基础日粮为参照美国国家研究委员会(NRC，1998)标准及中华人们共和国农业行业标准(猪词养标准，NY/T65-2004)母猪营养需要配合而成，基础日粮组成及营养水平见表1。随机分成4组(每20头)，I、II、III组分别为市场上购买的益生乳酸杆菌组、本发明的固态罗伊氏乳杆菌微生态制剂组、市场上购买的复合益生菌组，添加量皆为0.5％，使基础日粮中的活菌数量达到1.0×10⁷CFU/mL，见表2所示。饲喂方式：将益生菌制剂混入基础日粮中，每头单圈饲养，饲喂周期为整个怀孕期及哺乳期(怀孕期114天，哺乳期21天)共135天。

表1 试验母猪基础日粮的配方组成

其中，预混料为每千克饲粮提供：VA6000IU，VD32100IU，VE 36IU，VK31.7mg，硫胺素thiamine 5.0mg，核黄素riboflavin 2.0mg，VB61.8mg，VB120.02mg，氯化胆碱cholinechloride 800mg，烟酸nicotinic acid 20.0mg，泛酸pantothenic acid 10.0mg，生物素biotin 0.08mg，叶酸folic acid 1.0mg，Mn 25.0mg，Zn 50.0mg，Cu 5.0mg，I 0.14mg，Se0.224mg，Fe，80mg。

表2 动物实验分组

每天观察试验猪的健康状况。各圈环境一致，怀孕母猪于限位栏饲养，每日定时饲喂两次(早晨5:10，下午14:10)，于分娩前5-7天转群至产房，至产床上饲养，直至断奶。试验期内定期消毒，疫苗注射及其它程序同场内其它猪群。

测定指标

1、妊娠母猪发病及死亡情况

观察妊娠母猪每天的采食、健康状况、发病情况，进行记录。

2、母猪繁殖性能

记录产仔数、初生窝重、初生均重、断奶重、仔猪死亡率。

3、哺乳仔猪的腹泻情况

每天记录各个组哺乳仔猪腹泻头数，计算整个哺乳期的腹泻率

腹泻率(％)＝(A÷B)×21×100

A为每组发生腹泻的仔猪头数，B为每组哺乳仔猪总头数。

数据用SPSS17.0软件进行统计分析，差异显著者进行Duncan氏进行多重比较，以P<0.05作为差异显著性判断标准。

试验结果：

1、整个妊娠期期间，各组母猪流产头数：空白对照组2头，试验Ⅰ组1头、试验Ⅱ组0头、试验Ⅲ组1头。死亡情况：空白对照组死亡1头，其他3组皆为0。

2、母猪繁殖性能结果见图1-5；

从图1-5可以看出：空白对照组平均产仔数为12.16头，试验Ⅱ、Ⅲ组与对照组相比差异不显著(P>0.05)，试验Ⅰ组显著低于空白对照组。初生窝重试验Ⅱ组为18.51kg，比空白对照组重约2.15kg，差异极显著(P<0.01)。初生均重试验Ⅱ组为1.53kg，极显著高于空白对照组1.34kg(P<0.01)，由于试验Ⅰ组母猪产仔数量少，所以均重最大。断奶重试验Ⅱ组为7.04kg，比空白对照组高0.77kg，差异极显著(P<0.01)。哺乳期间仔猪死亡率试验Ⅱ组为2.01％，极显著低于空白对照组(P<0.01)，降幅为2.09％。

3、整个哺乳期间仔猪腹泻发生率如图6所示，空白对照组为13.28％，各益生菌添加组极显著低于空白对照组(P<0.01)，试验Ⅱ组腹泻率最低(P<0.01)，比空白对照组低7.89％。

与其它产品比较的效果

本发明的产品，与其它益生菌相比，具有耐盐、耐人工胃液和胆盐能力，可耐过机体胃肠道内环境，可抵达肠道发挥作用，并且安全、无毒副作用，活菌数量符合标准；具有降低母猪流产发生率，减少人工授精的频率和成本，降低母猪的死亡率；提高母猪的生产性能；降低哺乳仔猪腹泻发生率等功效。给母猪使用本发明的微生态制剂可以降低治疗用抗生素的使用量，从而提高肉的品质和安全，减少对环境的污染。罗伊氏乳杆菌作为一种绿色、无污染的微生态制剂优于其他同类产品，值得在母猪临床上推广应用。