检测Y染色体微缺失的多重PCR引物组、试剂盒和应用

摘要

本发明涉及基因缺失检测领域，具体涉及一种检测Y染色体微缺失的多重PCR引物组、试剂盒和应用。所述多重PCR引物组包括通用引物和特异性引物，所述通用引物具有如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的碱基序列：其中，SEQ ID NO：1所示碱基序列的5’端标记有荧光基团；所述特异性引物包括具有如SEQ ID NO：3～SEQ ID NO：22所示碱基序列的引物。本发明克服了传统多重PCR灵敏度低、非特异性扩增等缺点，通过一套新型的稳定的通用引物‑多重PCR的反应体系结合荧光标记通用引物的方法，扩增产物经毛细管电泳分析，确保了检测的高灵敏度，有效降低了成本，并且可以实现大样本量的高效检测。

说明书

技术领域

本发明涉及基因缺失检测领域，更具体地，涉及一种检测Y染色体微缺失的多重PCR引物组、包括多重PCR引物组的该试剂盒和所述多重PCR引物组及试剂盒作为检测Y染色体微缺失试剂的应用。

背景技术

根据世界卫生组织(WHO)的研究报告，全世界约有15％的育龄夫妇被不孕(育)症所困扰，其中男性因素约占50％。30％以上男性生不育是由于遗传学因素导致，主要为克氏综合征和Y染色体微缺失。细胞遗传学和分子生物学研究证实位于Y染色体长臂上的无精子因子(azoospermia factor，AZF)区域的微缺失可以造成生精障碍，导致无精症或严重少精子症。Vogt等人将AZF区分为AZFa、AZFb和AZFc三个亚区，1998年Vogt等人发现AZFb区和AZFc区之间还存在AZFd区。任何一个亚区的微缺失都可能导致生精障碍，而睾丸的病理改变与AZF区微缺失的部位存在明显的相关性。目前检测Y染色体AZF区微缺失已经成为男性无精症或少精症患者的常规检查。AZF区微缺失是否存在，为遗传咨询提供依据，也为临床诊断与后续治疗提供指导。辅助生殖技术的快速发展，尤其是卵细胞胞浆内精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)技术给男性不育患者带来了希望，然而某些类型的Y染色体微缺失患者无法通过自身睾丸取精进行ICSI。另外，ICSI技术的局限性是：有可能将携带有染色体异常或者基因突变等遗传缺陷的精子注入到卵细胞内，卵子受精发育，所携带的遗传缺陷传递给下一代。因此，临床上建议精子浓度＜5×10⁶/mL的男性都要进行Y染色体微缺失的检测。这不仅可以为无精症或少精症患者的遗传咨询提供依据，也为临床诊断与后续治疗提供指导，避免不必要的药物和手术治疗以及遗传缺陷的传递。

因此，建立一种简单快速、准确度高且低成本的分子遗传学检测方法对临床具有重要意义。

目前Y染色体AZF区微缺失的检测主要是针对Y染色体特定序列标签位点(STS)。根据欧洲男科协会(EAA)和欧洲分子遗传质控网(EMQN)联合发布的《Y染色体微缺失的最佳实践操作指南》(2013年)，推荐采用多重PCR检测AZF区的6个STS(AZFa：sY84，sY86；AZFb：sY127，sY134；AZFc：sY254，sY255)。在此基础上，各个检测实验室可选择性地增加STS的数量进行更精确的检测。目前检测AZF区微缺失的方法包括多重PCR-凝胶电泳法、多重荧光PCR法、芯片杂交法、多重连接探针扩增(MLPA)等多种方法。最常用的是针对序列标签位点(STS)，采用多重PCR扩增-凝胶电泳检测，根据条带的有无对AZF各区的缺失情况做出定性分析。目前该方法已成为检测AZF微缺失的行业“金标准”；但是该方法的检测敏感性不高，凝胶电泳易造成PCR产物污染导致假阳性；每个样本需要3-4组PCR反应，操作繁琐，其检测通量小，不适用于对大样本量的检测。多重荧光PCR方法具有简便、快速、准确的特点，但是探针设计繁琐并且需要报告基团修饰，价格昂贵，不适合临床推广使用。目前，根据上述这两种检测方法，已有多种的Y染色体微缺失检测试剂盒面世。芯片杂交技术也有报道用于检测AZF区微缺失，该方法具有极高的准确度和灵敏度；但是该方法需要设计大量的探针，成本较高，并且其检测、分析也较为复杂，不适合临床医生判读。MRC-Holland公司的MLPA试剂盒(P360Y-Chromosome)通过探针杂交、连接手段分析Y染色体特定区域相对拷贝数，该方法覆盖的范围广、能准确定量分析，但是其结果分析复杂，解读还不完善，目前还只适用于基础研究领域。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的上述缺陷，提供一种检测Y染色体微缺失的多重PCR引物组、包括多重PCR引物组的该试剂盒和所述多重PCR引物组及试剂盒作为检测Y染色体微缺失试剂的应用。本发明克服了传统多重PCR灵敏度低、非特异性扩增等缺点，通过一套新型的稳定的通用引物-多重PCR的反应体系结合荧光标记通用引物的方法，扩增产物经毛细管电泳分析，确保了检测的高灵敏度，有效降低了成本，并且可以实现大样本量的高效检测。毛细管的方法具有较高的分辨度和灵敏度，可以检测单个核苷酸的差异，毛细管电泳图清晰直观，易于判读，减少假阴性和假阳性结果率，提高了Y染色体微却缺诊断的准确性。

为了实现上述目的，本发明提供一种检测Y染色体微缺失的多重PCR引物组，该多重PCR引物组包括通用引物和特异性引物，

所述通用引物具有如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的碱基序列：

正向Dye-UniversalP-Forward(FAM-UP-F)：5’-GGTGACCAAGTTCATGCTCT-3’(SEQID NO：1)

反向UniversalP-Reverse(UP-R)：5’-GGTCCAGGTCACGAGATCTT-3’(SEQ ID NO：2)

其中，SEQ ID NO：1所示碱基序列的5’端标记有荧光基团Dye；

所述特异性引物包括具有如SEQ ID NO：3～SEQ ID NO：22所示碱基序列的引物。具体如表1所示。

所述引物组包括了针对8个STS位点(AZFa：sY84，sY86；AZFb：sY127，sY134；AZFc：sY254，sY255；AZFd：sY145，sY152)和2个内对照(SRY，ZFX/Y)的特异性引物序列和一对通用引物序列。

通用引物中正向引物的5’端标记有荧光基团，所述荧光基团为FAM、HEX、VIC、TET、JOE、ROX、TEXAS-RED、CY3、CY5或CY5.5。

根据本发明，多重PCR引物组中，SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：22的摩尔比优选为(2-20)：(2-20)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)。上述优选比例的各个引物，能够获得更好的检测效果。

根据本发明的第二方面，本发明提供一种检测Y染色体微缺失的试剂盒，该试剂盒包括：

如上所述的多重PCR引物组；

多重PCR反应试剂。

其中，所述多重PCR反应试剂包括但不限于：MgCl₂、甜菜碱、热启动Taq酶、dNTPs和PCR反应缓冲液。

上述PCR反应试剂，可根据本领域常规方式进行自行配制或通过普通市售获得。

根据本发明，试剂盒中，所述MgCl₂的浓度为50-200mmol/L；所述甜菜碱的浓度为5-20mol/L；所述dNTPs的浓度为5-20mmol/L。

使用时，所述MgCl₂的终浓度为1.0～5.0mmol/L；所述甜菜碱的终浓度为0.5～2.5mol/L；所述dNTPs的终浓度为50～1000μmol/L。

根据本发明，优选地，该试剂盒包括：对照DNA标本。进一步优选地，所述DNA标本为正常男性对照标本、AZFa区缺失对照标本、AZFb区缺失对照标本和AZFc区缺失对照标本中的至少一种。优选地，包括上述全部对照DNA标本。

根据本发明的第三方面，本发明还提供上述的多重PCR引物组或上述的试剂盒作为检测Y染色体微缺失试剂的应用。

应用本发明的多重PCR引物组或试剂盒可用于男性Y染色体微缺失通用引物-多重PCR检测，检测方法包括以下步骤：

1)从待测人外周血、口腔黏膜上皮细胞、干血片或者组织切片提取人基因组DNA；

2)以步骤1)所得DNA为模板，利用所述多重PCR引物组进行PCR扩增；

3)多重PCR产物经毛细管电泳分析。

本发明的8对引物分别特异性扩增AZF区4个亚区，2对内对照引物扩增男性特有基因。每条引物的正反向引物的5’端含有一段20bp的共同序列。设计的通用引物序列与这一段序列完全一致，并在正向通用引物5’端连接荧光基团。本发明利用一管PCR反应体系实现10对引物的特异性扩增，同时利用带荧光的通用引物对所有特异性扩增的目的片段二次扩增并带上荧光，扩增产物片段长度呈梯度分布，结果通过毛细管电泳分析，以达到简单、快速、高通量和经济的目的。

与现有检测试剂盒及方法相比，本发明具有以下突出优点：

1)检测体系里只需要一个单末端荧光标记的引物，不需要多个Taqman等荧光探针，大大降低了成本。

2)单管PCR即可完成所有位点的检测，节省了成本又简化了操作，既适用于小样本的检测，也适用于大样本的通量检测。

3)涵盖了AZF 4个亚区的8个缺失热点的检测，同时引入SRY和ZFX/Y基因作为内对照保证了结果的准确性。

4)通过优化的引物设计，本发明具有稳定的、高效的PCR反应体系。不仅可以应用于外周血样本，同样适用于极其微量的样品，如口腔黏膜脱落细胞、干血片、组织切片等。

本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述。

图1示出了不同结果的特征峰，其中Ⅰ行示出了正常男性样本经多重PCR在10个检测位点(8个STS位点+2个对照位点)的扩增峰；Ⅱ行示出了AZFa区缺失[sY84(-)，sY86(-)]样本经多重PCR在10个检测位点的扩增峰；Ⅲ行示出了AZFb区缺失[sY127(-)，sY134(-)]样本经多重PCR在10个检测位点的扩增峰；Ⅳ行示出了AZFc区和d区sY152缺失[sY254(-)，sY255(-)，sY152(-)]样本经多重PCR在10个检测位点的扩增峰；Ⅴ行示出了AZFb+c+d区缺失[sY127(-)，sY134(-)，sY127(-)，sY134(-)，sY254(-)，sY255(-)，sY145(-)，sY152(-)]样本经多重PCR在10个检测位点的扩增峰；f)；Ⅵ行示出了AZFa+b+c+d区缺失[sY84(-)，sY86(-)，sY127(-)，sY134(-)，sY127(-)，sY134(-)，sY254(-)，sY255(-)，sY145(-)，sY152(-)]样本经多重PCR在10个检测位点的扩增峰；Ⅶ行示出了正常女性样本经多重PCR在10个检测位点的扩增峰。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本发明的优选实施方式。

实施例1外周血样本检测AZF区微缺失

1、材料：

1例正常已育男性样本、1例正常已育女性样本和5例已经确诊的AZF微缺失型少精或无精症男性患者样本：1例AZFa区缺失样本(-sY84，-sY86)、1例AZFb区缺失样本(-sY127，-sY134)、1例AZFc区和d区sY152缺失样本(-sY254，-sY255，-sY152)、1例AZF b+c+d区连续缺失样本(-sY127，-sY134，-sY254，-sY255)、1例AZFa+b+c+d区连续缺失样本(-sY84，-sY86，-sY127，-sY134，-sY254，-sY255)。所有样本均已通过EAA/EMQN(2013版)的Y染色体微缺失检测指南推荐的多重PCR-凝胶电泳和实时荧光定量PCR方法验证。

2、基因组DNA的提取

使用OMEGA公司“基因组DNA抽提试剂盒”从EDTA抗凝全血中提取人基因组DNA。

3、多重PCR扩增与检测

所有引物在公司合成，其中通用引物的正向引物5’端选用FAM修饰，其余引物无需特殊修饰，所有引物经高效液相色谱(HPLC)纯化。

多重引物组合：每对正、反向引物按照1：1混合，终浓度10μmol/L，然后将各组引物sY84：sY86：sY127：sY134：sY254：sY255：sY145：sY152：SRY：ZFX/Y：FAM-UP-F：UP-R按照3：2：2：2：1：1：2：2：2：3：3：4的比例配置成多重PCR引物组合存储液。

PCR实验选择Kapa Biosystems公司的KAPAHiFi PCR试剂盒(KK2501)。为了减少人为误差，简化操作流程，本实施例中首先将PCR扩增试剂配置成Mix(包括缓冲溶液、dNTPs、H₂O、引物组、HiFi>

表2.多重PCR反应体系

PCR反应在ABI PCR仪器上进行，按以下条件进行扩增检测：

第一阶段：95℃3min；

第二阶段：95℃15sec，62℃30sec，72℃45sec，10个循环；

第三阶段：95℃15sec，58℃30sec，72℃45sec，15个循环。

第四阶段：72℃15min。

4、毛细管电泳分析

多重PCR产物采用ABI Applied Biosytems公司的3130XL分析仪。取1μL多重PCR产物与8.5μL甲酰胺、0.5uL分子量内标LIZ500Size混合，95℃加热3min，-20℃快速降温并放置3min，上机检测，结果经Gene-Mapper软件分析。检测位点与相应的电泳坐标位置如下：ZFX/Y(527±1)、SRY(509±1)、sY254(425±1)、sY84(371±1)、sY86(361±1)、sY134(347±1)、sY127(317±1)、sY145(192±1)、sY152(175±1)、sY255(168±1)。

阳性对照：以正常男性基因组DNA作为模板的多重PCR，在上述10个坐标位置均有明确的扩增峰。

内对照：以待测男性基因组DNA作为模板的反应管内，SRY(509±1)、ZFX/Y(527±1)位置均有明确的扩增峰。

5、结果分析

(1)毛细管电泳结果的横坐标显示为扩增片段的大小，纵坐标显示为扩增片段的荧光强度，间接反应片段扩增的量。每一个单一扩增峰代表一个扩增片段，没有扩增峰则表示该片段没有扩增，该STS位点为缺失。其中，在100bp左右的位置有时会出现低矮的扩增峰，属于非特异扩增的峰，不干扰结果的判读，也不影响结果的准确性，不需考虑。

(2)阳性对照组在8个STS位点(sY84，sY86，sY127，sY134，sY254，sY255，sY145，sY152)和2个内对照(SRY，ZFX/Y)具有单一、清楚的扩增峰(如图1的Ⅰ行所示)；AZF区完全缺失样本在这8个STS位点均无扩增，在2个内对照(SRY，ZFX/Y)具有扩增峰(如图1的Ⅵ行所示)；正常女性对照在这8个STS位点和SRY位点均无扩增峰(如图1的Ⅶ行所示)，只有ZFX/Y位点具有扩增峰；空白对照在所有位点均无扩增峰。

(3)AZF区微缺失判定：当2个内对照位置有明确的峰值，只有(-sY84，-sY86)位置不存在扩增峰，其余STS扩增峰存在，则表明AZFa区缺失(如图1的Ⅱ行所示)；只有(-sY127，-sY134)位置不存在扩增峰，则表明AZFb区缺失(如图1的Ⅲ行所示)；只有(-sY254，-sY255)位置不存在扩增峰，则表明AZFc区缺失(如图1的Ⅳ行所示)；只有(-sY145，-sY152)位置不存在扩增峰，则表明AZFd区缺失；当连续多个STS为点不存在扩增峰，则表明AZF亚区同时缺失(如图1的Ⅴ行和Ⅵ行所示)。

上述实验结果证实，本发明的多重PCR引物和试剂盒用于检测Y染色体微缺失的方法可靠、灵敏度高，成本低，并且可以实现大样本量的高效检测。

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

SEQUENCE LISTING

<110> 郑州大学第一附属医院

<120> 检测Y染色体微缺失的多重PCR引物组、试剂盒和应用

<130> 1700021

<160> 22

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggtgaccaag ttcatgctct 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggtccaggtc acgagatctt 20

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggtgaccaag ttcatgctct cgctgtactg actgtgatta cac 43

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggtccaggtc acgagatctt cgtctttggt atcygagaaa gt42

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggtgaccaag ttcatgctct cggaatattc ccgctctccg ga42

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggtccaggtc acgagatctt cggctggtgc tccattcttg ag42

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggtgaccaag ttcatgctct cggggtgtta ccagaaggca aa42

<210> 8

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggtccaggtc acgagatctt cggaaccgta tctaccaaag cagc44

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ggtgaccaag ttcatgctct cgagaagggt ctgaaagcag gt42

<210> 10

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggtccaggtc acgagatctt cggcctacta cctggaggct tc42

<210> 11

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ggtgaccaag ttcatgctct cggtgacaca cagactatgc ttc 43

<210> 12

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ggtccaggtc acgagatctt cgacacacag agggacaacc ct42

<210> 13

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ggtgaccaag ttcatgctct cggtctgcct caccataaaa cg42

<210> 14

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ggtccaggtc acgagatctt cgaccactgc caaaactttc aa42

<210> 15

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ggtgaccaag ttcatgctct cgggctcaca aacgaaaaga aa42

<210> 16

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ggtccaggtc acgagatctt cgctgcaggc agtaataagg ga42

<210> 17

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ggtgaccaag ttcatgctct cgcaacacaa aaacactcat atactcg 47

<210> 18

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ggtccaggtc acgagatctt cgtggcactt gagaataatt gtatgt46

<210> 19

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ggtgaccaag ttcatgctct cgacgaaaga cagtctgcca tgtttc46

<210> 20

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ggtccaggtc acgagatctt cgcctgacag gagggtactt agcagt46

<210> 21

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ggtgaccaag ttcatgctct cggttacagg attcggcgtg at42

<210> 22

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ggtccaggtc acgagatctt cgctcgtcat gtgcagccac 40