一株在可溶性和非可溶性碳源诱导下高产纤维素酶的里氏木霉基因工程菌及构建方法和应用

摘要

本发明涉及基因工程及微生物发酵领域，公开了一株在可溶性和不可溶性碳源诱导下高产纤维素酶的里氏木霉基因工程菌SEU‑7，其分类命名为Trichoderma reesei，菌株号SEU‑7，已保藏于中国典型微生物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2016492，保藏日期为2016年9月18日。本发明还公开了该基因工程菌的构建方法及其在不同碳源诱导下生产纤维素酶的应用。与现有技术相比，本发明利用同源重组技术构建了高产纤维素酶的里氏木霉基因工程菌，其在可溶性碳源和非可溶性碳源的诱导下，均表现出极高的产纤维素酶的能力。同时，本发明所产纤维素酶液表现出了比Rut‑C30的纤维素酶液更好的糖化能力。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株在可溶性和非可溶性碳源诱导下高产纤维素酶的里氏木霉基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

纤维素是自然界中广泛存在的大分子多糖聚合物。利用纤维素酶可以将纤维素降解成细菌可发酵利用的糖类用以生产生物燃料、生物基精细化工产品和药品。纤维素酶是一类复杂的酶混合物，主要包含内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。纤维素的彻底降解需要这三种酶的协同作用。内切葡聚糖酶作用于纤维素的非结晶区，将纤维素降解成不同长度的纤维寡糖，然后纤维寡糖在纤维二糖水解酶即外切葡聚糖酶的作用下降解成纤维二糖，最后纤维二糖在β-葡萄糖苷酶的作用下水解成可发酵性的葡萄糖。

里氏木霉因能够产生大量(高达100g/L)胞外纤维素酶，且是人工安全的微生物菌种，成为了重要的纤维素酶工业生产菌株(Journal of biotechnology,1994,37(3):193-200)。然而，只有少量的β-葡萄糖苷酶(BGL1)分泌到细胞外，而工业上收集纤维素酶只是收集上清液中的纤维素酶，无法同时收集胞内的β-葡萄糖苷酶(BGL1)，导致所得纤维素酶液中的β-葡萄糖苷酶(BGL1)的含量很低，无法充分降解纤维素。里氏木霉纤维素酶属于诱导型酶。01以纤维素作为底物时可以促进纤维素酶的产生。但是纤维素本身可能并不是纤维素酶的真正诱导物，因为这种不可溶性的纤维素物并不能进入到真菌细胞内。纤维素的不可溶性，使得纤维素酶的生产与分离变得复杂，因此采用不可溶性的纤维素诱导纤维素酶产生在工业生产上并不理想。因而，可溶性的诱导物更受关注，像纤维二糖、乳糖、槐糖等都是可溶性纤维素酶诱导物。在它们当中，乳糖是最重要以及具有经济可行性的纤维素酶诱导物，但诱导效果不如纤维素。这促使人们努力寻找一种能够提高乳糖诱导效率的基因工程菌。

通过代谢工程以及基因工程手段改造里氏木霉菌株获得高产纤维素酶基因工程菌以及寻找可溶性诱导物诱导下高产菌株是人们关注的焦点。早在20世纪70年代，科学家们对QM6a采用随机突变的办法获得了高产菌株QM9414和RUT-C30。Rut-C30是一株具有较弱碳代谢抑制的β-葡萄糖苷酶高产菌株，同时其胞外纤维素酶总水平比野生菌提高了150倍，但其生长缓慢、生孢延迟、生孢减少。为了获得高产纤维素酶菌株，科学家们将里氏木霉中的纤维素酶基因在其他微生物中过表达，如酵母菌(Molecular biotechnology,2013,54(2):158-169.Metabolic engineering,2007,9(1):87-94)，细菌(Biotechnologyletters,2012,34(1):91-96；Humana press,1996:389-397),以及植物(Journal ofbiotechnology,2007,131(3):362-369)，但是纤维素酶产量都较低。1987年等人报道了在里氏木霉中异源表达外源纤维素酶基因以提高纤维素酶产量(Yeast,1987,3:175-185)。目前，通过异源或同源过表达β-葡萄糖苷酶以获得高产纤维素酶菌株也取得了一定进展。Ma等人将斜卧青霉来源的β-葡萄糖苷酶基因在CBH1启动子作用下,在里氏木霉菌株Rut-C30中表达,所得转化子的β-葡萄糖苷酶活性提高6到8倍,滤纸活性也提高了30％，秸秆糖化能力也得到显著提高(Enzyme and microbial technology,2011,49(4):366-371)。Zhang等通过使bgl1基因在改造的四拷贝cbh1启动子控制下进行过表达，使β-葡萄糖苷酶和滤纸酶活分别增加了3.7倍和1.3倍(Bioresource technology,2010,101(24):9815-9818)。

前人研究表明槐糖(Journal of bacteriology,1979,139(3):761-769)、纤维二糖(Journal of bacteriology,1960,79(6):816)、半乳糖(Fungal biology reviews,2007,21(1):42-48)、L-山梨糖以及乳糖(Fungal Biology Reviews,2007,21(1):42-48)都可以诱导纤维素酶的产生，但是诱导效果都不是很理想。槐糖一度被认为是诱导里氏木霉纤维素酶产生的最佳诱导物(Journal of bacteriology,1979,139(3):761-769)，但它不能被其他真菌如Phanerochaete chrysosporium和Aspergillus purpurogenum(Springerberlin heidelberg,1992:1-27)所利用已生产纤维素酶。此外，槐糖价格比较昂贵，严重限制了其在工业上的大规模应用。乳糖作为乳品行业的一种副产物是一种廉价碳源，可以被多种微生物利用如含有乳糖操纵子的细菌和一些种类的酵母。现今，乳糖成为工业上诱导里氏木霉生产纤维素酶的一种常用的可溶性诱导物，然而诱导效率远远不如纤维素。为了克服乳糖诱导效果差的缺点，改进发酵过程或改造菌株使里氏木霉使其在乳糖诱导条件下高产纤维素酶是十分必要的。

本发明以里氏木霉RUT-C30为出发菌株，利用同源重组获得了一株以不可溶性碳源和可溶性碳源为诱导物高产纤维素酶的里氏木霉基因工程菌SEU-7。SEU-7发酵7天产生的胞外β-葡萄糖苷酶是出发菌株Rut-C30的37.9倍，pNPCase是出发菌株Rut-C30的8.7倍，CMCase是出发菌株Rut-C30的2.6倍，FPase是出发菌株Rut-C30的1.1倍。在乳糖诱导下，SEU-7的β-葡萄糖苷酶是出发菌株Rut-C30的153倍，pNPCase是出发菌株Rut-C30的14倍，CMCase是出发菌株Rut-C30的9倍，FPase是出发菌株Rut-C30的1.7倍。SEU-7菌株24h的纤维素糖化能力相对于出发菌株RUT-C30提高了近50％。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种在碳源诱导下高产纤维素酶的里氏木霉基因工程菌，以解决现有技术存在的β-葡萄糖苷酶产量低和可溶性诱导物诱导产纤维素酶产量低等问题。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种在可溶性和非可溶性碳源诱导下高产纤维素酶的里氏木霉基因工程菌，其分类命名为丛梗孢目(Moniliales)木霉属(Penicillium)丝状真菌里氏木霉(Trichodermareesei)，菌株号SEU-7，已保藏于中国典型微生物保藏中心，地址为中国武汉市武汉大学，邮编为430072，保藏编号为CCTCC M 2016492，保藏日期为2016年9月18日。

其中，上述的里氏木霉基因工程菌SEU-7是在里氏木霉Rut-C30中过表达bgl1-his基因得到，所述的bgl1-his基因序列如SEQ ID No.：1所示。

其中，上述的里氏木霉基因工程菌SEU-7的的构建方法包括如下步骤：

(1)提取里氏木霉Rut-C30的RNA并进行反转录。

(2)以里氏木霉Rut-C30的cDNA为模版设计bgl1-linker-his基因扩增引物，进行PCR扩增。

(3)将步骤(2)中PCR扩增后所得产物采用同源重组的方法插入质粒的XbaI酶切位点中，得到重组质粒pBGL-his，之后经过基因测序验证该基因正确整合。

(4)将步骤(3)中得到的重组质粒pBGL-his导入里氏木霉Rut-C30的孢子中，筛选得到5株稳定遗传的高产纤维素酶的转化子，分别命名为SEU-2、SEU-5、SEU-6、SEU-7和SEU-8。

(5)对获得的稳定遗传的转化子进行3轮稳定的传代培养以使得pBGL-his在转化子中稳定地过表达，之后对转化子进行纤维素酶活和蛋白含量的检测。

(6)基因工程菌和出发菌株在PDA固体培养基中于28度培养7天后，取孢子接种于SDB培养基活化30h，接种到含有不同不同诱导物的TMM培养基中培养7天，测定纤维素酶活和蛋白含量。其中SEU-7无论是在纤维素、乳糖还是葡萄糖诱导下产生的纤维素酶最高。

步骤(1)中，提取和反转录的过程可以按照Omega Fungal RNA kit说明书及Takara反转录试剂盒进行。

所述的linker的序列为catcatcatcatccgggcggcagcgtgaaaaaacgc。

步骤(2)中，所述的bgl1-linker-his基因扩增引物中，

上游引物的核苷酸序列为：acccaatagtcaatctagaatgcgttaccgaacagcagc；

下游引物的核苷酸序列为:tcggcatctacttctagattagtggtggtggtggtggtggcgttttttcacgctgccgcccggatgatgatgatgcgctaccgacagagtgctcg。

步骤(3)中，所述的质粒为pDHt/sk。

步骤(4)中，筛选得到稳定遗传的转化子的方法为：将重组质粒pBGL-his导入里氏木霉Rut-C30的孢子后，在筛选培养基中培养5天得到转化子，再将转化子进行3轮稳定的传代培养以使得bgl1在转化子中稳定地过表达，即得稳定遗传的转化子。

其中，所述筛选培养基的配方为：含有相应筛选标记的PDA培养基。

上述里氏木霉基因工程菌SEU-7在碳源诱导下生产纤维素酶的应用也在本发明的保护范围之内。

其中，所述的碳源包括不可溶性碳源和可溶性碳源；其中，所述的不可溶性碳源为纤维素，所述的可溶性碳源为乳糖、葡萄糖、纤维二糖或甘油。

其中，所述的纤维素酶包括β-葡萄糖苷酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、滤纸酶和半纤维素酶以及其他相关的降解纤维素、木质素和半纤维素的酶。

其中，所述的应用方法为，将所述的里氏木霉基因工程菌SEU-7接种至以碳源为诱导物的培养基中，会产生纤维素水解酶。

其中，具体方法为：将所述的里氏木霉基因工程菌SEU-7在PDA固体培养基中于25～30℃下培养5～10天后，取孢子接种于SDB培养基活化24～50小时后，再接种到以碳源为诱导物的TMM培养基中培养5～10天。

其中，

PDA固体培养基的配方为：将200g去皮马铃薯切成小块后加水1L，煮沸30分钟后去滤液，加20g葡萄糖和15g琼脂后融化分装，并于115℃灭菌15分钟。

SDB培养基的配方为：将4g葡萄糖、1g酵母膏和1g蛋白胨溶解于100mL水。

TMM培养基配方为：(NH₄)SO₄>2PO₄>4>2>4·7H₂O0.005g、MnSO₄>4·7H₂O>2>

有益效果：

与现有技术相比，本发明具有如下优势：

1、本发明利用同源重组技术构建了高产纤维素酶的里氏木霉基因工程菌SEU-7，该里氏木霉基因工程菌SEU-7在可溶性碳源和非可溶性碳源的诱导下，均表现出极高的产纤维素酶的能力。具体来说，在纤维素诱导下，SEU-7所产胞外β-葡萄糖苷酶酶活、CMCase、pNPCase和Fpase分别是里氏木霉菌Rut-C30的37.9倍、8.7倍、2.6倍和1.1倍；在乳糖诱导下，SEU-7所产胞外β-葡萄糖苷酶、pNPCase、CMCase和FPase分别是里氏木霉菌Rut-C30的153倍、14倍、9倍和1.7倍。

2、本发明的里氏木霉基因工程菌SEU-7表现出了比Rut-C30更好的糖化能力，糖化能力提高了63％。

3、本发明的里氏木霉基因工程菌SEU-7能产生纤维素酶而Rut-C30不能。

附图说明

图1为实施例1中bgl1-his重组质粒图谱。

图2为实施例1中转化子筛选结果。

图3为实施例1中SEU-7和Rut-C30培养7天后的上清液纤维素酶活对比图；其中横坐标代表不同的转化子，BGL代表β-葡萄糖苷酶，CBH代表外切葡聚糖酶，CMC代表内切葡聚糖酶，FPA代表滤纸酶活。

图4A为分别以乳糖和纤维素为诱导物SEU-7和Rut-C30培养7天后的上清液β-葡萄糖苷酶活对比图。

图4B为分别以乳糖和纤维素为诱导物SEU-7和Rut-C30培养7天后的上清液外切葡聚糖酶活对比图；

图4C为分别以乳糖和纤维素为诱导物SEU-7和Rut-C30培养7天后的上清液内切葡聚糖酶活对比图。

图4D为分别以乳糖和纤维素为诱导物SEU-7和Rut-C30培养7天后的上清液滤纸酶活对比图。

图4E为分别以乳糖和纤维素为诱导物SEU-7和Rut-C30培养7天后的上清液蛋白含量对比图。

图5为以葡萄糖为诱导物SEU-7的纤维素酶活情况。

图6为SEU-7和Rut-C30在不同培养条件下SEU-7和Rut-C30间变化的还原糖的对比图。

具体实施方式

实施例1 bgl1-his重组质粒的构建

(1)bgl1-his基因扩增引物参照发明内容(6)中的bgl1-linker-his引物。以里氏木霉Rut-C30的cDNA为模版用该引物扩增bgl1-his基因。扩增条件为预变性：95℃，15s；变性：95℃，15s；退火：66℃，30s；延伸：72℃，3min；彻底延伸：72℃，5min；

(2)经纯化的目的基因PCR产物采用单酶切同源重组插入到质粒pDht/sk的XbaI酶切位点上获得bgl1-his重组质粒，见图1；

(3)采用农杆菌介导的办法将该表达盒转入到里氏木霉孢子中，具体方法如下：

根癌农杆菌转化：

a.-70℃保持的根癌农杆菌置于冰上孵育10min；

b.往根癌农杆菌中加入0.5-1μg的质粒，冰浴30min；

c.液氮5min，37℃5min，冰浴2min；

d.加入1mL的液体LB，200rpm,28℃培养3h后，离心收集菌体，再洗一次；

e.用100μL液体LB重悬菌体并均匀涂布在LB抗性平板上(含50μg/mL的羧苄青霉素和50μg/mL的卡那霉素)，28℃培养两天。

根癌农杆菌介导的里氏木霉的转化

a.里氏木霉孢子要求新鲜制备，0.02％的Tween-80水从平板上洗下孢子，浓度约1x10⁶/mL。

b.农杆菌:首先将农杆菌AGL1单菌落(含双元载体)接种于3mL含有50μg/mL的羧苄青霉素和50μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基中，200rpm，28℃过夜培养至OD₆₆₀为0.6。离心收集菌体并用适量的IM液体培养基(含200μM的乙酰丁香酮)重悬菌体。将菌液浓度调到OD₆₆₀为0.15，然后200rpm，28℃培养至OD₆₆₀为0.5-0.8。将100μL农杆菌液与100μL的里氏木霉的孢子混匀后，均匀涂在固体IM(含200μM的乙酰丁香酮)平板上，26℃避光培养48h。将共培养两天后的混合物用0.02％的Tween-80水刮下后，均匀涂在含有600μM头孢噻肟(cefotaxime，以杀死农杆菌细胞)、0.1％Triton>

(4)对(3)步骤中获得的转化子进行3轮的稳定遗传，于SDB中活化30h后，接种于TMM+2％纤维素或2％乳糖培养基中进行酶活的检测。如图3所示，五株转化子菌表现出了高于出发菌株Rut-C30的纤维素酶酶活。其中SEU-7的纤维素酶活最高，BGL达到42IU/mL，CBH达到0.9IU/mL，CMC为10IU/mL，FPA为4.8IU/mL。

实施例2

将里氏木霉各菌株在纤维素培养基摇瓶培养7天的上清液经4℃，8000rpm，15min离心收集上清用于纤维素酶活的测定。纤维素酶活测定方法如下：

(1)β-葡萄糖苷酶(pNPGase)酶活测定：将适当稀释的酶液上清20μL加入90μl4mM的(50mM NaCl，pH 5.0)，50℃保温10min，吸取100μL加入等体积的2％NaCO₃，置于酶标板读取OD₄₀₅(Biochem-Tokyo,1999,125(4):728-736)。所有酶活都以一个酶活单位IU每毫升发酵液表示。一个酶活单位(IU)定义为：以p-硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷(pNPG)为底物时在1分钟内释放1μmol产物对硝基苯酚(PNP)所需的酶量。

(2)外切葡聚糖酶(pNPCase)酶活测定：90μL 4mM的pNPC溶液(0.05M NaAc，pH5.0，1mg/mL 1,5-δ-葡萄糖酸内酯)加入20μl适当稀释倍数的酶液，50℃保温30min，吸取100μL加入等体积的2％NaCO3，置于酶标板中读取OD405(Analytical biochemistry1984,138(2):481-487)。所有酶活都以一个酶活单位IU每毫升发酵液表示。一个酶活单位(IU)定义为：以对硝基苯基-beta-D-纤维二糖苷为底物时，在每分钟内释放1μmol产物对硝基苯酚(PNP)所需的酶量。

(3)内切葡聚糖酶(CMCase)酶活测定：取一定稀释倍数的酶液30μL，加入30μL CMC(PH4.8，50mM NaAc，2％)，50℃保温30min,然后加入120μL的DNS，95℃保温5min,之后取出36μL加到装有160μL超纯水的酶标板里读取OD₅₄₀的数值。一个酶活单位(IU)定义为：以羧甲基纤维素为底物时在每分钟内释放1μmol还原糖所需的酶量(Analytical>

(4)滤纸酶活(FPase)测定：取20μL一定稀释倍数的发酵液上清，加入40μL醋酸钠缓冲液(50mM，pH 4.8)，混匀后加入到放有小滤纸片的PCR板的孔里。50℃反应1h。随后加入120μL的DNS，95℃保温5min。然后后取出36μL加到装有160μL超纯水的酶标板(Greinerbio-one,Frickenhausen,Germany)里，在酶标仪Varioskan Flash microplate reader(Thermo electron,Finland)读取OD₄₉₂的数值(Method>

实施例3

不同条件下获得的培养上清液用于水解纤维素，检测里氏木霉SEU-7所产纤维素酶的纤维素水解效率及底物特异性，具体方法如下：称取乙二胺处理的玉米秸秆(EDA-PCS)(Biotechnology for biofuels,2015,8:1-15)75mg/mL于离心管中，向各管分别加入100mM乙酸钠缓冲液(pH 5.0)、0.2mg/ml的叠氮化钠以及150ug/mL的粗酶液。于50℃，200rpm条件下反应72h。每24h测定一次还原糖含量。结果如图5所示，纤维素水解72h后产生11mg/mL的葡萄糖，是Rut-C30产生的葡萄糖的2.6倍。

SEQUENCE LISTING

<110> 东南大学

<120> 乳糖诱导下高产纤维素酶里氏木霉基因工程菌的构建及其应用

<130> SG20160809

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2232

<212> DNA

<213> bgl1基因序列

<400> 1

atgcgttacc gaacagcagc tgcgctggca cttgccactg ggccctttgc tagggcagac 60

agtcactcaa catcgggggc ctcggctgag gcagttgtac ctcctgcagg gactccatgg 120

ggaaccgcgt acgacaaggc gaaggccgca ttggcaaagc tcaatctcca agataaggtc 180

ggcatcgtga gcggtgtcgg ctggaacggc ggtccttgcg ttggaaacac atctccggcc 240

tccaagatca gctatccatc gctatgcctt caagacggac ccctcggtgt tcgatactcg 300

acaggcagca cagcctttac gccgggcgtt caagcggcct cgacgtggga tgtcaatttg 360

atccgcgaac gtggacagtt catcggtgag gaggtgaagg cctcggggat tcatgtcata 420

cttggtcctg tggctgggcc gctgggaaag actccgcagg gcggtcgcaa ctgggagggc 480

ttcggtgtcg atccatatct cacgggcatt gccatgggtc aaaccatcaa cggcatccag 540

tcggtaggcg tgcaggcgac agcgaagcac tatatcctca acgagcagga gctcaatcga 600

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gccgacgcgg ttcaggccaa tgtcgcttct gtcatgtgct cgtacaacaa ggtcaatacc 720

acctgggcct gcgaggatca gtacacgctg cagactgtgc tgaaagacca gctggggttc 780

ccaggctatg tcatgacgga ctggaacgca cagcacacga ctgtccaaag cgcgaattct 840

gggcttgaca tgtcaatgcc tggcacagac ttcaacggta acaatcggct ctggggtcca 900

gctctcacca atgcggtaaa tagcaatcag gtccccacga gcagagtcga cgatatggtg 960

actcgtatcc tcgccgcatg gtacttgaca ggccaggacc aggcaggcta tccgtcgttc 1020

aacatcagca gaaatgttca aggaaaccac aagaccaatg tcagggcaat tgccagggac 1080

ggcatcgttc tgctcaagaa tgacgccaac atcctgccgc tcaagaagcc cgctagcatt 1140

gccgtcgttg gatctgccgc aatcattggt aaccacgcca gaaactcgcc ctcgtgcaac 1200

gacaaaggct gcgacgacgg ggccttgggc atgggttggg gttccggcgc cgtcaactat 1260

ccgtacttcg tcgcgcccta cgatgccatc aataccagag cgtcttcgca gggcacccag 1320

gttaccttga gcaacaccga caacacgtcc tcaggcgcat ctgcagcaag aggaaaggac 1380

gtcgccatcg tcttcatcac cgccgactcg ggtgaaggct acatcaccgt ggagggcaac 1440

gcgggcgatc gcaacaacct ggatccgtgg cacaacggca atgccctggt ccaggcggtg 1500

gccggtgcca acagcaacgt cattgttgtt gtccactccg ttggcgccat cattctggag 1560

cagattcttg ctcttccgca ggtcaaggcc gttgtctggg cgggtcttcc ttctcaggag 1620

agcggcaatg cgctcgtcga cgtgctgtgg ggagatgtca gcccttctgg caagctggtg 1680

tacaccattg cgaagagccc caatgactat aacactcgca tcgtttccgg cggcagtgac 1740

agcttcagcg agggactgtt catcgactat aagcacttcg acgacgccaa tatcacgccg 1800

cggtacgagt tcggctatgg actgtcttac accaagttca actactcacg cctctccgtc 1860

ttgtcgaccg ccaagtctgg tcctgcgact ggggccgttg tgccgggagg cccgagtgat 1920

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cagctgcgag gctttgccaa gctgaacctc acgcctggtc agagcggaac agcaacgttc 2100

aacatccgac gacgagatct cagctactgg gacacggctt cgcagaaatg ggtggtgccg 2160

tcggggtcgt ttggcatcag cgtgggagcg agcagccggg atatcaggct gacgagcact 2220

ctgtcggtag cg 2232