一组用于同时显示活细胞中细胞核构造与细胞整体形态的荧光探针

摘要

本发明公开了一组用于同时显示活细胞中细胞核构造与细胞整体形态的荧光探针，该组荧光探针包括化学结构如(Ⅰ)所示的广义RNA荧光探针，化学结构如(II)所示的细胞核荧光探针和化学结构如(III)所示的细胞膜荧光探针。本发明还公开了该组荧光探针在标记或显示细胞整体形态、特别是在标记或显示包括核仁分布在内的细胞核构造方面的应用。实验证实：本发明的探针具有适用范围广，膜通透性好，细胞毒性低，能同时成像细胞核、细胞核仁、细胞质、细胞质膜的特点，应用前景广阔。

说明书

技术领域

本发明涉及一组辨别活细胞形态的荧光探针，尤其涉及一组用于同时显示活细胞中细胞核构造与细胞整体形态的荧光探针。

背景技术

细胞核构造，染色体和其他的细胞核组件的空间分布，为编程和调节在细胞核内进行的各种功能过程提供了基本框架。大量研究发现，同正常的细胞相比，癌细胞的细胞核构造完全不同。而且在肿瘤细胞的各种形态变化中，细胞核构造的变化最具医学诊断价值。例如，Beale,L.S在病患脱落的咽癌细胞中发现并观测到了细胞核尺寸和形状的变化。

最近，癌症细胞中核仁的变化越来越引起了医学界的高度重视。癌症细胞中不仅是细胞核的尺寸和形状发生变化，其核仁的大小、形状和数量也发生了特征性的变化。可以确定，核仁增大是癌细胞的普遍特征。具体的，巨大核仁已成为大细胞肺癌与Hodgkin病的一个重要诊断依据；前列腺上皮内瘤细胞中也有大尺寸核仁现象；相反的也有：超小尺寸核仁则是宫颈上皮内瘤病变和小细胞退行发育肺癌的一个诊断依据。但目前在活性组织切片中观测细胞核构造的变化仍然是癌症诊断的“金标准”。表1中汇总了与癌症关联的细胞核构造变化及细胞核仁的变化特征。

表1与癌症相关联的细胞核构造改变及核仁变化

基于鉴别细胞核的尺寸和形状发生变化及核仁的大小、形状和数量的重要性，开发能够显示细胞核构造的荧光探针具有巨大的生物学与医学价值。

同细胞核构造一样，细胞整体形态也具有重要的生物学意义。所有的生物都是由细胞组成的，不同生物体的细胞具有不同的形态，且差异巨大。鸟类蛋的最大直径近10厘米(鸵鸟蛋)，人眼可见；原始细菌的直径只有0.1微米，要用高倍显微镜才能看到；大多数细胞的直径是10-100微米，用低倍显微镜就能看到。同一生物体的相同组织中的细胞也大小不一。处在不同发育阶段的同一种细胞形态也会发生改变。如发生凋亡的细胞体积会变小、变形、细胞凋亡晚期可见凋亡小体。细胞坏死的最终结果虽然与凋亡极为相似，但在过程中的形态表现却有很大差别，与凋亡过程中细胞体积收缩相反，表现为细胞胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢。而且细胞整体形态与疾病关系密切。例如，镰状贫血病变细胞形态变化巨大。因此开发能够显示活细胞整体形态的探针也具有重要生物学与医学价值。

综上所述，如能在观测活性细胞时，同时给出细胞核构造与细胞整体形态的信息，则对生物学与医学研究有非常重要的意义。苏木素/伊红染色剂既能成像显示细胞整体形态的细胞浆，又能显示细胞核构造，成为目前广泛应用的病理(癌症)诊断试剂，并在宫颈癌的早期诊断及预防中获得了巨大成功，但是其存在难以鉴别的良性疾病与癌症、增生性病变与癌症、异型增生与癌症等诊断学问题。基于此，开发用于同时显示包括核仁在内的活细胞中细胞核精细构造与细胞整体形态的一组荧光探针意义重大。

经检索，能够满足同时显示活性细胞中细胞核构造(包括成像核仁)与细胞整体形态的荧光探针尚无任何报道。这类荧光试剂的缺乏已经限制了生物学研究、疾病诊断、病理研究和药物开发，亟待解决。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一组用于同时显示活细胞中细胞核构造与细胞整体形态的荧光探针。

本发明所述的一组用于同时显示活细胞中细胞核构造与细胞整体形态的荧光探针，其特征在于：所述荧光探针由式(I)所示的广义RNA荧光探针、(II)所示的细胞核荧光探针和式(III)所示的细胞膜荧光探针组成，其中式(I)化合物名为(E)-1-(2-羟乙基)-4-(2-(1-甲基-1H-吡咯-2-)乙烯基)吡啶碘盐，式(II)化合物名为2-(4-乙氧苯基)-6-(4-甲基-1-哌嗪基)-1H,3H-2,5-二苯并咪唑-三盐酸盐(Hoechst33342)，式(III)化合物名为1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐(DiI)，式(I)化合物与式(II)化合物与式(III)化合物的摩尔配比为4-5:1:1；

本发明所述用于同时显示活细胞中细胞核构造与细胞整体形态的荧光探针在利用三种荧光波长同时标记或显示活细胞中细胞核结构、核仁结构、细胞浆和细胞膜形态中的应用。

其中：所述活细胞为永生化细胞或正常细胞。所述永生化细胞优选SiHa细胞。

本发明所述的一组探针用不同的荧光波长显示细胞核、核仁、细胞浆、细胞膜，而且用同一荧光波长显示核仁与细胞浆，便于利用荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜进行三色成像。

鉴于细胞核的核仁是核糖体RNA转录、加工、装配的场所，同时细胞浆中有较多的信使RNA，尤其是细胞浆和细胞核仁并不相邻，二者之间有明确且明显的空间距离，因此本发明采用广义RNA荧光探针(E)-1-(2-羟乙基)-4-(2-(1-甲基-1H-吡咯-2-)乙烯基)吡啶碘盐成像核仁和细胞浆。

鉴于DNA是细胞核中的主要成分，并与核仁有空间区分，本发明采用与(E)-1-(2-羟乙基)-4-(2-(1-甲基-1H-吡咯-2-)乙烯基)吡啶碘盐(Ⅰ)有不同荧光波长的DNA荧光探针2-(4-乙氧苯基)-6-(4-甲基-1-哌嗪基)-1H,3H-2,5-二苯并咪唑-三盐酸盐(Hoechst33342)成像细胞核，并与(E)-1-(2-羟乙基)-4-(2-(1-甲基-1H-吡咯-2-)乙烯基)吡啶碘盐共同显示包括核仁尺寸与数量的细胞核构造。

基于上述标记或显示，本发明再进一步采用与上述两种化合物荧光波长均不相同的1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐(DiI)成像细胞膜。并与(E)-1-(2-羟乙基)-4-(2-(1-甲基-1H-吡咯-2-)乙烯基)吡啶碘盐成像的细胞浆共同显示细胞的整体形态。

本发明使用的(E)-1-(2-羟乙基)-4-(2-(1-甲基-1H-吡咯-2-)乙烯基)吡啶碘盐、2-(4-乙氧苯基)-6-(4-甲基-1-哌嗪基)-1H,3H-2,5-二苯并咪唑-三盐酸盐、1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐在染色活细胞时明确靶向不同的靶标，发出不同波长的荧光，且互不干扰、互不串色。特别是三种探针的激光激发波长各不相同，而且收集成像的荧光波段互不重叠，为同时显示活细胞中细胞核构造与细胞整体形态奠定了基础。

实验结果证实，应用本发明所述的一组荧光探针标记SiHa细胞后的荧光图像显示，该细胞的细胞核、核仁、胞浆、细胞膜均被明确标记了。其中，(E)-1-(2-羟乙基)-4-(2-(1-甲基-1H-吡咯-2-)乙烯基)吡啶碘盐用绿色荧光明确的成像了核仁和细胞浆，并给出了核仁的尺寸、形状、数量和分布；2-(4-乙氧苯基)-6-(4-甲基-1-哌嗪基)-1H,3H-2,5-二苯并咪唑-三盐酸盐用蓝色荧光明确成像了细胞核中DNA，并与核仁的成像结果一同详细解析了细胞核的构造；1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐用红色荧光成像了细胞膜，并同细胞浆的成像结果一同给出了细胞的整体形态。见图1至图5。

本发明提供一组荧光探针是三种荧光探针的有机组合，目前尚无相同类型的探针组合报道。本发明具有的重大意义是：革新性地应用了可成像核仁的广义RNA荧光探针，有希望建立基于核仁、细胞核、细胞整体形态的癌症病理诊断新技术，以解决常规苏木素/伊红染色难以鉴别的良性疾病与癌症、增生性病变与癌症、异型增生与癌症的诊断学问题。其经转化可应用于临床细胞学和组织病理学诊断。并且，本发明所述的一组探针具有膜通透性好、显色强、复染兼容性好、光稳定性较强的特点，预示其在同时显示活细胞中细胞核构造与细胞整体形态方面具有广泛的应用，有望开发为与癌症相关的生理和病理学研究用简捷、直观的生物检测与医疗诊断试剂，应用前景巨大。

附图说明

图1：SiHa细胞DIC照片。

获得方法：首先在普适性显微镜下完成对焦，然后使用405nm的激光作为光源，收集透射成像PMT的信号进行成像。调整透射成像PMT的电压和感光灵敏度，同时调整DIC棱镜取向，使细胞图片明亮合适、有凹凸立体感，然后获取图片。

图2：SiHa细胞核荧光照片。

获得方法：用405nm激光激发细胞中2-(4-乙氧苯基)-6-(4-甲基-1-哌嗪基)-1H,3H-2,5-二苯并咪唑-三盐酸盐的荧光，收集430-460nm波段的荧光成像。

图3：SiHa细胞浆和核仁荧光照片。

获得方法：用473nm激光激发细胞中(E)-1-(2-羟乙基)-4-(2-(1-甲基-1H-吡咯-2-)乙烯基)吡啶碘盐的荧光，收集500-560nm波段的荧光成像。

图4：SiHa细胞膜荧光照片。

获得方法：用543nm激光激发细胞中1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基哚羰花青高氯酸盐的荧光，收集630-690nm波段的荧光成像。

图5：为图2、图3、图4的共定位合成图。

具体实施方式

实施例1：探针准备。

2-(4-乙氧苯基)-6-(4-甲基-1-哌嗪基)-1H,3H-2,5-二苯并咪唑-三盐酸盐、1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐从分子探针公司购买，商品货号分别为Hoechst33342和DiI。

(E)-1-(2-羟乙基)-4-(2-(1-甲基-1H-吡咯-2-)乙烯基)吡啶碘盐根据本专利发明人先前公开的专利“一种用于活细胞中RNA和核仁成像的吡咯吡啶盐类荧光探针(申请号：201310215970.9)”描述的实验工艺合成。

实施例2：SiHa细胞培养。

将SiHa细胞贴壁培养于内含10％胎牛血清培养液中，在37℃，5％CO₂的饱和湿度孵箱中培养，每2～3d换液传代1次。待细胞生长到对数期，接片培养：①将盖玻片于无水乙醇中浸泡30min，酒精灯烘干后放入一次性35mm培养皿中，备用；②将100mL细胞瓶中长满的细胞用PBS洗三遍，用1mL0.25％胰酶消化3-5分钟，小心地倒出胰酶，加入新鲜培养液吹打均匀并细胞计数，以培养液的添加量控制细胞密度，使细胞终浓度为1×10⁵，然后接种至内上述含盖玻片的培养皿中，放入5％CO2培养箱中培养，使细胞爬片生长。待SiHa细胞爬片生长并长满盖玻片后，用于实验。

实施例3：(E)-1-(2-羟乙基)-4-(2-(1-甲基-1H-吡咯-2-)乙烯基)吡啶碘盐、2-(4-乙氧苯基)-6-(4-甲基-1-哌嗪基)-1H,3H-2,5-二苯并咪唑-三盐酸盐、1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基哚羰花青高氯酸盐的细胞复染方法：

首先配制5mM的(E)-1-(2-羟乙基)-4-(2-(1-甲基-1H-吡咯-2-)乙烯基)吡啶碘盐DMSO溶液、1mM的2-(4-乙氧苯基)-6-(4-甲基-1-哌嗪基)-1H,3H-2,5-二苯并咪唑-三盐酸盐DMSO溶液、1mM的1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基哚羰花青高氯酸盐DMSO溶液作为母液。

取4μL的(E)-1-(2-羟乙基)-4-(2-(1-甲基-1H-吡咯-2-)乙烯基)吡啶碘盐母液、5μL的2-(4-乙氧苯基)-6-(4-甲基-1-哌嗪基)-1H,3H-2,5-二苯并咪唑-三盐酸盐母液以及5μL的1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基哚羰花青高氯酸盐母液，加入到1mL的PBS缓冲液中，并混合均匀，作为染色液。

染色方法：待SiHa细胞爬片长满盖玻片后，移除其培养皿中的培养基，加入上述配制好的染色液染色细胞30分钟；移除染色液，用干净的PBS冲洗含有SiHa细胞的盖玻片3次，即可在荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜下进行细胞成像分析。

实施例4：细胞成像。

首先在普适性显微镜下完成对焦、初检，然后使用共焦显微镜的405nm激光作为光源，收集透射成像PMT的信号进行成像。调整透射成像PMT的电压和感光灵敏度，同时调整DIC棱镜取向，使细胞图片明亮合适、有凹凸立体感，然后获取DIC图片。(见图1)

再用405nm激光激发细胞中2-(4-乙氧苯基)-6-(4-甲基-1-哌嗪基)-1H,3H-2,5-二苯并咪唑-三盐酸盐的荧光，收集430-460nm波段的荧光成像。(见图2)

再用473nm激光激发细胞中(E)-1-(2-羟乙基)-4-(2-(1-甲基-1H-吡咯-2-)乙烯基)吡啶碘盐的荧光，收集500-560nm波段的荧光成像。(见图3)

再用543nm激光激发细胞中1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基哚羰花青高氯酸盐的荧光，收集630-690nm波段的荧光成像。(见图4)

整合共定位上述图像形成合成图。(见图5) 。