多色受激辐射耗尽超分辨成像装置、方法及光学显微镜

摘要

一种多色受激辐射耗尽超分辨成像装置，包括多个激励光源、损耗光源、光电探测器、控制单元和光学系统；其中，光学系统包括多个快门，分别位于各激励光源输出的激发光光路上；控制单元控制所述多个快门轮流开启，以使每个激励光源输出的激发光依次照射到成像区域。本发明在装置上可以实现多路激发光进行样品激发而使用同一路STED损耗光进行荧光淬灭，这样既可实现STED同时多色超分辨成像而又避免通道间发生图像偏离。另外，本发明在成像装置中使用快门分别开关不同通道的激发和探测，实现线扫描模式成像，成功解决多通道之间的交叉干扰问题。

说明书

技术领域

本发明涉及显微成像领域，进一步涉及一种多色超分辨成像装置和多色受激辐射耗尽超分辨成像方法，还进一步涉及一种基于扫描成像的光学显微镜。

背景技术

由于光学显微镜可以对生物样品在生理条件下进行实时动态的成像观察，已成为生物学家不可或缺的研究工具，而光学显微镜的发展也伴随着生命科学的进步。然而由于光学衍射极限的存在，使得光学显微镜的空间分辨率被限制在半个波长左右，这样的分辨率严重阻碍了生物学家们在亚细胞尺度上进行更精细的研究。自从1994年Stefan W.Hell理论上提出突破衍射极限，经过二十来年的发展，受激辐射耗尽(Stimulated emissiondepletion-STED)显微镜、光活化定位显微镜(Photo-activationlocalizationmicroscopy-PALM)、随机光学重构显微镜(Stochastic opticalreconstruction microscopy-STORM)等多种超分辨技术得到广泛应用。并且，2014年诺贝尔化学奖授予Eric Betzig、Stefan W.Hell和William E.Moerner，以表彰他们在“发展超分辨荧光显微镜”方面的突出贡献。其中STED显微镜因其在时间分辨方面的优势，而在对动态过程的超分辨成像应用中具有较大的前景。

STED显微镜是一种基于共聚焦点扫描模式的超分辨成像技术，它需要在传统共聚焦显微镜的基础上额外添加一路STED损耗光，通过位相板调制STED光束波前从而在物镜焦平面上形成一个环状光斑，此环状光斑与激发光斑空间上完全对准，时间上稍有延后，从而将激发光衍射光斑周围的荧光分子转换为非辐射状态，有效降低荧光激发半径，实现超分辨效果。STED超分辨成像能够更加清晰直观地观察到一些亚细胞尺度的细胞结构和蛋白分布，但是在生物学研究中仅仅观察到精细结构和蛋白分布是不够的，观察不同蛋白或者蛋白与亚细胞结构之间等多组分之间的相互作用才能更好地理解细胞生理过程，因此发展多色超分辨显微镜具有重要应用价值。

从成像装置及光路设计上来说，目前研究人员主要通过以下两种方式来实现多色STED成像：(1)选择激发光谱和发射光谱可以截然分离的多种荧光分子进行标记，装置上使用相应的多束激发光和多束STED损耗光来实现多色STED超分辨成像；(2)选择激发光谱不同，发射光谱相近的多种荧光分子进行标记后成像。然而，无论使用哪种方式实现多色STED成像都会面临多个通道间交叉干扰(串色)问题，并且第一种方法还会存在多成像通道间横向偏离的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种多色受激辐射耗尽成像装置和方法，以解决以上所述的至少一项技术问题。

根据本发明的一方面，提供一种多色受激辐射耗尽超分辨成像装置，包括：多个激励光源，分别输出彼此激发光谱不同的激发光；损耗光源，输出受激辐射耗尽光；光学系统，用于向观察区域照射调整后的激发光和受激辐射损耗光；其中，所述光学系统包括多个快门，分别位于各激励光源输出的激发光光路上；光电探测器，与所述激励光源同数量，各光电探测器对应于激励光源分别探测观察区域受调整后的激发光谱不同的激发光和受激辐射损耗光激发共同作用产生的荧光信号；以及控制单元，控制所述多个快门轮流开启，以使每个激励光源输出的激发光依次照射到成像区域。

进一步的，所述激励光源为两个，分别为第一激励光源和第二激励光源，对应输出的激发光为第一激发光和第二激发光，所述快门包括第一快门和第二快门，分别位于第一激发光和第二激发光的光路上，所述控制单元控制第一快门和第二快门依次开启，使第一激发光和第二激发光依次照射到成像区域。

进一步的，所述光学系统的设置包括：使每一激发光经过各自激发光对应的快门、反射镜和二向色性滤光片后汇聚至显微物镜。

进一步的，所述光学系统的设置包括：使受激辐射耗尽光经过位相板、反射镜和二向色性滤光片后汇聚至所述显微物镜。

进一步的，所述光学系统的设置还包括：各激发光和所述受激辐射耗尽光在汇聚至所述显微镜物镜之前均经一反射镜。

进一步的，各所述荧光信号经二向色性滤光片的分离后，再经各自滤波片收集滤波片后进入各光电探测器。

进一步的，所述控制单元还用于控制各光电探测器，在各激励光源对应快门开启时，使激励光源对应的光电探测器工作。

进一步的，所述激励光源工作方式为对观察区域进行线扫描，所述控制器控制为：当一激发光线扫描过观察区域后，切换快门，控制另一激发光对观察区域继续进行线扫描。

进一步的，所述装置还包括位移控制器，所述观察区域包括样品台，所述位移控制器与样品台电性耦接，用于控制样品台平移，以使激励光源输出的激发光在样品上扫描出一条线。

根据本发明的另一方面，提供一种多色受激辐射耗尽超分辨成像方法，包括：

设置多个激励光源，分别输出彼此激发光谱不同的激发光；

设置损耗光源，输出受激辐射耗尽光；

设置光学系统，调整激发光和受激辐射损耗光后向观察区域照射；其中，包括设置多个快门，各快门分别位于各激励光源输出的激发光光路上，通过控制所述多个快门轮流开启，以使个激励光源输出的激发光依次照射到成像区域；

设置与所述激励光源同数量的光电探测器，各光电探测器对应于激励光源，分别探测观察区域受调整后的激发光谱不同的激发光和受激辐射损耗光激发共同作用产生的荧光信号。

进一步的，还包括对各光电探测器探测的荧光信号进行图像重构和处理。

进一步的，各所述激发光采用线扫描模式，通过快门控制多路激发光依次线激发，同时控制对应的光电探测器依次探测荧光信号。

根据本发明的又一方面，提供一种基于扫描成像的光学显微镜，包括：

多个激励光源，分别输出彼此激发光谱不同的激发光；

光学系统，用于向观察区域照射调整后的激发光；其中，所述光学系统包括多个快门，分别位于各激励光源输出的激发光光路上；以及

控制单元，以控制所述多个激励光源对观察区域交替进行线扫描，所述交替通过控制多个快门轮流开启来实现。

根据本发明的再一方面，提供一种多色受激辐射耗尽超分辨成像装置，包括：

多个激励光源，分别输出彼此激发光谱不同的激发光；

损耗光源，输出受激辐射耗尽光；

光学系统，用于向观察区域照射调整后的激发光和受激辐射损耗光；

光电探测器，与所述激励光源同数量，各光电探测器对应于激励光源分别探测观察区域受调整后的激发光谱不同的激发光和受激辐射损耗光激发共同作用产生的荧光信号；以及

控制单元，控制所述多个激励光源轮流工作，以使每个激励光源输出的激发光轮流照射到成像区域。

根据上述技术方案，本发明所提供的多色STED超分辨成像装置和方法具有以下有益效果：

1.在本发明的装置中，突破光学衍射极限，提高传统共聚焦显微镜成像分辨率，实现多色光学超分辨成像；

2.成像系统采用多路激发光，一路STED损耗光的方式，既能实现同时多色成像，又能避免不同通道间的图像横向偏离，光路相对简单；

3.成像系统采用线扫描模式，通过快门控制多路激发光依次交替线激发，同时用程序控制不同通道的光电探测器依次交替探测一条线的信号，成功解决通道间的交叉干扰问题；

4.线扫描模式能彻底消除其他通道激发光激发样品所产生的荧光信号串到自身通道；

5.相较于通过图像处理、光谱分离和基于点扫描和面扫描模式的时间门分离法等方法实现多色超分辨，本发明提出的线扫描模式不仅能够彻底解决多通道间交叉干扰问题实现多色同时成像，而且成像光路系统较简单，同时节约经济成本，更有利于STED显微镜的发展；

6.本发明装置中所提出的线扫描模式可用于所有的基于扫描成像模式的光学显微镜，以解决多通道间的交叉干扰。

附图说明

图1为本发明实施例提供的双色STED超分辨成像装置的结构示意图。

图2为图1所示装置两个通道超分辨成像能力的验证图(标尺：1μm)。

图3为图1所示装置应用线扫描模式对40nm混合荧光球(580/605nm&660/680nm)的双色共聚焦和STED超分辨成像图(标尺：1μm)。

图4为图1所示装置线扫描模式下细胞微管双通道超分辨共定位成像图(标尺：1μm)。

图5为图1所示装置线扫描模式下双通道交叉干扰问题的检验图(标尺：1μm)。

附图标记说明：

1激光器a；2激光器b；3激光器c；4快门a；5反射镜d；6二向色性滤光片a；7二向色性滤光片b；8二向色性滤光片c；9反射镜b；10显微镜物镜；11样品台；12快门b；13反射镜c；14二向色性滤光片d；15位相板；16反射镜a；17荧光滤波片a；18收集透镜a；19光电探测器a；20荧光滤波片b；21收集透镜b；22光电探测器b；23位移控制器；24光学信号采集器；25控制采集处理软件。

具体实施方式

根据本发明的基本构思，提供一种实现同时多色超分辨成像的装置。在本成像装置中，首先实现多色共聚焦显微成像，对每一个颜色通道加入STED损耗光从而实现超分辨光学成像。在成像装置中使用快门分别开关不同通道的激发和探测，实现线扫描模式成像，成功解决多通道之间的交叉干扰问题。

本发明实施例的提供一种实现同时多色超分辨成像的装置，包括多个激励光源，分别输出彼此激发光谱不同的激发光；损耗光源，输出受激辐射耗尽光；光学系统，用于向观察区域照射调整后的激发光和受激辐射损耗光；其中，所述光学系统包括多个快门，分别位于各激励光源输出的激发光光路上；光电探测器，与所述激励光源同数量，各光电探测器对应于激励光源分别探测观察区域受调整后的激发光谱不同的激发光和受激辐射损耗光激发共同作用产生的荧光信号；以及控制单元，控制所述多个快门轮流开启，以使个激励光源输出的激发光依次照射到成像区域。

该成像装置中，通过多个激励光源、损耗光源、光学系统、光电探测器和控制单元，实现多色共聚焦显微成像，并对每一激励光源所产生激发光所经过颜色通道加入STED损耗光实现超分辨光学成像。在实现超分辨成像时，本发明装置选择激发光谱不同，发射光谱相近的多种荧光分子进行标记，从而在装置上可以实现多路激发光进行样品激发而使用同一路STED损耗光进行荧光淬灭，这样既可实现STED同时多色超分辨成像而又避免通道间发生图像偏离。另外，本发明实施例在成像装置中使用快门分别开关不同通道的激发和探测，实现线扫描模式成像，成功解决多通道之间的交叉干扰问题。

本发明实施例还提供一种基于扫描成像的光学显微镜，包括：

多个激励光源，分别输出彼此激发光谱不同的激发光；

光学系统，用于向观察区域照射调整后的激发光；其中，所述光学系统包括多个快门，分别位于各激励光源输出的激发光光路上；以及

控制单元，以控制所述多个激励光源对观察区域交替进行线扫描，所述交替通过控制多个快门轮流开启来实现。

上述光学显微镜可以是现有技术中的各种光学显微镜，包括但不限于受激辐射耗尽显微镜、光活化定位显微镜、随机光学重构显微镜。只要其显微镜系统中包含多各激励光源，以能够设置多个快门的均可应用于此。

本发明实施例还提供一种多色受激辐射耗尽超分辨成像装置，包括：

多个激励光源，分别输出彼此激发光谱不同的激发光；

损耗光源，输出受激辐射耗尽光；

光学系统，用于向观察区域照射调整后的激发光和受激辐射损耗光；

光电探测器，与所述激励光源同数量，各光电探测器对应于激励光源分别探测观察区域受调整后的激发光谱不同的激发光和受激辐射损耗光激发共同作用产生的荧光信号；以及

控制单元，控制所述多个激励光源轮流工作，以使每个激励光源输出的激发光轮流照射到成像区域。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。下面以双色STED超分辨显微镜为例，介绍多色受激辐射耗尽超分辨成像装置和装置的工作流程，其中该装置包括：

通道1(也即上述的颜色通道)：激光器a(或者称为第一激励光源)输出的激发光(或称为第一激发光)经快门a(或称为第一快门)和反射镜d后，再依次经过二向色性滤光片a、二向色性滤光片b、二向色性滤光片c和反射镜b后汇聚至显微镜物镜照射到样品台，得到的待测样品的荧光信号经同一物镜汇聚后分别经过反射镜b、二向色性滤光片c、二向色性滤光片b、二向色性滤光片a，再经过荧光滤波片a和收集透镜a后进入光电探测器a；

通道2：激光器b(或称为第二激励光源)输出的激发光(或称为第二激发光)经快门b(或称为第二快门)和反射镜c后，再依次经过二向色性滤光片d、二向色性滤光片b、二向色性滤光片c和反射镜b后汇聚至显微镜物镜照射到样品台，得到的待测样品的荧光信号经同一物镜汇聚后分别经过反射镜b、二向色性滤光片c、二向色性滤光片b、二向色性滤光片d，再经过荧光滤波片b和收集透镜b后进入光电探测器b；

STED损耗光经激光器c(也称为损耗单元)输出后经过位相板和反射镜a后，再经过二向色性滤光片c和反射镜b后汇聚至显微镜物镜。其中光电探测器a和光电探测器b将收集到的光电信号输入至光学信号采集器。

控制采集处理软件(也称为控制单元)分别与光学信号采集器、位移控制器、快门a和快门b相连接，用于控制样品台移动、收集光学信号采集器的数据和控制快门的交替线激发，然后由控制采集处理软件进行信号收集重构和处理，进而获得双色超分辨荧光显微图像。

上述双色超分辨成像装置中，激光器a所输出的激光要经过反射镜d和反射镜b之后才汇聚至显微镜物镜，激光器b所输出的激光要经过反射镜c和反射镜b之后才汇聚至显微镜物镜，激光器c所输出的激光要经过反射镜a和反射镜b之后才汇聚至显微镜物镜，三种激光都要经过两个反射镜后才进入显微镜物镜以便于光路的对准。

上述双色超分辨成像装置中，所述待测样品的荧光信号在入射至两个通道的光电探测器之前都要经过一反射镜b，以便于光路对准；所述待测样品的荧光信号在入射至两个通道的光电探测器之前都要经过荧光滤波片，用于滤除激发光和损耗光；所述待测样品的荧光信号在入射至两个通道的光电探测器之前都要经过收集透镜，用于收集荧光。

上述双色超分辨成像装置中，激光器a和激光器b所输出的激光都要经过一个快门，此快门用于控制两路激发光的交替线激发；激光器c所输出的激光要经过一个位相板，用于形成一个环状的损耗光束。

上述实施例的多色STED超分辨成像装置中，具体实施光路为：

通道1的样品激发和荧光收集过程为：激光器a1输出的激发光经快门a4和反射镜d5后，再依次经过二向色性滤光片a6、二向色性滤光片b7、二向色性滤光片c8和反射镜b9后汇聚至显微镜物镜10照射到样品台11，用于激发通道1荧光标记的待测样品，得到的待测样品的荧光信号经同一物镜10汇聚后分别经过反射镜b9、二向色性滤光片c8、二向色性滤光片b7、二向色性滤光片a6，再经过荧光滤波片a17和收集透镜a18后进入光电探测器a19，光电探测器a19输出的光电信号输入至光学信号采集器24；

通道2的样品激发和荧光收集过程为：激光器b2输出的激发光经快门b12和反射镜c13后，再依次经过二向色性滤光片d14、二向色性滤光片b7、二向色性滤光片c8和反射镜b9后汇聚至显微镜物镜10照射到样品台11，用于激发通道2荧光标记的待测样品，得到的待测样品的荧光信号经同一物镜10汇聚后分别经过反射镜b9、二向色性滤光片c8、二向色性滤光片b7、二向色性滤光片d14，再经过荧光滤波片b20和收集透镜b21后进入光电探测器b22，光电探测器b22输出的光电信号输入至光学信号采集器24；

STED损耗光经激光器c3输出后经过位相板15产生内部强度为零的环状光束，经反射镜a16反射后，再经过二向色性滤光片c8和反射镜b9后汇聚至显微镜物镜10，用于将激发光激发的荧光斑周围的荧光分子退激发，最后只有中心处一小部分荧光分子发出荧光，从而获得超分辨光学成像。

本发明实施例装置在成像时采用线扫描模式：快门a4打开时，激光器a1输出激光激发待测样品，光电探测器a19进行信号采集，采集一条线的信号，该过程中位移控制器23控制样品台11平移，使样品台11相对于激光器a1输出的激光平移，从而在样品上扫描出一条线；此时快门b12关闭，光电探测器b22工作但是不采集信号；快门b12打开时，激光器b2输出激光激发待测样品，光电探测器b22进行信号采集，采集一条线的信号，该过程中位移控制器23控制样品台11平移，使样品台11相对于激光器b2输出的激光在样品上扫描同一条线；此时快门a4关闭，光电探测器a19工作但是不采集信号；

控制采集处理软件25分别与光学信号采集器24、位移控制器23、快门a4和快门b12相连接，分别用于控制样品台11移动、收集光学信号采集器24的数据和控制快门a4和b12的交替线激发，然后由控制采集处理软件25进行信号收集处理和重构，进而获得双色超分辨荧光显微图像。

应说明的是，上述双色STED仅仅用于示例，本领域技术人员可根据上述实现方式将其应用至三色或更多色的成像装置中。

图2为图1所示装置两个通道超分辨成像能力的验证图。使用上述装置对直径为40nm的荧光微球进行成像实验以验证其超分辨能力，如附图2，其中通道1获得了80nm的横向分辨率，通道2获得了40nm的横向空间分辨，显示两个通道都获得了较好的横向空间分辨率，远远超过普通共聚焦显微镜的分辨率。

图3为图1所示装置应用线扫描模式对40nm混合荧光球(580/605nm和660/680nm)的双色共聚焦和STED超分辨成像图。为了检验本发明装置提出的线扫描模式对解决通道间交叉干扰问题的能力，把两种标记的荧光微球混合后再进行同时双色超分辨成像，如附图3所示，本发明装置在获得双通道超分辨成像的前提下，成功的将两种混合荧光微球区分开。

图4为图1所示装置线扫描模式下细胞微管双通道超分辨共定位成像图。如附图4所示，细胞微管经第一抗体孵育后，同时用连接通道1染料(ATTO 594)的第二抗体和连接通道2染料(ATTO 647N)的第二抗体进行标记，然后进行双色共定位成像。STED超分辨成像结果显示两个通道具有较好的共定位效果，不存在通道间的横向漂移。

图5为线扫描模式下双通道交叉干扰问题的检验图。如附图5，通道1是对最大激发波长为580nm，最大发射波长为605nm的40nm荧光球进行共聚焦和STED超分辨成像，针对此样品用通道2的激发光进行激发和通道2的探测器进行信号探测，没有探测到荧光信号，以此证明线扫描模式下通道1的荧光信号不会串到通道2中；通道2是对最大激发波长为660nm，最大发射波长为680nm的40nm荧光球进行共聚焦和STED超分辨成像，针对此样品用通道1的激发光进行激发和通道1的探测器进行信号探测，没有探测到荧光信号，以此证明线扫描模式下通道2的荧光信号不会串到通道1中，所以使用交叉激发探测的方法验证了两个通道间的交叉干扰问题被成功解决。

本发明实施例通过多通道交替线扫描的方式实现门控多色STED成像，不仅解决了点扫描模式装置复杂控制困难的问题，也解决了面扫描模式下不同通道间图像横向漂移的问题。并且本发明提出的线扫描模式可应用于所有的基于扫描成像模式的光学显微镜，以解决多通道间的交叉干扰。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而己，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。