法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2020-02-21
授权
授权
2017-08-18
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N15/11 申请日:20170329
实质审查的生效
2017-07-25
公开
公开
技术领域
本发明涉及分子生物学领域,更特别地,涉及一种HuR蛋白可识别的RNA片段及其在检测细胞内HuR转录后调控活性中的应用。
背景技术
人抗原R(human antigen R,HuR)属于RNA结合蛋白中胚胎致死异常视觉(embryonic lethal abnormalvision,ELAV)家族,ELAV家族包括4个成员:HuB、HuC、HuD及HuR,前3个成员主要在神经组织和生殖器官中表达,并与神经发育有关。近年来研究表明,HuR在靶基因转录后调控中发挥稳定mRNA和促进翻译的作用。多项实验证实:HuR结合的靶因子多是癌基因、抑癌基因及肿瘤发生的调控因子,因而HuR与多种肿瘤的发生、发展及预后密切相关。HuR与人乳腺癌、结直肠癌、宫颈癌、卵巢癌和胃癌的发生、侵袭及转移有关,可能是影响肿瘤发生、发展及预后的重要因素。
HuR是一种mRNA结合蛋白,其活性形式能够与mRNA的3’-UTR结合,并通过该方式来调控mRNA的稳定性和翻译效率。因此,针对HuR的研究需要检测HuR的活性形式。
然而,目前检测内源性HuR仍然依靠的是Western Blot技术,虽然灵敏度高,但检测到的只是HuR蛋白含量的差异,并不能直接体现其激活水平的改变。
因此,需要设计一种新的用于检测细胞内HuR转录后调控活性的方法。
发明内容
发明人通过研究发现,在HuR蛋白上有3个RNA识别模序(RRMs),可以与AREs特定位点结合。RRM1和RRM2与富含U/A拷贝序列结合。RRM3与poly(A)尾结合,帮助维持RNA蛋白复合物的稳定。通过分析,发明人发现,将SEQ ID NO:1所示的序列编码的RNA序列接在mRNA3’端时,HuR蛋白可有效结合该mRNA的3’区,激活该mRNA翻译并提高mRNA的稳定性。
基于以上研究,本发明提供了一种HuR蛋白可识别的RNA片段,其由SEQ ID NO:1所示的DNA序列转录得到。
本发明还提供了上述RNA片段在检测细胞内HuR转录后调控活性中的应用。
本发明还提供了一种用于检测细胞内HuR转录后调控活性的方法,其包括以下步骤:
S1:将包含报告基因表达框的报告基因系统导入所述细胞,所述报告基因表达框的3’-UTR区包含SEQ ID NO:1所示的DNA片段;
S2:通过检测所述报告基因的表达来计算所述细胞内HuR转录后调控活性。可将报告基因的表达强度作为指示HuR转录后调控活性的指标。
优选地,所述报告基因系统为双荧光素酶报告基因系统,包括荧光素酶I表达框和荧光素酶II表达框,所述DNA片段连接在荧光素酶I表达框的3’-UTR区,所述荧光素酶I激发产生的荧光波长与荧光素酶II不同。将HuR转录后调控活性表示为荧光素酶I激发产生的荧光强度与荧光素酶II激发产生的荧光强度的比值。
优选地,所述荧光素酶I表达框和荧光素酶II表达框处于同一个载体上。
优选地,所述双荧光素酶报告基因系统通过将所述DNA片段插入至质粒psiCHECK中海肾荧光素酶基因的3’-UTR区得到。
优选地,S1具体包括:
S11:将所述细胞培养至贴壁,并恢复形态;
S12:将所述报告基因系统转染至细胞中。
优选地,S2具体包括:
S21:转染后将细胞继续培养24-36小时,洗涤细胞;
S22:分别检测转染后的细胞中的荧光素酶I和荧光素酶II的活性;
S23:将荧光素酶II活性归一化荧光素酶I活性得到值作为衡量HuR转录后调控活性的指标。
通过使用本发明的RNA片段和方法,可直接针对性地检测细胞内HuR的转录后调控活性,而非仅仅检测其转录本或蛋白质的含量,从而使得能够更准确地分析HuR作为mRNA结合因子在一些发育生物学和病理学发展中所起的作用。
附图说明
图1为Xho I与Not I对重组质粒进行双酶切后的琼脂糖凝胶电泳照片;
图2为分别转染有psiCHECK2和psiCHECK2-HuR-RLu的人前列腺癌细胞系PC-3、人宫颈癌细胞系HeLa和人胚肾细胞系HEK-293T细胞中的相对HuR活性(即,萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值)的统计图;
图3为分别转染有pcDNA-TAP(即,空载体)和pcDNA-TAP-HuR的人前列腺癌细胞系PC-3、人宫颈癌细胞系HeLa和人胚肾细胞系HEK-293T细胞中的相对HuR活性(即,萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值)的统计图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述,所举实例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。
1.构建HuR蛋白可结合的RNA片段的DNA编码序列
发明人对HuR进行研究分析,找到HuR结合的mRNA核心序列,参考该序列设计出编码HuR蛋白可结合的RNA片段的DNA编码序列,其序列如SEQ ID NO:1所示。将其连接至psiCHECKTM-2Vector海肾荧光素酶基因(hRluc)下游位点,即hRluc>
为保证载体构建的成功,在末端加入相应的限制性内切酶酶切位点的粘性末端,本例在5’端加入Xho I酶切位点的粘性末端(CTCGAG),在3’端加入Not I酶切位点的粘性末端(GCGGCCGC),序列两边的粘性末端的设计有助于片段与载体的连接。
通过从头合成的方法,分别合成该片段的两条寡核苷酸链,其序列分别如SEQ IDNO:2和3所示。两条寡核苷酸链互补配对后形成5’端包含Xho I酶切位点粘性末端和3’端包含Not I酶切位点粘性末端的双链DNA。100μl退火体系如下:Annealing Buffer for DNAOligos(5X)20μl、寡核苷酸链(50μM)各20μl,余下为ddH2O。
充分混匀后,设置PCR仪程序进行退火反应,具体程序为:95℃退火2分钟(目的是让DNAoligo充分变性);每90秒下降1℃,降至25℃后结束反应。DNA退火产物用1.5%普通琼脂糖凝胶电泳鉴定,测浓度后置冰上备用。
2.将上述DNA片段插入荧光素酶表达载体
本发明实施例选用的荧光素酶表达报告基因质粒为psiCHECKTM2质粒。用限制性内切酶Xho>TM2质粒进行双酶切,20μl酶切体系如下:10x>TM2空载体1μg,余下为ddH2O。
充分混匀后,37℃酶切反应90分钟,用1.5%普通琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒双酶切后的情况,然后切胶回收(DNA胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司,货号为DP209),回收结束后测样品浓度,置冰上备用。
将退火得到的双链DNA连接至psiCHECKTM2质粒荧光素酶报告基因质粒上。10μl连接体系如下:DNA连接酶(购自TAKARA公司,货号为6022)5μl,双链DNA片段与经双酶切的psiCHECKTM2载体共5μl。为促进酶连成功率,将DNA片段与载体的摩尔比控制在8:1左右。充分混匀后,将酶连体系置于PCR仪中,16℃反应1小时,连接反应结束后得到重组质粒,置于冰上备用。
将重组质粒(含有编码HuR蛋白可结合位点的DNA序列的psiCHECKTM2报告基因质粒)转化至大肠杆菌。具体方法如下:取解冻后的感受态大肠杆菌DH5α,加入上述连接好的重组质粒,轻柔吹打,冰上孵育20分钟,42℃热休克60秒,冰上静置3分钟,然后加入450μl不含抗生素的LB液体培养基,放置于恒温摇床中复苏1小时(37℃,200rpm)。取复苏后的菌液至铺有固体培养基(含氨苄青霉素)培养皿上,用玻璃铺菌器将菌液均匀地铺满整个平皿,放置10分钟后,倒置于37℃孵箱过夜后,观察细菌生长情况。挑取菌落至5ml含氨苄青霉素的LB液体培养基,摇菌(37℃,200rpm)繁殖12小时后提取质粒,1.5%普通琼脂糖凝胶电泳鉴定。
用内切酶Xho I和Not I对上述提取的质粒进行双酶切鉴定,本发明实施例双酶切鉴定如图1所示(泳道1为marker,泳道1-3显示为阳性克隆)。阳性组送至武汉擎科生物技术有限公司测序,确认DNA片段已整合至psiCHECKTM-2Vector报告基因质粒上。至此,含有编码HuR蛋白可结合位点的DNA片段的psiCHECKTM2报告基因质粒(以下均表示为psiCHECK2-HuR-RLuc)构建成功。
3.psiCHECK2-HuR-RLuc转染细胞
本发明实施例采用人前列腺癌细胞系PC-3、人宫颈癌细胞系HeLa、人胚肾细胞系HEK-293T进行双荧光素酶实验。分别将对数期生长的细胞均匀种植在24孔板内,每孔约10万个细胞,用10%胎牛血清,高糖DMEM培养基培养过夜。待细胞贴壁并恢复形态后,将报告基因系统相关质粒转染至细胞中(转染时细胞密度约为60-80%为宜)。使用的转染试剂为Neofect(购自零客创智生物科技有限公司,货号为TF20121201)。50μl转染体系如下:质粒0.5μg,Neofect转染试剂0.5μl,余下为无血清培养基。
本实验中使用的质粒分别为:psiCHECKTM-2Vector报告基因质粒、psiCHECK2-HuR-RLuc(含有编码HuR蛋白可结合位点的DNA片段的psiCHECKTM-2Vector报告基因质粒)、pcDNA-TAP(空质粒)、pcDNA-TAP-HuR(HuR过表达质粒)。
4.计算HuR的活性
以萤火虫荧光素酶活性作为内参进行标准化,计算HuR活性。具体实验方法如下:转染后的细胞继续培养24-36小时,再弃培养基上清,用1xPBS清洗细胞3次,每次5分钟,清洗细胞时注意操作轻柔,避免正面吹打细胞。采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒(购自盖宁生物科技有新公司,货号为GN201-01)进行检测。
本发明实施例为验证该报告基因系统是否具有活性,将psiCHECKTM-2质粒和psiCHECK2-HuR-RLuc质粒转染至细胞中,检测报告基因系统的活性,测定结果如图2所示,处理组(转染psiCHECK2-HuR-RLuc)的相对荧光素酶活性明显高于对照组(转染psiCHECKTM-2空载体)。
本发明实施例为验证该报告基因系统是否可以特异性检测HuR活性,将pcDNA-TAP质粒和pcDNA-TAP-HuR质粒分别转染至细胞,结果如图3所示,外源导入HuR后,阳性处理组(转染pcDNA-TAP-HuR)荧光活性明显高于对照组(转染pcDNA-TAP空载体)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中科技大学同济医学院附属协和医院
<120> 一种HuR蛋白可识别的RNA片段及在HuR活性检测中的应用
<130> 1
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tggataccgt tcgttgttaa ccgttgatag ccttggtttt taagccgtat atggctgtaa 60
ataatt 66
<210> 2
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcgagtggat accgttcgtt gttaaccgtt gatagccttg gtttttaagc cgtatatggc 60
tgtaaataat tgc 73
<210> 3
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggccgcaatt atttacagcc atatacggct taaaaaccaa ggctatcaac ggttaacaac 60
gaacggtatc cac 73
机译: 测量体液中胶原蛋白片段的方法,试剂盒,实施该方法的方法以及胶原蛋白-如何使用一种方法来诊断与当前代谢和应用相关的疾病的存在
机译: 一种在哺乳动物或其片段之一中识别并特异性结合磷酸Tau蛋白表位的抗体以及包含该抗体的组合物
机译: 具有S. MANSONI 28KD蛋白质分离抗原特性的肽及其分离方法,至少一种表位的单克隆抗体识别方法及其在诱导中和抗体合成中的应用