一种菜心炭疽病菌中长期保存方法

摘要

本发明属于公开一种菜心炭疽病菌中长期保存方法，植物保护技术领域。该方法包括如下步骤：菜心炭疽病菌分离与培养；制备SNA斜面培养基，即取融解后SNA培养基加入到冻存管内，倾斜放置，待其凝固后即制成；取菜心炭疽病菌的菌落边缘菌丝块接种到冻存管SNA斜面培养基上，拧紧封盖口并用封口膜密封管口后放入冻存管盒，培养后置于4～15℃保存。该方法操作简便，无需昂贵的设备；无需较大空间；保存时间较长：菜心炭疽病菌在SNA斜面培养基上低温保存的环境下可以存活4年以上，且保持较强的致病力。该方法简便、实用，用于长期监测菜心炭疽病菌致病力差异，抗药性变化、评价菜心品种的抗病性水平以及筛选高活性杀菌剂等研究。

说明书

技术领域

本发明属于植物保护技术领域，具体涉及一种菜心炭疽病菌中长期保存方法。

背景技术

菜心是广东省乃至华南地区重要特色蔬菜，其栽培面积大，复种指数高，可周年生产供应。菜心炭疽病是菜心生产上最重要的病害之一，严重影响菜心的品质与产量。测定不同地区菜心炭疽病菌(也即希金斯炭疽菌Colletotrichum higginsanum)致病力差异、监测病菌的抗药性变化、评价菜心品种的抗病性水平、筛选对病菌有活性的杀菌剂等研究，均需要有大量的中长期保存且生物学特性稳定的菜心炭疽病菌株。

目前，植物病原真菌保存方法主要有3种。(1)斜面低温保存法：即将菌株接种在装有适宜的固体斜面培养基的玻璃试管内，用棉塞和牛皮纸将管口包扎好，待菌株充分生长后，移至4℃～10℃的冰箱中保藏。该保存方法操作简单，使用方便，无需专用仪器设备，但斜面培养基容易干燥，保存时间通常不超过一年；此外，保存菌株需要的贮存空间大，器皿保管困难，污染杂菌的机会较多，不宜大批量长时间保存菌株。(2)冷冻真空干燥保存法：将待保藏菌株的孢子悬液悬浮于保护剂(如脱脂牛奶、甘油)中，在低温(-45℃左右)下快速冷冻，在真空条件下使冰升华，以除去大部分水，密封安瓿管，4℃冰箱保存。该方法保藏菌种时间长、存活率高，但需要昂贵的冷冻干燥等专业设备，保存成本高，不适用于普通实验室。(3)液氮超低温保藏法：将菌株菌丝或孢子混悬于含保护剂(如20％甘油)的液体培养基中，分装入耐低温的安瓿瓶或塑料离心管后预冷，然后移至液氮罐中(-196℃)保存。该方法保存菌株时间长，且适合保藏各类微生物，但需要液氮罐等特殊设备，存在液氮易挥发需要经常添加、管理费用高、使用不便等不足。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种菜心炭疽病菌中长期保存方法。该方法简便、实用，用于长期监测菜心炭疽病菌致病力差异，抗药性变化、评价菜心品种的抗病性水平以及筛选高活性杀菌剂等研究。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种菜心炭疽病菌中长期保存方法，包括如下步骤：

(1)菜心炭疽病菌分离与培养；

(2)制备SNA斜面培养基：取融解后SNA培养基，加入到冻存管内，倾斜放置，待SNA培养基凝固后即制成SNA斜面培养基；

(3)菜心炭疽病菌保存：取步骤(1)已纯化的菜心炭疽病菌的菌落边缘菌丝块接种到步骤(2)冻存管SNA斜面培养基上，拧紧封盖口并用封口膜密封管口，培养后置于4～15℃保存。

为了更好的实现本发明，还包括：

(4)保存菌株的活化：从4℃冰箱中取出装有菜心炭疽病菌的冻存管，挑取带菌的培养基块，置于PDA培养基上活化培养，即可见菌丝长出，备用。

步骤(1)中所述的菜心炭疽病菌分离与培养，包括如下步骤：

采集菜心炭疽病样，选取带有典型病斑的组织，用清水冲洗干净，在病健交界处剪取组织块；依次在75％的酒精和1％的次氯酸钠溶液中消毒处理后，在无菌水中漂洗3次；取出后用灭菌的滤纸吸去多余的水分，在超净工作台吹干后置于PDA平板上培养；待长出菌丝后，挑取菌落边缘菌丝块进行再培养；采用单菌丝挑取法或单孢分离法对所分离的菌株进行纯化，经科赫氏法则验证后得到菜心炭疽病菌。

所述的组织块为0.3cm×0.5cm大小的组织块。

所述的消毒的时间为15s～45s，优选为30s。

所述的培养的温度为25℃～30℃，优选为27℃。

步骤(2)中所述的SNA(合成低营养琼脂培养基)培养基：1g/L KH₂PO₄，1g/L>3，0.5g/L>4·7H₂O，0.5g/L>

步骤(3)中所述的培养的条件为25℃～30℃培养2d～5d，优选为27℃培养2d。

步骤(3)中所述的保存时间至少长达4年。

步骤(4)中所述的活化培养的条件为25℃～30℃活化培养3d～7d，优选为27℃培养5d。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

(1)操作简便：保存菌株在超净工作台操作，保存在洁净、普通冰箱即可，无需昂贵的设备。

(2)无需较大空间：2mL冻存管体积小，长12cm的方形塑料盒可放入81管，相当于可以保存81株菌株。

(3)保存时间较长：菜心炭疽病菌在SNA斜面培养基上低温保存的环境下可以存活4年以上，且保持较强的致病力。

附图说明

图1是保存菜心炭疽病菌的操作流程图。

图2是菜心炭疽病菌在PDA上27℃培养5d时的菌落形态图。

图3是菜心炭疽病菌保存用的冻存管及冻存管盒图。

图4是保存4年后菜心炭疽病菌27℃活化5d的菌落生长形态图。

图5是保存4年后菜心炭疽病菌的致病效果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

原材料规格：

所述的SNA(合成低营养琼脂培养基)培养基：1g/L KH₂PO₄，1g/L>3，0.5g/LMgSO₄·7H₂O，0.5g/L>

SNA培养基配方组份的材料均为分析纯化学试剂。

其它实验操作所需要的2mL冻存管、PDA培养基、蒸馏水、培养皿、移液器、灭菌锅、冰箱、超净工作台等均为实验室常规材料或工具。

保存菜心炭疽病菌的操作流程图，如图1所示。

实施例1对来源于田间的菜心炭疽病样中病菌分离和保存效果

(1)在田间挑选典型的菜心炭疽病新鲜病样，清水冲洗干净后剪取病健交界处组织块(约0.3cm×0.5cm)，在超净工作台上分别用75％酒精和1％次氯酸钠溶液各消毒30s，无菌水冲洗三遍后晾干水分，然后移至PDA平板上，27℃培养5d后挑选菌落边缘菌丝块纯化培养即可获得分离菌。

(2)用无菌的经晒干的豇豆组织块(去掉籽粒)插入到分离菌的菌落边缘处，27℃培养5d后镜检豇豆组织块，若能在豇豆组织块表皮镜检到大量的长椭圆形分生孢子，即可初步确定为菜心炭疽病的病原菌(希金斯炭疽菌)。将获得的分生孢子接种菜心，确认其对菜心致病并引起典型的炭疽病症状；然后进行单孢分离和纯化培养，从而获得菜心炭疽病菌。菜心炭疽病菌菌落形态如图2所示。

(3)将纯化后的菜心炭疽病菌置于PDA培养基上27℃培养5d，然后用无菌牙签挑取菌落边缘菌丝块接种到2mL冻存管内的SNA斜面培养基上，拧紧封盖口并用封口膜密封管口，放入冻存管盒，27℃培养2d后，置于4℃冰箱保存。菜心炭疽病菌保存用冻存管及冻存管盒如图3所示。

(4)将保存1年、2年和3年的菜心炭疽病菌，各挑取一小块带菌丝的培养基到PDA平板上，27℃培养3d，观察有无菌丝长出。长出新的菌丝，即判定是存活；未长出新的菌丝，即判定为死亡。如此随机各挑取20个保存的冻存管中的菌株到PDA平板上活化，检测和统计存活管比例。检测结果显示，随机挑选的保存1年、2年和3年的管中菌株全部存活，存活率为100％。

实施例2对中长期保存的菜心炭疽病菌保存效果的检测

(1)保存的菜心炭疽病菌存活率检测

从实施例1保存4年的2mL冻存管内随机挑取一小块带菌丝的培养基到PDA平板上，27℃培养3d，观察有无菌丝长出。长出新的菌丝，即判定是存活；未长出新的菌丝，即判定为死亡。如此随机挑取50个保存4年的冻存管中的菌到PDA平板上活化，检测和统计存活管比例。检测结果显示，随机挑选的保存4年的管中菌全部是存活的，存活率为100％(图4)。

(2)保存的菜心炭疽病菌致病力测定

从实施例1保存4年的2mL冻存管内随机挑取一小块带菌丝的培养基到PDA平板上，27℃培养，待其长出菌丝后在平板上插入无菌的晒干豇豆荚，黑暗培养7d后，用清水洗下分生孢子，用血球计数板测量孢子悬浮液浓度，并稀释至1×10⁵个孢子/mL。将孢子悬浮液用手持喷雾器接种到3～4片真叶期的菜心叶片上，叶面布满小水珠但不下滴，黑暗保湿12h后，置于25±2℃温室内，早上和傍晚花洒浇一次水。接种5d后调查叶片的发病情况。如此随机测试3株不同来源的菌株的致病力。测定结果表明，保存4年的3株菜心炭疽病菌均能使菜心叶片发病，发病叶面积占全部叶面积的50％以上，说明保存4年的菜心炭疽病菌仍具有强致病力(图5)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。