菜心不同抗性品种响应炭疽病菌侵染的转录组研究

摘要

菜心是我国重要的叶菜类蔬菜，其栽培面积广，经济效益好，在华南地区蔬菜的周年均衡供应与出口创汇方面起着重要的作用。炭疽病是菜心生产过程重要的病害，其致病病原菌为希金斯炭疽菌，华南地区高温高湿的气候环境有利于该病原菌的繁殖和传播，严重时导致产量损失30%～40%。因此，深入研究菜心与炭疽病菌的互作过程，探讨可能的抗病机制，发掘潜在的抗病基因，对菜心炭疽病的科学防治以及抗病相关分子育种有着重要的意义。本研究在对41个菜心品种进行抗病性鉴定的基础上，筛选出抗病和感病的菜心品种，并通过RNA-seq技术分析比较抗病与感病品种受希金斯炭疽菌侵染前后的转录组数据。主要研究结论如下：
　　1、对3～4叶期的菜心叶片进行人工喷雾接种希金斯炭疽菌，根据不同温度采用不同的接种浓度和接种后保湿时间能够显著区分不同菜心的抗病性。供试的41个菜心品种接种希金斯炭疽菌后的病情指数在35.045～64.643之间，没有发现高抗病的品种，也没有发现高感病品种，只有中抗病品种和感病品种，其中中抗病品种33个，感病品种8个。根据对41个品种的病原菌接种以及病情指数调查和抗性分级鉴定，并结合植株的生长情况和品种特性，筛选出抗病的迟心2号（病情指数为35.045，以下称为抗病品种）和感病的油绿701（病情指数为63.265，以下称为感病品种）两个品种供转录组的研究分析。
　　2、以抗病品种和感病品种为试验材料，以灭菌水处理为对照，采用RNA-seq技术，对接种希金斯炭疽菌后48 h的不同抗性品种的叶片进行高通量测序，将测序结果与大白菜基因组进行比对和基因功能注释后，分析了不同抗性菜心品种接种希金斯炭疽菌后差异表达基因以及GO和KEGG富集情况，研究结果如下：
　　（1）通过基因差异表达分析，抗病品种接种后较对照产生了1511个差异表达基因，其中上调表达基因664个，下调表达基因847个；感病品种接种后较对照产生了68个差异表达基因，其中上调表达基因16个，下调表达基因52个。抗病和感病品种的差异表达基因中有17个共同的下调差异表达基因，其余均为品种中的特异性差异表达基因。
　　（2）通过GO功能富集性分析发现，抗病品种的3123个差异表达基因显著富集到28个GO term，主要涉及到生物学过程和催化活性等，而感病品种中的差异表达基因则无显著性富集GO term。通过KEGG富集分析发现，抗病品种显著性富集pathway为光合作用天线蛋白（Photosynthesis-antenna proteins）和谷胱甘肽代谢（Glutathione metabolism），而感病品种差异表达基因显著性富集 pathway为抗坏血酸代谢（Ascorba tea nda ldara te me tabo lis m）。
　　（3）受病原菌侵染后，在抗病品种中有大量抗病相关基因发生差异表达，其中抗病相关WRKY转录因子WRKY15、WRKY18、WRKY33、WRKY40、WRKY53、WRKY60以及NAC转录因子ATAF1、ANAC042、ANAC055、ANAC072（RD26）均发生上调表达，同时还有抗病相关转录因子 MYB、bZIP、bHLH以及 ERF等发生差异表达；而感病品种只有2个抗病相关转录因子发生差异表达，ANAC029表现为下调表达，MYB111表现为上调表达。可见，转录因子在菜心响应希金斯炭疽菌的抗病防御反应中有着重要的调控作用。
　　（4）病原菌的侵染会诱导植物细胞壁的增强，在抗病品种差异表达基因中，与木质素合成相关的肉桂酰辅酶A还原酶（cinnamoyl-CoA reductase family）、肉桂酸-4-羟化酶（cinnamate-4-hydroxylase, C4H）、咖啡酸辅酶 A-O-甲基转移酶（caffeoyl-CoA O-methyltransferase,CCOAMT）、O-甲基转移酶（O-methyltransferase1,ATOMT1）、桂皮酰乙醇脱氢酶（cinnamyl-alcohol dehydrogenase family,CAD family）等均发生上调表达，而感病品种中无相关基因发生差异表达。表明在病原菌侵染菜心的过程中，可能通过增加细胞壁的形成来抵抗病原菌的入侵。
　　（5）植物激素参与植物响应病原菌的侵染，在抗病品种差异表达基因中，SA相关基因PAD4、PR5、TIR-NBS-LRR均发生上调表达；JA相关基因PR3、PR4、JAZ1、JAZ2、JAZ5和酰基辅酶A氧化酶（acyl-CoA oxidase4,ACX4）、丙二烯氧化环化酶（allene-oxide cyclase,AOC）以及脂肪氧化合酶（lipoxygenase,LOX）、CCCH型锌指蛋白（zinc finger(CCCH-type)family protein）均发生上调表达；ET以及JA/ET信号途径中的1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase,ACCsynthase）、ERF1、CEJ1发生上调表达。在感病品种中JA相关基因JAZ9、CCCH型锌指蛋白（zinc finger(CCCH-type) family protein）以及乙烯响应蛋白（ethylene-responsive element-binding protein）均表现为下调表达。表明SA、JA、ET均参与调控菜心响应希金斯炭疽菌侵染的防御反应，并且JA/ET信号途径可能为主要的信号调节途径。
　　（6）病原菌的侵染会诱导植物体内ROS的爆发，抑制病原菌的生长，但过量的ROS会对植物本身的细胞结构等带来伤害。结果表明，在抗病品种中，与ROS清除相关的CAT、SOD、POD、GPX7、GR、GST均发生上调表达，可诱导ROS产生的PR15/PR16发生下调表达，而感病品种中没有抗氧化酶基因发生差异表达。表明ROS参与调控菜心响应希金斯炭疽菌侵染的防御反应。
　　（7）随机挑选抗病品种和感病品种中共30个差异表达基因进行实时荧光定量（qRT-PCR）验证，结果显示这些基因的表达变化趋势与RNA-seq一致，表明RNA-seq结果可靠。
　　综上所述，菜心响应希金斯炭疽菌侵染后，会诱导多种不同的抗病途径参与到菜心的抗病反应中，形成一个复杂的调控网络，而其中转录因子、植物激素以及活性氧可能对菜心的抗希金斯炭疽病反应起着主要的调控作用。

目录

声明

缩 略 词 表

1 前言

1. 1 菜心炭疽病及其研究进展

1. 2 植物抗病机制

1. 3 植物抗病基因

1. 4 植物防御相关基因

1. 5 植物抗病相关转录因子

1. 6 植物炭疽病研究进展

1.7转录组测序（RNA-seq）技术在植物病原互作机制研究中的应用

1. 8 本课题的研究内容、目的和意义

2. 1 供试品种

2. 2 病原菌培养

2. 3 病原菌接种

2. 4 菜心品种抗性鉴定

2. 5菜心不同抗性品种应答炭疽病菌侵染的转录组分析

2.6实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证分析

3 结果与分析

3. 1 不同菜心品种的抗病性鉴定

3.2 RNA测序质量的评估

3. 3差异表达基因的筛选

3. 4差异表达基因的GO功能显著性分析

3.5差异表达基因的KEGG pathway 富集分析

3. 6抗病相关差异表达基因表达情况分析

3.7实时荧光定量（qRT-PCR）验证

4 讨论

4. 1 菜心品种资源的炭疽病抗性鉴定分析

4. 2转录因子对菜心炭疽病抗性的影响

4. 3植物激素对菜心炭疽病抗性的影响

4.4 ROS 对菜心炭疽病抗性的影响

4. 5其它因子对菜心炭疽病抗性的影响

5全文结论

致谢

参考文献

附录