一种大豆异黄酮分离纯化用大孔吸附树脂的制备方法

摘要

本发明公开了一种大豆异黄酮分离纯化用大孔吸附树脂的制备方法，涉及生物医药纯化技术领域，制备方法包括如下步骤：(1)大孔吸附树脂的制备，(2)大孔吸附树脂的预处理，(3)大孔吸附树脂的改性。本发明所制大孔吸附树脂对大豆异黄酮的吸附量达到17mg/g以上，经60％甲醇溶液冲洗后能实现大豆异黄酮的高效解吸，解吸率达到98.5％以上，所制大豆异黄酮的纯度达到60％以上，因此该大孔吸附树脂适用于大豆异黄酮的高效分离。

说明书

技术领域：

本发明涉及生物医药纯化技术领域，具体涉及一种大豆异黄酮分离纯化用大孔吸附树脂的制备方法。

背景技术：

天然存在的大豆异黄酮共有12种，分为大豆苷、染料木苷和黄豆黄素苷3大类。大豆异黄酮具有抗氧化、预防癌症、增强免疫力及改善动物生产性能等功能，已被广泛应用于生物、饲料、医药和食品保健等领域中。研究发现，只有游离型的苷元才具有生物学活性，需经酶解或酸水解糖苷转化成游离型的苷元才能被动物或人体所吸收。目前，提高大豆异黄酮中苷元含量的方法主要有浸提法、物理辅助法、高压湿法和超滤法等，但这些方法存在工艺较复杂、成本较高和有机溶剂残留量高等缺点，不适于批量化制备。

大孔吸附树脂法是近年来使用广泛的一种纯化方法，相对其他纯化方法具有选择性好、无毒和无污染等优点，但目前使用的大孔吸附树脂的吸附量较低，且解吸时需要大量有机溶剂冲洗，即使这些有机溶剂能被回收再利用，也需要消耗大量能量来实现。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题在于提供一种吸附量高、解吸容易且苷元含量高的大豆异黄酮分离纯化用大孔吸附树脂的制备方法。

本发明所要解决的技术问题采用以下的技术方案来实现：

一种大豆异黄酮分离纯化用大孔吸附树脂的制备方法，其制备方法包括如下步骤：

(1)大孔吸附树脂的制备：向水中按比例加入苯乙烯、氢化松香丙烯酸丙三醇酯、甲基丙烯酸羟乙酯、纳米致孔剂和引发剂，充分混合后于超声频率40kHz、输出功率200W下超声处理15min，再于微波频率2450MHz、输出功率700W下微波处理10min，并于0-5℃环境中静置30min，混合均匀后继续微波处理10min，然后于-5-0℃环境中静置15min，混合均匀后再次微波处理10min，所得混合液以5℃/min的降温速度降温至0-5℃保温混合1h，随后将混合液固液分离，所得固相用35-40℃温水水洗三次得到白球，最后将白球于60-65℃下真空干燥，即得大孔吸附树脂；

(2)大孔吸附树脂的预处理：向上述所制大孔吸附树脂中加入泊洛沙姆、N-羟甲基丙烯酰胺和水解聚马来酸酐，并以5℃/min的升温速度升温至65-70℃保温混合30min，再向所得混合物中加入3倍重量30-35℃水，继续以5℃/min的升温速度升温至回流状态保温混合15min，然后自然冷却至室温，过滤，所得树脂球体水洗三次，最后于60-65℃下真空干燥；

(3)大孔吸附树脂的改性：向异氰尿酸三缩水甘油酯中加入纳米二氧化钛和衣康酸酐，以5℃/min的升温速度升温至115-120℃保温混合15min，再加入经预处理后的大孔吸附树脂，继续在115-120℃保温混合30min，待自然冷却至室温后水洗三次，最后经所得树脂球体于60-65℃下真空干燥。

所述步骤(1)中水、苯乙烯、氢化松香丙烯酸丙三醇酯、甲基丙烯酸羟乙酯、纳米致孔剂和引发剂的质量比为300-400:45-50:30-35:15-20:40-45:0.5-1。

所述步骤(2)中大孔吸附树脂、泊洛沙姆、N-羟甲基丙烯酰胺和水解聚马来酸酐的质量比为60-65:1-2:0.5-1:0.5-1。

所述步骤(3)中大孔吸附树脂、异氰尿酸三缩水甘油酯、纳米二氧化钛和衣康酸酐的质量比为60-65:5-10:3-5:0.1-0.2。

所述纳米致孔剂由如下重量份数的原料制成：微晶纤维素5-10份、多聚谷氨酸3-5份、氢化蓖麻油1-2份、聚二甲基二烯丙基氯化铵0.5-1份、葡萄糖酸钠0.5-1份、二茂铁0.05-0.1份、水30-50份，其制备方法为：向水中加入微晶纤维素和氢化蓖麻油，并升温至回流状态保温混合15min，待自然冷却至40-45℃后加入多聚谷氨酸和聚二甲基二烯丙基氯化铵，搅拌30min形成乳液，然后加入葡萄糖酸钠和二茂铁，混合均匀后将所得混合物送入喷雾干燥机中，干燥所得颗粒经研磨制成纳米粉末，最后将纳米粉末加水制成固含量30-35wt％的乳液，即得纳米致孔剂。

所述纳米二氧化钛是由二氧化钛经改性处理后制成的纳米粉体，其制备方法为：向二氧化钛中加入交联聚维酮和六羟甲基三聚氰胺六甲醚，先以5℃/min的升温速度升温至120-125℃保温混合30min，再加入阴离子聚丙烯酰胺和环氧大豆油，继续在120-125℃下保温混合30min，所得混合物以10℃/min的降温速度降温至40-50℃，并加入40-50℃水，以10℃/min的升温速度升温至回流状态保温混合10min，经自然冷却至室温后静置1h，过滤，所得固体于75-80℃下烘干，最后送入纳米研磨机中，经研磨得到纳米二氧化钛。

所述二氧化钛、交联聚维酮、六羟甲基三聚氰胺六甲醚、阴离子聚丙烯酰胺、环氧大豆油和水的质量比为30-40:3-5:0.5-1:2-3:0.1-0.3:100-150。

本发明的有益效果是：

(1)在大孔吸附树脂的制备阶段采用三步微波处理法协以降温操作，在缩短制备时间的同时提高大孔吸附树脂的耐高低温性；

(2)通过水溶性的泊洛沙姆、N-羟甲基丙烯酰胺和水解聚马来酸酐的预处理，降低大孔吸附树脂的表面张力，增加大孔吸附树脂的表面活性，以利于下步的改性处理；

(3)利用异氰尿酸三缩水甘油酯、纳米二氧化钛和衣康酸酐对大孔吸附树脂进行改性处理，增大其比表面积，增强其吸附活性；

(4)所制大孔吸附树脂对大豆异黄酮的吸附量达到17mg/g以上，经60％甲醇溶液冲洗后能实现大豆异黄酮的高效解吸，解吸率达到98.5％以上，所制大豆异黄酮的纯度达到60％以上，因此该大孔吸附树脂适用于大豆异黄酮的高效分离。

具体实施方式：

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1

(1)大孔吸附树脂的制备：向350份水中按比例加入45份苯乙烯、30份氢化松香丙烯酸丙三醇酯、15份甲基丙烯酸羟乙酯、40份纳米致孔剂和0.5份引发剂，充分混合后于超声频率40kHz、输出功率200W下超声处理15min，再于微波频率2450MHz、输出功率700W下微波处理10min，并于0-5℃环境中静置30min，混合均匀后继续微波处理10min，然后于-5-0℃环境中静置15min，混合均匀后再次微波处理10min，所得混合液以5℃/min的降温速度降温至0-5℃保温混合1h，随后将混合液固液分离，所得固相用35-40℃温水水洗三次得到白球，最后将白球于60-65℃下真空干燥，即得大孔吸附树脂；

(2)大孔吸附树脂的预处理：向上述所制60份大孔吸附树脂中加入2份泊洛沙姆、0.5份N-羟甲基丙烯酰胺和1份水解聚马来酸酐，并以5℃/min的升温速度升温至65-70℃保温混合30min，再向所得混合物中加入3倍重量30-35℃水，继续以5℃/min的升温速度升温至回流状态保温混合15min，然后自然冷却至室温，过滤，所得树脂球体水洗三次，最后于60-65℃下真空干燥；

(3)大孔吸附树脂的改性：向10份异氰尿酸三缩水甘油酯中加入3份纳米二氧化钛和0.15份衣康酸酐，以5℃/min的升温速度升温至115-120℃保温混合15min，再加入经预处理后的60份大孔吸附树脂，继续在115-120℃保温混合30min，待自然冷却至室温后水洗三次，最后经所得树脂球体于60-65℃下真空干燥。

纳米致孔剂的制备：向50份水中加入5份微晶纤维素和1份氢化蓖麻油，并升温至回流状态保温混合15min，待自然冷却至40-45℃后加入5份多聚谷氨酸和0.5份聚二甲基二烯丙基氯化铵，搅拌30min形成乳液，然后加入0.5份葡萄糖酸钠和0.05份二茂铁，混合均匀后将所得混合物送入喷雾干燥机中，干燥所得颗粒经研磨制成纳米粉末，最后将纳米粉末加水制成固含量30-35wt％的乳液，即得纳米致孔剂。

纳米二氧化钛的制备：向40份二氧化钛中加入3份交联聚维酮和0.5份六羟甲基三聚氰胺六甲醚，先以5℃/min的升温速度升温至120-125℃保温混合30min，再加入3份阴离子聚丙烯酰胺和0.2份环氧大豆油，继续在120-125℃下保温混合30min，所得混合物以10℃/min的降温速度降温至40-50℃，并加入40-50℃150份水，以10℃/min的升温速度升温至回流状态保温混合10min，经自然冷却至室温后静置1h，过滤，所得固体于75-80℃下烘干，最后送入纳米研磨机中，经研磨得到纳米二氧化钛。

实施例2

(1)大孔吸附树脂的制备：向350份水中按比例加入50份苯乙烯、35份氢化松香丙烯酸丙三醇酯、15份甲基丙烯酸羟乙酯、40份纳米致孔剂和0.5份引发剂，充分混合后于超声频率40kHz、输出功率200W下超声处理15min，再于微波频率2450MHz、输出功率700W下微波处理10min，并于0-5℃环境中静置30min，混合均匀后继续微波处理10min，然后于-5-0℃环境中静置15min，混合均匀后再次微波处理10min，所得混合液以5℃/min的降温速度降温至0-5℃保温混合1h，随后将混合液固液分离，所得固相用35-40℃温水水洗三次得到白球，最后将白球于60-65℃下真空干燥，即得大孔吸附树脂；

(2)大孔吸附树脂的预处理：向上述所制65份大孔吸附树脂中加入2份泊洛沙姆、1份N-羟甲基丙烯酰胺和0.5份水解聚马来酸酐，并以5℃/min的升温速度升温至65-70℃保温混合30min，再向所得混合物中加入3倍重量30-35℃水，继续以5℃/min的升温速度升温至回流状态保温混合15min，然后自然冷却至室温，过滤，所得树脂球体水洗三次，最后于60-65℃下真空干燥

(3)大孔吸附树脂的改性：向10份异氰尿酸三缩水甘油酯中加入5份纳米二氧化钛和0.15份衣康酸酐，以5℃/min的升温速度升温至115-120℃保温混合15min，再加入经预处理后的65份大孔吸附树脂，继续在115-120℃保温混合30min，待自然冷却至室温后水洗三次，最后经所得树脂球体于60-65℃下真空干燥。

纳米致孔剂的制备：向50份水中加入10份微晶纤维素和2份氢化蓖麻油，并升温至回流状态保温混合15min，待自然冷却至40-45℃后加入5份多聚谷氨酸和0.5份聚二甲基二烯丙基氯化铵，搅拌30min形成乳液，然后加入0.5份葡萄糖酸钠和0.05份二茂铁，混合均匀后将所得混合物送入喷雾干燥机中，干燥所得颗粒经研磨制成纳米粉末，最后将纳米粉末加水制成固含量30-35wt％的乳液，即得纳米致孔剂。

纳米二氧化钛的制备：向40份二氧化钛中加入5份交联聚维酮和0.5份六羟甲基三聚氰胺六甲醚，先以5℃/min的升温速度升温至120-125℃保温混合30min，再加入2份阴离子聚丙烯酰胺和0.2份环氧大豆油，继续在120-125℃下保温混合30min，所得混合物以10℃/min的降温速度降温至40-50℃，并加入40-50℃150份水，以10℃/min的升温速度升温至回流状态保温混合10min，经自然冷却至室温后静置1h，过滤，所得固体于75-80℃下烘干，最后送入纳米研磨机中，经研磨得到纳米二氧化钛。

实施例3

(1)大孔吸附树脂的制备：向350份水中按比例加入50份苯乙烯、35份氢化松香丙烯酸丙三醇酯、15份甲基丙烯酸羟乙酯、40份纳米致孔剂和0.5份引发剂，充分混合后于超声频率40kHz、输出功率200W下超声处理15min，再于微波频率2450MHz、输出功率700W下微波处理10min，并于0-5℃环境中静置30min，混合均匀后继续微波处理10min，然后于-5-0℃环境中静置15min，混合均匀后再次微波处理10min，所得混合液以5℃/min的降温速度降温至0-5℃保温混合1h，随后将混合液固液分离，所得固相用35-40℃温水水洗三次得到白球，最后将白球于60-65℃下真空干燥，即得大孔吸附树脂；

(4)大孔吸附树脂的预处理：向上述所制65份大孔吸附树脂中加入2份泊洛沙姆、1份N-羟甲基丙烯酰胺和0.5份水解聚马来酸酐，并以5℃/min的升温速度升温至65-70℃保温混合30min，再向所得混合物中加入3倍重量30-35℃水，继续以5℃/min的升温速度升温至回流状态保温混合15min，然后自然冷却至室温，过滤，所得树脂球体水洗三次，最后于60-65℃下真空干燥

(5)大孔吸附树脂的改性：向10份异氰尿酸三缩水甘油酯中加入5份纳米二氧化钛和0.15份衣康酸酐，以5℃/min的升温速度升温至115-120℃保温混合15min，再加入经预处理后的65份大孔吸附树脂，继续在115-120℃保温混合30min，待自然冷却至室温后水洗三次，最后经所得树脂球体于60-65℃下真空干燥。

纳米致孔剂的制备：向50份水中加入10份微晶纤维素和2份氢化蓖麻油，并升温至回流状态保温混合15min，待自然冷却至40-45℃后加入5份多聚谷氨酸和0.5份聚二甲基二烯丙基氯化铵，搅拌30min形成乳液，然后加入0.5份葡萄糖酸钠和0.05份二茂铁，混合均匀后将所得混合物送入喷雾干燥机中，干燥所得颗粒经研磨制成纳米粉末，最后将纳米粉末加水制成固含量30-35wt％的乳液，即得纳米致孔剂。

对照例1

(1)大孔吸附树脂的制备：向350份水中按比例加入50份苯乙烯、35份氢化松香丙烯酸丙三醇酯、15份甲基丙烯酸羟乙酯、40份异辛烷和0.5份引发剂，充分混合后于超声频率40kHz、输出功率200W下超声处理15min，再于微波频率2450MHz、输出功率700W下微波处理10min，并于0-5℃环境中静置30min，混合均匀后继续微波处理10min，然后于-5-0℃环境中静置15min，混合均匀后再次微波处理10min，所得混合液以5℃/min的降温速度降温至0-5℃保温混合1h，随后将混合液固液分离，所得固相用35-40℃温水水洗三次得到白球，最后将白球于60-65℃下真空干燥，即得大孔吸附树脂；

(2)大孔吸附树脂的预处理：向上述所制65份大孔吸附树脂中加入2份泊洛沙姆、1份N-羟甲基丙烯酰胺和0.5份水解聚马来酸酐，并以5℃/min的升温速度升温至65-70℃保温混合30min，再向所得混合物中加入3倍重量30-35℃水，继续以5℃/min的升温速度升温至回流状态保温混合15min，然后自然冷却至室温，过滤，所得树脂球体水洗三次，最后于60-65℃下真空干燥

(3)大孔吸附树脂的改性：向10份异氰尿酸三缩水甘油酯中加入5份纳米二氧化钛和0.15份衣康酸酐，以5℃/min的升温速度升温至115-120℃保温混合15min，再加入经预处理后的65份大孔吸附树脂，继续在115-120℃保温混合30min，待自然冷却至室温后水洗三次，最后经所得树脂球体于60-65℃下真空干燥。

纳米二氧化钛的制备：向40份二氧化钛中加入5份交联聚维酮和0.5份六羟甲基三聚氰胺六甲醚，先以5℃/min的升温速度升温至120-125℃保温混合30min，再加入2份阴离子聚丙烯酰胺和0.2份环氧大豆油，继续在120-125℃下保温混合30min，所得混合物以10℃/min的降温速度降温至40-50℃，并加入40-50℃150份水，以10℃/min的升温速度升温至回流状态保温混合10min，经自然冷却至室温后静置1h，过滤，所得固体于75-80℃下烘干，最后送入纳米研磨机中，经研磨得到纳米二氧化钛。

对照例2

(1)大孔吸附树脂的制备：向350份水中按比例加入50份苯乙烯、35份氢化松香丙烯酸丙三醇酯、15份甲基丙烯酸羟乙酯、40份异辛烷和0.5份引发剂，充分混合后于超声频率40kHz、输出功率200W下超声处理15min，再于微波频率2450MHz、输出功率700W下微波处理10min，并于0-5℃环境中静置30min，混合均匀后继续微波处理10min，然后于-5-0℃环境中静置15min，混合均匀后再次微波处理10min，所得混合液以5℃/min的降温速度降温至0-5℃保温混合1h，随后将混合液固液分离，所得固相用35-40℃温水水洗三次得到白球，最后将白球于60-65℃下真空干燥，即得大孔吸附树脂；

(2)大孔吸附树脂的预处理：向上述所制65份大孔吸附树脂中加入2份泊洛沙姆、1份N-羟甲基丙烯酰胺和0.5份水解聚马来酸酐，并以5℃/min的升温速度升温至65-70℃保温混合30min，再向所得混合物中加入3倍重量30-35℃水，继续以5℃/min的升温速度升温至回流状态保温混合15min，然后自然冷却至室温，过滤，所得树脂球体水洗三次，最后于60-65℃下真空干燥

(3)大孔吸附树脂的改性：向10份异氰尿酸三缩水甘油酯中加入5份纳米二氧化钛和0.15份衣康酸酐，以5℃/min的升温速度升温至115-120℃保温混合15min，再加入经预处理后的65份大孔吸附树脂，继续在115-120℃保温混合30min，待自然冷却至室温后水洗三次，最后经所得树脂球体于60-65℃下真空干燥。

实施例4

将等量实施例1、实施例2、实施例3、对照例1和对照例2所制大孔吸附树脂用于等量且同批大豆异黄酮提取液的分离纯化，并设置等量市售大孔吸附树脂HP-20作为对照例3。

待分离纯化液的制备：将大豆异黄酮乙醇提取液冷藏48h后离心，并取上清液，上清液浓缩，再经冷藏24h后去脂，然后用5mol/L盐酸溶液调节pH值至中性，即得待分离纯化液；

大豆异黄酮的分离纯化：将大孔吸附树脂加等量水充分润湿后装入玻璃吸附柱中，然后将等量且同批待分离纯化液通过吸附柱，吸附完成后利用60％甲醇溶液冲洗大孔吸附树脂，直至流出溶液中大豆异黄酮的质量百分比低于0.5％，并将所得洗脱液经干燥后制成富含大豆异黄酮的粉末，测定大孔吸附树脂对大豆异黄酮的吸附量、解吸率和粉末中大豆异黄酮的纯度，测定结果如表1所示。

表1所制大孔吸附树脂的处理效果

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。