一种天锦章属植物组织培养的培养基及其方法

摘要

本发明涉及植物组织培养技术领域，特别涉及一种天锦章属植物组织培养的培养基及方法。本发明利用植物组织培养的方法，实现天锦章属植物的快速繁殖。该培养基包括初代培养基、继代培养基和壮苗培养基。采用本发明提供的培养基可显著提高天锦章属植物的繁殖系数，缩短了繁殖周期，为天锦章属植物的产业化生产提供了更加有效的途径。

说明书

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，尤其涉及一种天锦章属植物组织培养的培养基及方法。

背景技术

天锦章(Adromischus)为景天科(Crassulaceae)天锦章属多年生草本植物，原产南非的开普省和纳米比亚。植株矮小，短茎灰褐色。叶基本为长圆筒形，下部很长的一段几乎为圆柱形，上部稍宽、稍扁平，近卵圆形，叶长2.5～5厘米，宽1～2厘米，叶背面圆凸，正面较平，顶端叶缘有波浪形皱纹，表皮无毛，有光泽，叶色灰绿有暗紫色斑点。花序高25厘米，花筒圆柱形，长1厘米，上部绿色，下部紫色，花冠5裂，紫色，边缘白色。

天锦章属植物的繁殖主要靠叶插繁殖和砍头繁殖，这两种繁殖方式不仅繁殖速度慢，且成活率低。传统的繁殖方式难以满足市场庞大的需求。而组织培养技术作为一种快速繁殖方式，可实现工厂化育苗，从而满足市场日益增长的需求量。

组织培养技术是在无菌的条件下将活器官、组织或细胞置于培养基内，并放在适宜的环境中，进行连续培养而成的细胞、组织或个体。这种技术作为现代生物技术的重要领域之一，在农业生产领域和工厂化育苗方面应用广泛，对于植物优良种质资源保存、优良品种的快速繁殖等方面也发挥着重要的作用。但目前，针对天锦章属植物的组织培养技术还未有报道。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种天锦章属植物组织培养的培养基及方法，该培养基能够有效控制革叶卫矛组培苗的污染率，同时保证较高的成活率。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种天锦章属植物组织培养的培养基，包括初代培养基、继代培养基和壮苗培养基；

所述初代培养基为：含有1～1.5mg/L KT、0.05～0.1mg/L NAA、0.03～0.05mg/LTDZ、25～30g/L蔗糖、6～7g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.8～6.0；

所述继代培养基为：含有0.1～0.15mg/L KT、0.01～0.02mg/L TDZ、25～30g/L蔗糖、6～7g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.8～6.0；

所述壮苗培养基为：含有5～7g/L琼脂和15～25g/L蔗糖的MS培养基，pH值为5.8～6.0。

对于植物组织培养，培养基是其生长状态的最关键因素之一，现有天锦章属植物的组织培养由于对初代诱导分化、继代增殖以及生根三个阶段的培养基选择以及组合搭配不当，使得各阶段的愈伤诱导率、不定芽分化率、增殖系数和生根率都比较差，本发明选择特定的三个阶段的培养基组成了一个成体系的天锦章属植物快繁工艺，最终显著地提高了天锦章属植物的繁殖系数，缩短了繁殖周期，为天锦章属植物的产业化生产提供了更加有效的途径。

优选地，初代培养基为：含有1.5mg/L KT、0.1mg/LNAA、0.05mg/LTDZ、30g/L蔗糖、7g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.8～6.0；

继代培养基为：含有0.1mg/L KT、0.01mg/L TDZ、30g/L蔗糖、7g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.8～6.0；

壮苗培养基为：含有7g/L琼脂和25g/L蔗糖的MS培养基，pH值为5.8～6.0。

本发明还提供了一种天锦章属植物的组织培养方法，包括如下步骤：

步骤1：将天锦章属植物外植体接种到权利要求1或2所述培养基中的初代培养基先进行暗培养，得到愈伤组织；

步骤2：将愈伤组织转接到权利要求1或2所述培养基中的继代培养基进行继代培养，得到分化的小苗；

步骤3：将分化的小苗转接到权利要求1或2所述培养基中的壮苗培养基进行壮苗培养，得到组培苗。

优选地，步骤1中所述天锦章属植物外植体接种前还包括：采集天锦章属植物花苞未展开的花箭，去除苞片，进行消毒处理，然后切成3-5cm的花箭小段。

优选地，所述花箭的采收时间为5～6月，所述花箭的长度选取10-15cm。

在本发明提供的实施例中，消毒处理具体为：取所述花箭小段用NaClO溶液清洗，然后用氯化汞溶液消毒，再用水清洗。

作为优选，所述NaClO溶液的质量百分浓度为0.1％；氯化汞溶液的质量百分浓度为0.1％，消毒时间为5min；水清洗的次数为5-6次，每次浸泡时间≥3min。

作为优选，天锦章属植物组织培养中，暗培养的培养条件为：培养温度为24～26℃，相对湿度为45％～50％。

在本发明提供的实施例中，暗培养的培养条件为：培养温度为25℃，相对湿度为48％。

作为优选，天锦章属植物组织培养中，继代培养的培养条件为：光照周期为8～12h/d，光照强度为2500～3500lx，培养温度为24～26℃，相对湿度为45％～50％。

在本发明提供的具体实施例中，继代培养的培养条件为：光照周期为12h/d，光照强度为3500lx，培养温度为25℃，相对湿度为48％。

作为优选，天锦章属植物组织培养中，壮苗培养的培养条件为：光照周期为8～12h/d，光照强度为2500～3500lx，培养温度为24～26℃，相对湿度为45％～50％。

在本发明提供的具体实施例中，壮苗培养的培养条件为：光照周期为12h/d，光照强度为3500lx，培养温度为25℃，相对湿度为48％。

本发明以玛丽安(Adromischus marianae'antidorcadum')、马丁(Adromischusmarianae'Bryan Makin')、白安泽(Adromischus marianae 'Hallii')、红蛋(Adromischusmarianae'Van Rhynn's Pass)四种天锦章属植物的花箭为外植体材料，利用本发明提供的初代培养基、继代培养基和壮苗培养基，显著地提高了天锦章属植物的繁殖系数，缩短了繁殖周期，快速获得了玛丽安、马丁、白安泽、红蛋四种天锦章属植物的无菌苗，建立了稳定、高效的组培快繁体系，为天锦章属植物的产业化生产提供了更加有效的途径。

具体实施方式

本发明公开了一种天锦章属植物组织培养的培养基及方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

对所公开的实施例的说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

下面结合实施例，以玛丽安(Adromischus marianae'antidorcadum')、马丁(Adromischus marianae'Bryan Makin')、白安泽(Adromischus marianae 'Hallii')、红蛋(Adromischus marianae'Van Rhynn's Pass)天锦章属植物的组织培养为例，进一步阐述本发明：

实施例1玛丽安的植物组织培养

1、生长环境

(1)采用固体MS培养基，pH值为5.8，所配培养基经过高压高温蒸汽灭菌，126℃下5min。

(2)组培室，暗培养条件为：培养温度为25℃，相对湿度48％，每3d用紫外灯灭菌30min；

光培养条件为：光照时间12h/d，光照强度3500lx，培养温度为25℃，相对湿度48％，每3d用紫外灯灭菌30min。

2、外植体的处理

(1)在5月至6月之间，采集长度达到10-15cm，花苞未展开的玛丽安花箭作为外植体。

(2)采集完成后，先用镊子将苞片摘除(注意伤口不能太大)，苞片摘除后用手术刀将花箭底部切除，只留带花的部分。

(3)将花箭放入0.1％NaClO中用油画笔轻轻的刷干净。

(4)在超净工作台内用0.1％HgCl消毒5min。注：消毒液的使用次数不超过10次，达到后倒掉重新配置。HgCl要求避光保存，以免失效。

(5)消毒完成后，用无菌水冲洗5-6遍，每次浸泡时间要求长于3min。

(6)清洗完成后，在超净工作台内用手术刀和镊子把花箭截成3-5cm小段待用。

3、初代培养

(1)打开超净工作台紫外灯杀菌15min。

(2)接种前用75％的酒精喷洒消毒。

(3)在超净工作台内，将手术刀、镊子、接种盘用酒精灯充分消毒。

(4)将清洗好的花箭用手术刀切掉底部1-2mm，接种到分装好的MS+1.5mg/L KT+0.1mg/L NAA+0.05mg/L TDZ+30g/L蔗糖+7g/L琼脂培养基中。

(5)培养15d花箭诱导出愈伤组织，愈伤诱导率为87.6％。

4、继代培养

(1)选取前期已长出愈伤组织的外植体。

(2)在超净工作台内，用镊子小心将愈伤组织，转接到分装好的MS+0.1mg/L KT+0.01mg/L TDZ+30g/L蔗糖+7g/L琼脂培养基中。

(3)培养25d愈伤组织分化出小苗，繁殖系数为4.83。

5、壮苗培养基

(1)选取继代培养中已经分化好的小苗。

(2)在超净工作台内，用镊子小心夹出转接到分装好的不含激素的MS固体培养基中。

(3)30d后小苗长至3—4cm，可以出瓶炼苗。

实验结果显示：在初代培养中加入1.5mg/L KT、0.1mg/L NAA、0.05mg/L TDZ，15d花箭分化出愈伤组织，愈伤诱导率为87.6％。继代培养中加入0.1mg/L KT、0.01mg/L TDZ，25d愈伤组织分化出小苗，繁殖系数为4.83。

实施例2马丁的植物组织培养

1、生长环境

(1)采用固体MS培养基，pH值为5.8，所配培养基经过高压高温蒸汽灭菌，126℃下5min。

(2)组培室，组培室，暗培养条件为：培养温度为25℃，相对湿度48％，每3d用紫外灯灭菌30min；

光培养条件为：光照时间12h/d，光照强度3500lx，培养温度为25℃，相对湿度48％，每3d用紫外灯灭菌30min。

2、外植体的处理

(1)在5月至6月之间，采集长度达到10-15cm，花苞未展开的马丁花箭作为外植体。

(2)采集完成后，先用镊子将苞片摘除(注意伤口不能太大)，苞片摘除后用手术刀将花箭底部切除，只留带花的部分。

(3)花箭放入0.1％NaClO中用油画笔轻轻的刷干净。

(4)在超净工作台内用0.1％HgCl消毒5min。注：消毒液的使用次数不超过10次，达到后倒掉重新配置。氯化汞要求避光保存，以免失效。

(5)消毒完成后，用无菌水冲洗5-6遍，每次浸泡时间要求长于3min。

(6)清洗完成后，在超净工作台内用手术刀和镊子把花箭截成3-5cm小段待用。

3、初代培养

(1)打开超净工作台紫外灯杀菌15min。

(2)接种前用75％的酒精喷洒消毒。

(3)在超净工作台内，将手术刀、镊子、接种盘用酒精灯充分消毒。

(4)将清洗好的花箭用手术刀切掉底部1-2mm，接种到分装好的MS+1.5mg/L KT+0.1mg/L NAA+0.05mg/L TDZ+30g/L蔗糖+7g/L琼脂培养基中。

(5)培养15d花箭诱导出愈伤组织，愈伤诱导率为83.4％。

4、继代培养

(1)选取前期已长出愈伤组织的外植体。

(2)在超净工作台内，用镊子小心将愈伤组织，转接到分装好的MS+0.1mg/L KT+0.01mg/L TDZ+30g/L蔗糖+7g/L琼脂培养基中。

(3)培养25d愈伤组织分化出小苗，繁殖系数为4.62。

5、壮苗培养基

(1)选取继代培养中已经分化好的小苗。

(2)在超净工作台内，用镊子小心夹出转接到分装好的不含激素的MS固体培养基中。

(3)35d后小苗长至3—4cm，可以出瓶炼苗。

实验结果显示：在初代培养中加入1.3mg/L KT、0.05mg/L NAA、0.06mg/L TDZ，15d花箭分化出愈伤组织，愈伤诱导率为83.4％。在继代培养中加入0.15mg/L KT、0.01mg/LTDZ，25d愈伤组织分化出小苗，愈伤组织分化出小苗，繁殖系数为4.62。

实施例3白安泽的植物组织培养

1、生长环境

(1)采用固体MS培养基，pH值为5.8，所配培养基经过高压高温蒸汽灭菌，126℃下5min。

(2)组培室，组培室，暗培养条件为：培养温度为25℃，相对湿度48％，每3d用紫外灯灭菌30min；

光培养条件为：光照时间12h/d，光照强度3500lx，培养温度为25℃，相对湿度48％，每3d用紫外灯灭菌30min。

2、外植体的处理

(1)在5月至6月之间，采集长度达到10-15cm，花苞未展开的白安泽花箭作为外植体。

(2)采集完成后，先用镊子将苞片摘除(注意伤口不能太大)，苞片摘除后用手术刀将花箭底部切除，只留带花的部分。

(3)花箭放入0.1％NaClO中用油画笔轻轻的刷干净。

(4)在超净工作台内用0.1％HgCl消毒5min。注：消毒液的使用次数不超过10次，达到后倒掉重新配置。氯化汞要求避光保存，以免失效。

(5)消毒完成后，用无菌水冲洗5-6遍，每次浸泡时间要求长于3min。

(6)清洗完成后，在超净工作台内用手术刀和镊子把花箭截成3-5cm小段待用。

3、初代培养

(1)打开超净工作台紫外灯杀菌15min。

(2)接种前用75％的酒精喷洒消毒。

(3)在超净工作台内，将手术刀、镊子、接种盘用酒精灯充分消毒。

(4)将清洗好的花箭用手术刀切掉底部1-2mm，接种到分装好的MS+1.5mg/L KT+0.1mg/L NAA+0.05mg/L TDZ+30g/L蔗糖+7g/L琼脂培养基中。

(5)培养15d花箭诱导出愈伤组织，愈伤诱导率为86.5％。

4、继代培养

(1)选取前期已长出愈伤组织的外植体。

(2)在超净工作台内，用镊子小心将愈伤组织，转接到分装好的MS+0.1mg/L KT+0.01mg/L TDZ+30g/L蔗糖+7g/L琼脂培养基中。

(3)培养25d愈伤组织分化出小苗，繁殖系数为4.67。

5、壮苗培养基

(1)选取继代培养中已经分化好的小苗。

(2)在超净工作台内，用镊子小心夹出转接到分装好的不含激素的MS固体培养基中。

(3)35d后小苗长至3—4cm，可以出瓶炼苗。

实验结果显示：在初代培养中加入1mg/L KT、0.05mg/L NAA、0.03mg/L TDZ，25d花箭分化出愈伤组织，愈伤诱导率为86.5％。在继代培养中加入0.12mg/L KT、0.02mg/L TDZ，25d愈伤组织分化出小苗，愈伤组织分化出小苗，繁殖系数为4.67。

实施例4红蛋的植物组织培养

1、生长环境

(1)采用固体MS培养基，pH值为5.8，所配培养基经过高压高温蒸汽灭菌，126℃下5min。

(2)组培室，组培室，暗培养条件为：培养温度为25℃，相对湿度48％，每3d用紫外灯灭菌30min；

光培养条件为：光照时间12h/d，光照强度3500lx，培养温度为25℃，相对湿度48％，每3d用紫外灯灭菌30min。

2、外植体的处理

(1)在5月至6月之间，采集长度达到10-15cm，花苞未展开的红蛋花箭作为外植体。

(2)采集完成后，先用镊子将苞片摘除(注意伤口不能太大)，苞片摘除后用手术刀将花箭底部切除，只留带花的部分。

(3)花箭放入0.1％NaClO中用油画笔轻轻的刷干净。

(4)在超净工作台内用0.1％HgCl消毒5min。注：消毒液的使用次数不超过10次，达到后倒掉重新配置。氯化汞要求避光保存，以免失效。

(5)消毒完成后，用无菌水冲洗5-6遍，每次浸泡时间要求长于3min。

(6)清洗完成后，在超净工作台内用手术刀和镊子把花箭截成3-5cm小段待用。

3、初代培养

(1)打开超净工作台紫外灯杀菌15min。

(2)接种前用75％的酒精喷洒消毒。

(3)在超净工作台内，将手术刀、镊子、接种盘用酒精灯充分消毒。

(4)将清洗好的花箭用手术刀切掉底部1-2mm，接种到分装好的MS+1.5mg/L KT+0.1mg/L NAA+0.05mg/L TDZ+30g/L蔗糖+7g/L琼脂培养基中。

(5)培养15d花箭诱导出愈伤组织，愈伤诱导率为84.8％。

4、继代培养

(1)选取前期已长出愈伤组织的外植体。

(2)在超净工作台内，用镊子小心将愈伤组织，转接到分装好的MS+0.1mg/L KT+0.01mg/L TDZ+30g/L蔗糖+7g/L琼脂培养基中。

(3)培养25d愈伤组织分化出小苗，繁殖系数为4.57。

5、壮苗培养基

(1)选取继代培养中已经分化好的小苗。

(2)在超净工作台内，用镊子小心夹出转接到分装好的不含激素的MS固体培养基中。

(3)35d后小苗长至3—4cm，可以出瓶炼苗。

实验结果显示：在初代培养中加入1.3mg/L KT、0.05mg/L NAA、0.06mg/L TDZ，25d花箭分化出愈伤组织，愈伤诱导率为84.8％。在继代培养中加入0.15mg/L KT、0.01mg/LTDZ，25d愈伤组织分化出小苗，愈伤组织分化出小苗，繁殖系数为4.57。

试验例1

以玛丽安植物为例，本发明是通过以下培养基配方筛选出最适合初代培养的激素组合，具体操作如表1：

表1初代培养基筛选的处理

组分CK处理1处理2处理3KT(mg/L)011.51.3NAA(mg/L)00.050.10.06TDZ(mg/L)00.030.050.05

说明：其中，对照CK和4个处理的基本培养基为MS培养基；对照CK为不添加激素KT、NAA和TDZ。

试验结果见表2：

表2初代培养各处理的愈伤诱导情况

由以上试验结果可知，处理1～3的培养基中，外植体均能分化出愈伤组织，其中，处理2的愈伤诱导率最高，达87.6％。表明处理2的培养基：MS+1.5mg/L KT+0.1mg/L NAA+0.05mg/L TDZ+25-30g/L蔗糖+6-7g/L琼脂，为玛丽安最适合的初代培养基。

本发明是通过以下培养基配方筛选出最适合继代培养的激素组合，具体操作如表3：

表3继代培养基筛选的处理

组分CK处理1处理2处理3KT(mg/L)00.120.10.15TDZ(mg/L)00.020.010.01

说明：其中，对照CK和4个处理的基本培养基为MS培养基；对照CK为为不添加激素KT和TDZ。

试验结果见表4：

表4继代培养各处理的生长情况及增殖系数结果

由以上试验结果可知，采用处理3和处理2的培养基，愈伤组织均能够分化出不定芽成小苗，其中，采用处理2的培养基(MS+0.1mg/L KT+0.01mg/L TDZ+30g/L蔗糖+7g/L琼脂)愈伤组织能够分化形成大量小苗，为玛丽安最适合的继代培养基。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。