一种聚乙二醇‑藤黄酸脂质体和制备方法及其在治疗恶性肿瘤中的应用

摘要

本发明公开了一种聚乙二醇‑藤黄酸脂质体，该脂质体由聚乙二醇‑藤黄酸共轭物、聚乙二醇、维生素E、胆固醇和磷脂组成，所述聚乙二醇‑藤黄酸共轭物、聚乙二醇、维生素E、胆固醇和磷脂的重量比为1‑10:0.5‑2:0.05‑0.2:1‑4:10‑30。本发明将两亲性聚合物PEG与抗肿瘤药物藤黄酸用酯键连接成共轭物两亲性的PEG‑GA，通过将PEG‑GA插入脂质体双分子层,构建纳米靶向药物递送系统，不仅能改善药物的水溶性，同时能增强药物的稳定性和抗肿瘤作用，降低药物在正常组织的蓄积,延长荷瘤小鼠的存活时间，改善其治疗功效和减少毒副作用。本发明同时提供了该脂质体的制备方法及其应用，所述脂质体可应用于治疗肺癌、卵巢癌、乳腺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤或脑瘤。

说明书

技术领域

本发明涉及药物制剂领域，特别涉及一种聚乙二醇-藤黄酸脂质体和制备方法及其在治疗恶性肿瘤中的应用。

背景技术

天然产物及其衍生物在人类健康与医药发展方面扮演着越来越重要的作用，藤黄（gamboge）：为藤黄科植物藤黄树>Garcinia hanbaryi Hook. f.分泌的干燥树脂。其主产于柬埔寨、印度、泰国和越南，我国广东省和海南省均有栽培。祖国医学对其早有记载，藤黄性寒，味酸、辛、涩，有毒，具破血散结、解毒、止血、杀虫之功效，自古以来就被用于治疗瘰疬、痈疸、疖肿等顽疾。藤黄在国外常被用作利尿剂，治疗水肿和脑出血时的血压升高，现已收载于《美国药典》第10版。藤黄酸（Gambogic>）：是中药藤黄中提取的有效成分，为广谱抗肿瘤药物，对于多数肿瘤细胞都具有抑制作用，有研究表明藤黄酸对人肝癌细胞株SMMC-7721和QGY-7701的增殖有明显的剂量依赖性抑制作用，而对正常人肝组织细胞株L-02作用相对较弱。藤黄酸还可明显抑制人胃腺癌细胞株SGC-7901的增殖。藤黄酸抗肿瘤作用机制是多方面的，包括诱导肿瘤细胞凋亡、抑制细胞周期、影响癌基因和抑癌基因及其相关蛋白的表达等，此外藤黄酸还具有抑制肿瘤细胞转移的功能，这些是目前化疗药物所不能同时具备的。

藤黄酸溶解度差，生物利用度低，半衰期短（犬体内T_1/2＜1h，大鼠体内T_1/2＜20min），同时游离的藤黄酸具有一定的血管刺激、消化道副作用等毒性，在临床试用时容易引发给药部位的静脉炎，在动物实验中也表现了一定的致死毒性或使动物出现竖毛、体重减轻等，大大限制了藤黄酸的应用，在一定程度上也限制了藤黄酸更出色的治疗效果。故有必要对藤黄酸开展结构修饰或新剂型的研究。目前临床使用的藤黄酸常以注射剂为主，由于藤黄酸水溶性很差，现有报道的藤黄酸原料主要是使用硼砂溶液溶解配制的，该方法稳定性差，临床使用不安全。为增强藤黄酸的片剂、胶囊剂、口服液、颗粒剂以及注射剂等多种剂型开发的可行性，需要解决藤黄酸溶解度差这一问题。已有研究表明在藤黄酸原料药中加入>

前药在药物的开发过程中起着重要的角色，其主要目的在于解决母体药物的水溶性问题、延长半衰期、降低药物毒性以及提高药物效果。制备前药的重要手段之一为将化合物与水溶性聚乙二醇（PEG）连接，可大大增加化合物的水溶性，从而引起药物在理化性质、药代动力学及药效学方面的变化。目前采用PEG化成功开发出前药的产品有PEG-紫杉醇、PEG-喜树碱等，PEG化后的前药水溶性大大增加、半衰期延长、毒性降低，活性也有所增加。近年来各种纳米载体包括脂质体，纳米粒及胶束等可以改善化疗药物的溶解性，延长其在体内的半衰期，减少正常细胞对药物的吸收，增加药物在肿瘤细胞中的蓄积, 从而达到最大的抗肿瘤疗效和最小的毒副作用。脂质体由于主要成分为磷脂，因而具有高度的生物相容性和较低的生物毒性，能够装载亲水性和疏水性的药物。此外，脂质体强大的优点之一是它的特定用途，如可以通过改变脂质成分或增加功能性的成分来实现长循环或者靶向功能。在过去的几十年中，化疗药物的脂质体剂型在体外实验中取得了显著的成功。本专利的目标主要是将GA先制备成PEG-GA达到增溶的目的，延长药物的半衰期和增强抗肿瘤效果，再将PEG-GA与磷脂分子等组合，利用纳米技术制备载药脂质体，达到增强药物溶解性、增强药物疗效和降低药物毒副作用的目的。

发明内容

本发明的目的在于克服现有藤黄酸剂型中所存在的抗肿瘤活性差、血液循环时间短、制剂稳定性差和毒副作用大等上述不足，提供一种聚乙二醇-藤黄酸脂质体，该脂质体具有优异的水溶性，能够增强药物的稳定性和抗肿瘤作用，大幅降低药物的毒副作用，延长荷瘤小鼠的生存期。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种聚乙二醇-藤黄酸脂质体，该脂质体由聚乙二醇-藤黄酸共轭物、聚乙二醇、维生素E、胆固醇和磷脂组成，所述聚乙二醇-藤黄酸共轭物、聚乙二醇、维生素E、胆固醇和磷脂的重量比为1-10:0.5-2:0.05-0.2:1-4:10-30。

申请人经大量研究和实验发现，将聚乙二醇（PEG）与抗肿瘤药物藤黄酸结合成两亲性共轭物即PEG-GA，通过将PEG-GA插入脂质体双分子层, 构建纳米靶向药物递送系统，不仅能改善药物的水溶性，同时能增强药物的稳定性和抗肿瘤作用。黑色素瘤和结肠癌移植瘤模型小鼠体内抗肿瘤试验结果显示， 聚乙二醇-藤黄酸脂质体有明显的肿瘤生长抑制作用，其抑瘤率高于藤黄酸注射液组；毒性评价实验过程中，模型小鼠均能耐受预定剂量的聚乙二醇-藤黄酸脂质体，未表现出明显的毛发、行为、进食异常等，治疗期间小鼠体重正常增长，证实聚乙二醇-藤黄酸脂质体降低了药物的毒性。在B16抑制瘤模型和C26模型的治疗过程中，生存期实验数据显示，采用聚乙二醇-藤黄酸脂质体进行治疗后，模型小鼠与其他组相比100%存活的生存期明显延长。且聚乙二醇-藤黄酸脂质体组跟生理盐水组情况一样，注射部位的尾静脉和尾部组织一直都未见异常。因此进一步说明了聚乙二醇-藤黄酸脂质体提高了药物的抗癌活性，同时降低了药物的毒副作用。

藤黄酸的英文名：Gambogic>；化学名称：1,5-亚甲基-1H，3H，11H-呋喃并（3,4-g）吡喃并（3,2-b）呫吨-1-巴豆酸，3a，4,5,7-四氢-8-羟基-α，3,3,11-四甲基-13-（3-甲基-2-丁烯基）-11-（4-甲基-3-戊烯基）-7,15-二氧代，分子量：628.7512，分子式：C₃₈H₄₄O₈

其中聚乙二醇-藤黄酸共轭物（PEG-GA）的结构如下式所示：

优选地，聚乙二醇-藤黄酸共轭物、聚乙二醇、维生素E、胆固醇和磷脂的重量比为2:1:0.2:4:15。

通过进一步优选脂质体原料的配伍比例，本发明的聚乙二醇-藤黄酸脂质体水溶性、稳定性和抗肿瘤活性得到进一步优化。

优选地，聚乙二醇-藤黄酸共轭物由甲氧基聚乙二醇一端的羟基和藤黄酸C-30位羧基通过酯键连接形成。

优选地，甲氧基聚乙二醇包括甲氧基聚乙二醇1000、甲氧基聚乙二醇2000、甲氧基聚乙二醇4000、甲氧基聚乙二醇6000和甲氧基聚乙二醇8000中的一种或几种。

优选地，磷脂包括大豆磷脂、二月桂酰卵磷脂、二肉豆蔻酰卵磷脂、二棕榈酰卵磷脂、二硬脂酰卵磷脂、二硬脂酰卵磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化豆磷脂、二油酰基卵磷脂、二月桂酰磷脂酰甘油、二棕榈脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油和二肉豆蔻酰磷脂酸中的一种或几种。

本发明的另一目的在于提供上述聚乙二醇-藤黄酸脂质体的制备方法，一种聚乙二醇-藤黄酸脂质体的制备方法，包括以下步骤：

S1将聚乙二醇-藤黄酸共轭物、聚乙二醇、维生素E、胆固醇和磷脂溶解于乙醇中形成有机相，加热至40-60℃；

S2将上述有机相通过针管泵注入水相中形成含醇脂质体溶液，将该含醇脂质体溶液用旋转蒸发仪在40-60℃下减压除去乙醇，得到脂质体初溶液；

S3将上述脂质体初溶液用高压均质机进行整粒；随后用挤出器和0.1-0.45μm孔径的滤膜对脂质体初溶液进行挤出过滤，得到脂质体溶液；

S4 向上述脂质体溶液中加入冻干保护剂，然后进行真空冷冻干燥，即得聚乙二醇-藤黄酸脂质体。

优选地，步骤S2中有机相与水相的体积比为1:1-1:5。

优选地，步骤S3中整粒过程包括将脂质体初溶液分两次进高压均质机处理，第一次压力为100-300bar，第二次压力为700-900 bar。

优选地，步骤S4中冻干保护剂为海藻糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、脯氨酸和甘氨酸中的一种或几种。

优选地，步骤S4中真空冷冻干燥过程的预冻温度和升华干燥温度低于-30℃，解析干燥终点温度为20-30℃。

优选地，步骤S3中将脂质体溶液进行挤出过滤时，第一次使用0.45μm孔径的滤膜，第二次使用0.22μm孔径的滤膜。

本发明的再一目的在于提供上述聚乙二醇-藤黄酸脂质体的应用，所述脂质体可应用于治疗肺癌、卵巢癌、乳腺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤或脑瘤。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

1、本发明将亲水性的聚乙二醇PEG与疏水的抗肿瘤药物藤黄酸结合成两亲性聚合物，再与磷脂等组合成脂质体药物递送系统，提高了藤黄酸的水溶性，使药物更适合于静脉注射，提高了药物的生物利用度。

2、本发明将亲水性的聚乙二醇PEG与疏水的抗肿瘤药物藤黄酸结合成两亲性聚合物，再与磷脂等组合成脂质体药物递送系统，延缓了药物的释放，增强了药物的稳定性并有望降低药物的急性毒性。

3、本发明将亲水性的聚乙二醇PEG与疏水的抗肿瘤药物藤黄酸结合成两亲性聚合物，搭载脂质体给药系统，在于脂质体高度的生物形容性和对肿瘤的被动靶向性，有望提高在肿瘤部位的药物浓度，降低在正常组织的药物蓄积，从而延长肿瘤患者的生存期，改善治疗功效和减少毒副作用。

附图说明

图1为本发明实施例制备的PEG-GA脂质体制剂外观图、粒径分布图及透射电镜图。

图2为本发明实施例制备的PEG-GA脂质体制剂、PEG-GA组、GA组和空白脂质体组对小鼠体重的影响以及对小鼠生存期的影响。

图3为本发明实施例制备的PEG-GA脂质体组、PEG-GA组、GA组和空白脂质体组对荷瘤小鼠体内的B16-F10和C26肿瘤生长抑制曲线和抑瘤率。

图4为本发明实施例制备的PEG-GA脂质体制剂、PEG-GA组、GA组和空白脂质体组对小鼠尾部静脉注射的刺激情况。

图5为本发明实施例制备的PEG-GA脂质体制剂组，PEG-GA组和GA组的体外释放率曲线。

具体实施方式

下面结合试验例及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1 一种聚乙二醇-藤黄酸脂质体，由重量比为2:1:0.2:4:15的聚乙二醇-藤黄酸共轭物、聚乙二醇、维生素E、胆固醇和蛋黄卵磷脂组成

首先制备聚乙二醇-藤黄酸共轭物，包括先将甲氧基聚乙二醇2000（mPEG₂₀₀₀）的端基氧化，合成mPEG₂₀₀₀-COOH；第二步使mPEG₂₀₀₀-COOH一端的羟基与藤黄酸C-30位羧基在EDA和DMAP的作用下发生酯化反应，生成聚乙二醇-藤黄酸共轭物PEG₂₀₀₀-GA备用。

其次制备聚乙二醇-藤黄酸脂质体，包括以下步骤：

S1将配方量的PEG-GA，聚乙二醇、维生素E、胆固醇和蛋黄卵磷脂溶解于乙醇中形成有机相，加热至45℃；

S2将上述有机相通过针管泵注入水相中形成含醇脂质体溶液，其中有机相与水相的重量比为1：3，将该含醇脂质体溶液用旋转蒸发仪在45℃下减压除去乙醇，得到脂质体初溶液；

S3将上述脂质体初溶液分两次进高压均质机整粒处理，第一次压力为200bar，第二次压力为800bar；然后再对脂质体初溶液进行挤出过滤，第一次使用0.45μm孔径的滤膜，第二次使用0.22μm孔径的滤膜，得到脂质体溶液；

S4 最后，在上述脂质体溶液中加入10%甘露醇，然后进行真空冷冻干燥，其中预冻温度为-40℃，升华干燥干燥温度为-35℃，解析干燥终点温度为25℃，即得聚乙二醇-藤黄酸脂质体。

取0.4ml上述实施例1制备的聚乙二醇-藤黄酸脂质体于西林瓶中，加入1.6ml去离子水稀释五倍，得到有蓝色乳光的澄清溶液，用Malvern激光散射粒度分析仪测定粒径, 激光粒度分析结果显示其平均粒径为70±10nm，脂质体粒径分布较窄。粒径分布如图 1 所示。

将脂质体溶液滴加到大小适中的硅片上，室温干燥。在硅片样品表面镀金增强导电性,贴上导电胶后置于样品室，选择加速电压为3.0 kV，采用扫描电镜观察脂质体的表面形态。SEM 观察结果如图 1 所示，聚乙二醇-藤黄酸脂质体近似于球形，大小均一，表面光滑。

实施例2 一种聚乙二醇-藤黄酸脂质体，由重量比为1:2:0.2:4:10的聚乙二醇-藤黄酸共轭物、聚乙二醇、维生素E、胆固醇和大豆磷脂组成

首先制备聚乙二醇-藤黄酸共轭物，包括先将甲氧基聚乙二醇1000（mPEG₁₀₀₀）的端基氧化，合成mPEG₁₀₀₀-COOH；第二步使mPEG₁₀₀₀-COOH一端的羟基与藤黄酸C-30位羧基在EDA和DMAP的作用下发生酯化反应，生成聚乙二醇-藤黄酸共轭物PEG_1000-GA备用。

聚乙二醇-藤黄酸脂质体的制备方法，包括以下步骤：

S1将配方量的GA- mPEG₁₀₀₀、聚乙二醇、维生素E、胆固醇和磷脂溶解于乙醇中形成有机相，加热至40℃；

S2将上述有机相通过针管泵注入水相中形成含醇脂质体溶液，其中有机相与水相的重量比1:1，将该含醇脂质体溶液用旋转蒸发仪在50℃下减压除去乙醇，得到脂质体初溶液；

S3将上述脂质体初溶液分两次进高压均质机整粒处理，第一次压力为100bar，第二次压力为900bar；然后再对脂质体初溶液进行挤出过滤，第一次使用0.45μm孔径的滤膜，第二次使用0.22μm孔径的滤膜，得到脂质体溶液；

S4 最后，在上述脂质体溶液中加入5%质量分数的海藻糖，然后进行真空冷冻干燥，其中预冻温度为-38℃，升华干燥干燥温度为-32℃，解析干燥终点温度为24℃，即得聚乙二醇-藤黄酸脂质体。

实施例3 一种聚乙二醇-藤黄酸脂质体，由重量比为10:0.5:0.05:1:30的聚乙二醇-藤黄酸共轭物、聚乙二醇、维生素E、胆固醇和二硬脂酰磷脂酰甘油组成

首先制备聚乙二醇-藤黄酸共轭物，包括先将甲氧基聚乙二醇8000（mPEG₈₀₀₀）的端基氧化，合成mPEG₈₀₀₀-COOH；第二步使mPEG₈₀₀₀-COOH一端的羟基与藤黄酸C-30位羧基在EDA和DMAP的作用下发生酯化反应，生成聚乙二醇-藤黄酸共轭物PEG₈₀₀₀-GA。

其次制备聚乙二醇-藤黄酸脂质体，包括以下步骤：

S1将配方量的PEG-GA₈₀₀₀，聚乙二醇、维生素E、胆固醇和二硬脂酰磷脂酰甘油溶解于乙醇中形成有机相，加热至50℃；

S2将上述有机相通过针管泵注入水相中形成含醇脂质体溶液，其中有机相与水相的重量比为1:5，将该含醇脂质体溶液用旋转蒸发仪在40℃下减压除去乙醇，得到脂质体初溶液；

S3将上述脂质体初溶液分两次进高压均质机整粒处理，第一次压力为300bar，第二次压力为700bar；然后再对脂质体初溶液进行挤出过滤，第一次使用0.45μm孔径的滤膜，第二次使用0.22μm孔径的滤膜，得到脂质体溶液。

S4 最后，在上述脂质体溶液中加入15%质量分数的麦芽糖，然后进行真空冷冻干燥，其中预冻温度为-37℃，升华干燥干燥温度为-31℃，解析干燥终点温度为22℃，即得聚乙二醇-藤黄酸脂质体。

试验例1 聚乙二醇-藤黄酸脂质体的体外细胞毒性试验

本试验例采用MTT法来检测聚乙二醇-藤黄酸脂质体的体外抗肿瘤活性，试验肿瘤细胞株包括小鼠皮肤黑色素瘤细胞B16-F10、小鼠结肠癌细胞C26和人脐静脉内皮细胞HUVEC。以B16-F10细胞株为例介绍MTT法的流程和方法。

将B16-F10细胞悬液接种于96孔培养板中,每孔100μL、4500个细胞，常规条件下培养过夜，此后，给予每孔细胞100μL配制好的不同浓度的PEG-GA脂质体制剂、PEG-GA溶液或对应不同浓度的GA针剂，对照组加入等量的培养基作为对照。培养48h，在结束培养前4h，加入MTT 20μL，继续培养4h。最后彻底弃去培养上清液，每孔加入150μL DMSO。37℃下摇床低速晃动10min，使结晶物充分溶解。在酶标仪上，设定 570nm波长下检测每孔细胞的吸光度A₅₇₀值,>570值／对照组A₅₇₀值×100%。以同一样品的不同浓度对肿瘤细胞生长抑制率作图可得到剂量反应曲线如附图3所示，从中求出样品的半数杀伤浓度>50，结果如下表1所示：

Table 1 The>50（µM）of>

黑色素瘤和结肠癌移植瘤模型小鼠体内抗肿瘤试验结果显示， 聚乙二醇-藤黄酸脂质体有明显的肿瘤生长抑制作用，其抑瘤率高于藤黄酸注射液组。

试验例2 实施例PEG-GA脂质体制剂、PEG-GA组、GA组和空白脂质体组对小鼠体重的影响及对小鼠生存期的影响

以6-8周龄的（体重约20g）的ICR小白鼠为动物模型，随机取24只大鼠，设置3组，每组8只，雌雄各半：空白对照组尾部静脉注射生理盐水，试验组尾部注射PEG-GA脂质体制剂、PEG-GA组、GA针剂以及空白脂质体组，剂量为7.5mg/kg。观察7天，主要观察指标包括：体重、饮食、行为活动，是否有分泌物、排泄物、死亡情况及中毒反应，分泌物与排泄物是否正常，中毒反应的症状、严重程度、起始时间、持续时间、是否可逆，是否出现小鼠死亡，对于濒死或者死亡动物的解剖观察等。其中尾部静脉注射后的刺激情况如图4所示，小鼠体重变化及小鼠生存情况见图2所示。

可以看出毒性评价实验过程中，模型小鼠均能耐受预定剂量的聚乙二醇-藤黄酸脂质体，未表现出明显的毛发、行为、进食异常等，治疗期间小鼠体重正常增长，证实聚乙二醇-藤黄酸脂质体降低了药物的毒性。在B16抑制瘤模型和C26模型的治疗过程中，生存期实验数据显示，采用聚乙二醇-藤黄酸脂质体进行治疗后，模型小鼠与其他组相比100%存活的生存期明显延长。且聚乙二醇-藤黄酸脂质体组跟生理盐水组情况一样，注射部位的尾静脉和尾部组织一直都未见异常。因此进一步说明了聚乙二醇-藤黄酸脂质体提高了药物的抗癌活性，同时降低了药物的毒副作用。

试验例3 实施例制备的PEG-GA脂质体制剂组，PEG-GA和GA组的体外释放率试验

采用透析法研究脂质体体外释放情况，用NaHCO₃和>

脂质体溶液制备：在质量浓度为1mg/mL的PEG-GA脂质体中加入超纯水配制成样品溶液，在上述条件下测定其释放率。 对照品溶液制备：对照样品采用加有助溶剂L-精氨酸的超纯水配制成1mg/ml藤黄酸溶液，并在与脂质体相同条件下测定其释放率。

聚乙二醇-藤黄酸脂质体与藤黄酸原料药在PBS中释放如图 5 所示，聚乙二醇-藤黄酸脂质体48h累积释放率大于50%，4h累积释放率约为30%，与原料药相比释放更平缓。

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