人髓过氧化物酶活性及总量检测试剂盒及检测方法和制备方法

摘要

本发明公开一种人髓过氧化物酶活性及总量检测试剂盒和相应的检测方法、制备方法，所述检测试剂盒包括有固相载体、酶分解底物、缓冲液、酶标抗体试剂、校准品、洗涤液、显色底物和终止液，其中：所述固相载体包被有200～400ng/孔的抗‑MPO非抑制性抗体；所述酶分解底物包括有0.1‑50mmol/L的H

说明书

技术领域

本发明涉及体外诊断领域，尤其涉及一种人髓过氧化物酶活性及总量检测试剂盒和相应的人髓过氧化物酶活性及总量检测方法、制备方法。

背景技术

人髓过氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)又称过氧化物酶，是一种重要的含铁溶酶体，存在于髓系细胞(主要是中性粒细胞和单核细胞)的嗜苯胺蓝颗粒中，是髓细胞的特异性标志，是人体免疫系统的一个重要组成部分。在某些炎症发生的时候，MPO被激活的中性粒细胞和单核细胞释放，可以将过氧化氢和氯离子转化为一种可以杀灭微生物的强氧化剂次氯酸(HClO)，以杀灭病原物。

国内外的医学研究表明，血液中MPO浓度的升高与不稳定型的动脉粥样斑块的形成密切相关。在因胸痛而就医的病人中，血液中MPO浓度的升高表明心血管疾病发生的风险增大。当血液中MPO的浓度高于2990pM时，60％的病人在未来一个月内发生了重大心脏不良事件(心梗、猝死、或紧急进行冠状动脉搭桥/支架安放手术)。由于血液中MPO水平的升高在心血管疾病发生之前就可以检测到，使MPO可以作为心血管疾病的预警指标，其预警的灵敏度和准确性要大大优于其他指标如超敏C反应蛋白(hs-CRP)和心肌肌钙蛋白T(cTnT)。

冠心病是心血管系统中最常见的疾病，而动脉粥样硬化(AS)又是形成冠心病的重要病理基础。研究发现，MPO缺陷的个体罹患心血管疾病的危险性明显下降。MPO水平的升高不仅与患冠状动脉疾病易感性相关，还可以预测早期患心肌梗死的危险性。MPO水平已被公认为有助于评定急性ST段抬高的心肌梗塞患者的预后。MPO水平对于急性冠脉综合征(ACS)危险性评估及初步诊断，是一个很好的指标，MPO的检测意味着在更早的阶段发现并及时干预冠心病，可以作为新的预测心血管事件发生的标志物，尤其是针对不稳定型冠心病。因此开发出一种新的用于心脑血管疾病超前预测的检测试剂盒，能够提前预测患者病情，及时治疗，降低患病风险和患者死亡风险，减轻社会负担、减轻病人的痛苦，简化了治疗的流程，降低医生的工作强度，同时也能大大降低国家、医院以及患者个人的治疗费用支出，减轻社会负担，具有重要的、积极的社会意义。

在现有技术中，用酶联免疫法测定血液中MPO的含量，间接表明血液中MPO酶活性。这种方案的缺点是有时MPO含量与MPO活性并不相关，如MPO基因变异人群及血液中有MPO抑制物的人群等；直接测定血液MPO酶活性方法是直接加MPO酶底物到样本中，其中MPO分解合成反应底物，生成颜色反应产物，再测算出MPO酶活性。这种方案的缺点是测定样本中除了髓过氧化物酶以外，一般还有其他的过氧化物酶存在，对酶活性检测的结果有很大程度的干扰，大大地降低了样本中MPO酶活性的特异性。

发明内容

基于此，有必要提供一种新的人髓过氧化物酶检测方式，来解决MPO含量与MPO活性并不相关的问题，并去除样本中其他杂质的干扰，大大提高特异性和准确率、缩短测量时间、降低了试剂盒成本，且方便操作。

根据本发明的第一方面，本发明公开一种人髓过氧化物酶活性及总量检测试剂盒，包括有固相载体、酶分解底物、缓冲液、酶标抗体试剂、校准品、洗涤液、显色底物和终止液，其中：

所述固相载体包被有200～400ng/孔的抗-MPO非抑制性抗体；

所述酶分解底物包括有0.1-50mmol/L的H₂O₂；

所述酶标抗体试剂含有使用量为1:2000～1:8000的辣根过氧化物酶标记的抗-MPO抑制性抗体；

所述校准品包括有MPO抗原含量为0-1000ng/ml的多个校准品；

所述显色底物至少包括含有0.015-0.02％的过氧化物的显色底物A液和含有0.25-0.32g/L的TMB显色底物B液。

根据本发明的第二方面，本发明公开一种人髓过氧化物酶活性及总量检测方法，包括：

在酶标板的每孔中加入100ul抗-MPO非抑制性抗体(5ug/ml)和50mM碳酸盐缓冲液，调节pH值为9.6，在4℃条件下静止8-12小时后，去除缓冲液；

在酶标板的每孔中加入200μl封闭液，在4℃条件下封闭2小时后，去除封闭液；

在酶标板的每孔中加入80ul样品稀释液和20ul血清或血浆样品，在室温下反应30分钟后，去除稀释液；

加入200ul缓冲液和50ul酶分解底物，混合反应2分钟后，测定OD值；

绘制酶活性-OD值标准曲线，算得待测样品中MPO酶活性；

测定OD值后立即去除酶标板中的反应液，洗涤封闭；

加入酶标抗体试剂100μl，置37℃继续温育30分钟；

在酶标板的每孔中加入显色底物A液和显色底物B液各50μl混匀，37℃避光显色15分钟后，每孔加终止液50μl，混匀后10分钟内，测定校准品和待检样品的OD值；

以校准品抗原浓度为横坐标、校准品相应的OD值为纵坐标绘制标准曲线，并将待测样品OD值代入标准曲线中，算得待测样品中MPO浓度。

根据本发明的第二方面，本发明公开一种人髓过氧化物酶活性及总量检测试剂盒的制备方法，包括：

在包被液中按照包被量为200～400ng/孔加入抗-MPO非抑制性抗体，充分混匀后进行包被，包被完成后将酶标板置于2-8℃环境放置14～16个小时后取出，洗板机各洗板1次，拍干后，200μl/孔加入1中配制好封闭液，37℃温箱放置150±15分钟后取出，甩干并拍干，并干燥24-26个小时；

按照使用量1:2000～1:8000在酶标抗体稀释液中加入HRP标记抗体，充分混匀；

分别配置如上所述的校准品、洗涤液、显色底物和终止液。

本发明的有益效果是：

本发明的实施例通过采用酶法和ELISA共同检测的方法来测定样品中MPO的活性及总量，从而达到了在一个样本的一次检测过程中同时检测酶的活性和酶的总量，活性和总量结果的对比既能预防有时MPO含量与MPO活性并不相关的概率，又去除了样本中其他物质的干扰，大大提高了特异性和准确率、缩短了测量时间、降低了试剂盒成本，且操作方便的效果。并可为酶活抑制剂的研发提供依据，酶总量及酶活性结果同时检测更准确地反应了MPO在体内的情况，为临床诊断和预警动脉粥样硬化冠心病提供了更准确的依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明的人髓过氧化物酶活性及总量检测方法一个实施例中MPO的含量曲线示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明提供的人髓过氧化物酶活性及总量检测试剂盒的一个实施例；本实施例主要包括：

固相载体、酶分解底物、缓冲液、酶标抗体试剂、校准品、洗涤液、显色底物和终止液，其中：

所述固相载体包被有200～400ng/孔的抗-MPO非抑制性抗体；

所述酶分解底物包括有0.1-50mmol/L的H₂O₂；

所述酶标抗体试剂含有使用量为1:2000～1:8000的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗-MPO抑制性抗体；

所述校准品包括有MPO抗原含量为0-1000ng/ml的多个校准品；

所述显色底物至少包括含有0.015-0.02％的过氧化物的显色底物A液和含有0.25-0.32g/L的TMB显色底物B液；

所述终止液含有浓度不高于2mol/L的硫酸。

浓缩洗涤液(20×)：0.01M PBS，含不低于1.5％的表面活性剂；

在一个具体的实施方式中，所述固相载体可采用含有以下组分的包被液包被所述抗-MPO抗体：

Na₂CO₃：10.-2.1g/L；

NaHCO₃：2.5-3.5g/L；

在一个具体的实施方式中，所述缓冲液包括以下组分：

柠檬酸：6.0-10.0g/L；

柠檬酸钠：10.0-15.0g/L；

苯酚：0.5-1.5g/L；

BSA：0.1-2.0g/L；

在一个具体的实施方式中，所述酶分解底物溶液可包括有以下组分：

H₂O₂：0.2-10.0ml/L；

4-氨基安替吡啉(sigma)：1.0-10.0g/L；

BSA：0.1-5.0g/L。

在一个具体的实施方式中，所述固相载体可采用含有以下组分的封闭液封闭所述抗-MPO非抑制性抗体：

BSA：1.0-10.0g/L；

蔗糖：40.0-60.0g/L；

酪蛋白：1.0-10.0g/L；

明胶：1.0-10.0ml/L；

50mM TB 8.0：40.0-60.0ml/L；

Triton X-100：1.0-300ml/L；

Proclin300：0.5-2.0ml/L。

在一个具体的实施方式中，所述酶标抗体试剂可采用含有以下组分的稀释液：

BSA：1.0-20.0g/L；

蔗糖：20.0-80.0g/L；

酪蛋白：1.0-10.0g/L；

NBS：80.0-120.0ml/L；

明胶：1.0-10.0ml/L；

50mM TB 8.0：40.0-60.0ml/L；

Proclin300：0.5-1.5ml/L。

在一个具体的实施方式中，所述校准品可包括有人源MPO抗原含量分别为1000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、100ng/ml、50ng/ml和0ng/ml的至少一种校准品；且所述校准品采用含有以下组分的校准品稀释液：

Na₂HPO₄·12H₂O：40.0-65.0g/L；

NaH₂PO₄·2H₂O：5.0-10.0g/L；

NBS：150.0-250.0ml/L；

甘油：25.0-80.0ml/L；

Tween-20：0.1-2.0ml/L；

Proclin300：0.1-2.0ml/L。

在一个具体的实施方式中，所述显色底物A液可包括以下组分：

三水合乙酸钠：20.0-40.0g/L；

柠檬酸：2.0-5.0g/L；

30％H₂O₂：0.5-0.8ml/L；

所述显色底物B液可包括以下组分：

乙二胺四乙酸二钠：0.1-0.8g/L；

柠檬酸：1.0-3.0g/L；

甘油：50.0-150.0ml/L；

TMB：0.1-0.5g/L；

DMSO：1.0-10.0ml。

在一个具体的实施方式中，所述浓缩洗涤液(20×)可包括以下组分：

Na₂HPO₄·12H₂O：50.0-100.0g/L；

KH₂PO₄：2.0-8.0g/L；

NaCl：100.0-200.0g/L；

KCl：2.0-6.0g/L；

Tween-20：10.0-30.0ml/L。

在一个具体的实施方式中，所述固相载体可以采用酶标板或平底试管，或者其它用于包被的固相载体等。

下面参考图1详细描述采用本发明的试剂盒检测人血清或血浆中MPO的活性及含量的方法的一个实施例。含有EDTA、柠檬酸钠或肝素等抗凝剂的样品可用本试剂盒检测。

在酶标板的每孔中加入100ul抗-MPO非抑制性抗体(5ug/ml)和50mM碳酸盐缓冲液，调节pH值为9.6，在4℃条件下静止8-12小时后，去除缓冲液；

在酶标板的每孔中加入200μl封闭液，在4℃条件下封闭2小时后，去除封闭液；

在酶标板的每孔中加入80ul样品稀释液和20ul血清或血浆样品，在室温下反应30分钟后，去除稀释液；

加入200ul缓冲液和50ul酶分解底物，混合反应2分钟后，测定OD值；

绘制酶活性-OD值标准曲线，算得待测样品中MPO酶活性；

测定OD值后立即去除酶标板中的反应液，洗涤封闭。

加入酶标抗体试剂100μl，置37℃继续温育30分钟；

在酶标板的每孔中加入显色底物A液和显色底物B液各50μl混匀，37℃避光显色15分钟后，每孔加终止液50μl，混匀后10分钟内，测定校准品和待检样品的OD值；

以校准品抗原浓度为横坐标、校准品相应的OD值为纵坐标绘制标准曲线，并将待测样品OD值代入标准曲线中，算得待测样品中MPO浓度。

检测方法实例1

抗MPO非抑制性抗体(10ug/ml)与50mM(pH9.6)的碳酸盐缓冲液充分混匀，加100ul到酶标板每孔中，4℃，过夜；

用洗涤液洗涤一次，每孔加200μl封闭液，4℃封闭2小时；

甩干封闭液，洗涤一次；

加80ul样品稀释液和20ul血清或血浆样品到孔中混合液,在室温下,反应30分钟；

甩掉液体，用洗涤液洗涤二次；

加200ul缓冲液(柠檬酸钠缓冲液，10mmol/L苯酚)，再加50ul酶分解底物(H2O2 20mmol/L)，混合，室温放置，分别于1.5min、2min、3min

用波长505nm，测定OD值；

MPO酶活性检验结果计算：以校准品(0、50、100、250、500、1000ng/ml)抗原浓度为横坐标、校准品相应的OD值为纵坐标，可以采用四参数(4PL)或点对点的拟合方式绘制标准曲线，并将待测样品OD值代入标准曲线中，算得待测样品中MPO活性；

测定OD值后立即去除酶标板中的反应液，用洗涤液洗涤2次，封闭液封闭后再洗2次；

加入酶标抗体试剂100μl，置37℃继续温育30分钟；

用洗涤液洗涤3次；

显色：每孔加入显色底物A液和显色底物B液各50μl，轻轻振荡混匀，37℃避光显色15分钟。显色底物A液和显色底物B液可以按需求等量混合，然后每孔加入100μl底物混合液；

终止测定：每孔加终止液50μl，轻轻振荡混匀，10分钟内测定结果(此时蓝色立转黄色)，空白孔调零，450nm波长测量各孔吸光度(OD值)；

MPO酶总量检验结果计算：以校准品(0、50、100、250、500、1000ng/ml)抗原浓度为横坐标、校准品相应的OD值为纵坐标，可以采用四参数(4PL)或点对点的拟合方式绘制标准曲线，并将待测样品OD值代入标准曲线中，算得待测样品中MPO浓度。也可使用各种专业软件来进行计算。

如下所示：

如果一样品的OD值＝0.9671，代入标准曲线，算得MPO浓度≈212.82ng/ml。(此校准品OD值和标准曲线仅为示例说明，不具有实际定量作用；每次实验以校准品实际OD值为准)。

本发明的实施例采用比色及双抗体夹心酶联免疫法相结合的方法来测定样品中MPO的活性及总量。加入样品后，在固相载体上预包被的抗-MPO特异抗体可与样品中的MPO结合，MPO具有使过氧化氢还原的能力：MPO+H₂O₂→复合体；复合体+AH₂(供氢体)→H₂0+MPO+A产物。加入苯酚后生成有色化合物，在505nm处通过比色测定A产物的生成量。若样品中无MPO时，不显色。进一步加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗-MPO抗体进行温育。当样品中存在MPO时，将形成“包被抗体-抗原-酶标抗体”复合物，复合物上连接的HRP催化显色剂反应，生成蓝色产物，终止反应后变为黄色。若样品中无MPO时，不显色。显色深浅与样本中MPO的含量呈正比。下面详细描述本发明提供的人髓过氧化物酶定量检测试剂盒的制备方法的一个实施例。本实施例主要包括以下步骤：

在包被液中按照包被量为200～400ng/孔加入抗-MPO抗体，充分混匀后进行包被，包被完成后将酶标板置于2-8℃环境放置14～16个小时后取出，洗板机各洗板1次，拍干后，200μl/孔加入1中配制好封闭液，37℃温箱放置150±15分钟后取出，甩干并拍干，并干燥24-26个小时；

按照使用量1:2000～1:8000在酶标抗体稀释液中加入HRP标记抗体，充分混匀；

分别配置如权利要求1-7中任一项所述的校准品、洗涤液、显色底物和终止液。

制备方法实例1

包括MPO固相载体的制备、MPO酶标抗体试剂的制备、MPO校准品的制备，其余组分(包括显色底物A、显色底物B、终止液、浓缩洗涤液(20X))制备，主要过程如下：

一、MPO固相载体的制备

1、固相载体包被液、封闭液的配制：配方详见下表1和表2。

表1、包被液配方

原材料名称配制1000ml用量Na₂CO₃1.59gNaHCO₃2.93g

先加入900ml纯化水，待全部物体溶解后，调整pH值为9.6±0.1，再定容至1000ml。

表2、封闭液配方

原材料名称配制1000ml用量BSA10.0g蔗糖52.0g酪蛋白5.0g明胶5.0ml50mM TB 8.050mlTriton X-10010mlProclin3001.0ml

先加入800ml纯化水，待全部物体溶解后，再定容至1000ml。

2、酶标板的制备：

2.1包被：取1中配制好包被液，加入包被抗体(海肽生物科技(上海)有限公司生产；包被量在200～400ng/孔)，充分混匀后进行包被，包被完成后将酶标板(苏州康容生物医疗科技有限公司生产)置于2-8℃环境放置14～16个小时；

2.2封闭：将包被酶标板从2-8℃环境中取出，洗板机各洗板1次，拍干后，200μl/孔加入1中配制好封闭液，37℃温箱放置150±15分钟；

2.3干燥：将封闭好酶标板从温箱里取出，甩干并拍干，干燥房干燥24-26个小时；

二、MPO酶标抗体试剂的制备

1、酶标抗体稀释液的配制：配方详见表3

表3、酶标抗体稀释液配方

原材料名称配制1000ml用量BSA10.0g蔗糖52.0g酪蛋白5.0gNBS100ml明胶5ml50mM TB 8.050mlProclin3001ml

先加入800ml纯化水，待全部物体溶解后，再定容至1000ml。

2、酶标抗体试剂的配制：

2.1取1中配制好酶标抗体稀释液，加入HRP标记抗体(海肽生物科技(上海)有限公司；使用量1:2000～1:8000)，充分混匀；

三、MPO校准品的制备

其中，所述校准品具体包括有作为校准品稀释液的校准品1和含有MPO抗原的校准品2-6；目前MPO尚没有国家标准品或国际参考品，本实施例采用的是外购的人源MPO抗原，经美国Cleveland HeartLab生产的CardioMPO^TM酶联免疫试剂盒(Cat#7601)进行量值的溯源定值后，系列稀释作为试剂盒的校准品。

1、校准品稀释液的配制：配方详见表4

表4、校准品稀释液配方

先加入600ml纯化水，待全部物体溶解后，再定容至1000ml。

2、试剂盒校准品的制备：

2.1试剂盒校准品配制：根据人源MPO蛋白(ART)说明书和溯源赋值浓度，用1中配制好校准品稀释液分别配制成1000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、100ng/ml、50ng/ml和0ng/ml，作为试剂盒校准品；

四浓缩洗涤液(20x)的制备

浓缩洗涤液(20x)的配制：配方详见表5

表5、20X浓缩洗涤液配方

原材料名称配制1000ml用量Na₂HPO₄·12H₂O71.6gKH₂PO₄4.8gNaCl160gKCl4gTween-2020ml

先加入700ml纯化水，待全部物体溶解后，再定容至1000ml。

五、TMB显色底物的制备

TMB显色底物液包含A、B两种组份，分开配制，配方详见表6

表6、TMB显色底物A液、B液配方

显色底物A液配制：先加入800ml纯化水，待全部物体溶解后，再定容至1000ml。

显色底物B液配制：(1)先将称量好的TMB溶于DMSO中，完全溶解、混匀，待定容前加入；(2)先加入800ml纯化水，待全部物体溶解后，再加入步骤(1)中的TMB-DMSO溶液和甘油，定容至1000ml。

六终止液生产工艺

终止液的配制：配方详见表7

表7、终止液配方

原材料名称配制1000ml用量浓硫酸108ml

取800ml纯化水置于烧杯中，缓慢加入浓硫酸，最后定容为1000ml。

经过试验，采用本实施例的方法制备的试剂盒具有以下特性：

高值质控品P1测定浓度在600～800ng/ml之间；中值质控品P2测定浓度在200～400ng/ml之间；低值质控品P3测定浓度在70～150ng/ml之间。

精密度：批内变异系数≤10％，批间变异系数≤15％。

线性回归系数：在50ng/ml～1000ng/ml范围内R2≥0.980(r≥0.990)。

最低检测限不高于20ng/ml。

准确性：试剂盒校准品的实测值与标示值的比值应在0.850～1.150之间。

特异性分析：血红蛋白5mg/ml、甘油三酯10mg/ml、胆红素0.2mg/ml时、促红细胞生成素(EPO)50IU/ml时，用于本试剂盒的干扰实验检测，均无特异性反应，对试剂定量结果没有影响。

稳定性：在2～8℃可以稳定保存12个月。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。