一种黄单胞菌致病相关的基因的应用

摘要

本发明披露了一种黄单胞菌致病相关的基因hpaM在防治植物黄单胞菌病害上的应用，该基因的编号为XC_2847，且该基因被证实编码一个细胞膜蛋白。其中，植物黄单胞菌病害包括由十字花科黑腐病菌所导致的十字花科黑腐病、水稻白叶枯病菌所导致的水稻白叶枯病和水稻细条病菌所导致的水稻细条病中的一种或多种。

说明书

技术领域

本发明涉及植物病害的防治技术，尤其涉及一种黄单胞菌致病相关的基因在植物病害防治中的应用。

背景技术

植物病害一直是困扰农业生产的主要问题之一。植物病害主要由病毒、细菌、真菌和线虫引起。病原物对寄主作物的侵害使得农作物减产甚至绝收，造成严重的经济损失。据资料统计，全球每年因病害导致的作物减产高达20％。因此，研究开发对环境友善的植物病害防治方法是人们所关心的问题。对病原菌致病机理的深入了解，可为人们设计和发展植物病害防治新方法提供工作基础和思路，而鉴定和克隆植物病原物致病相关基因则是了解病原菌致病机理的基础。

植物病原细菌主要分布在以下8个菌属中：黄单胞菌属(Xanthomonas)、农杆菌属(Agrobacterium)、狄克氏菌属(Dickeya)、欧文氏菌属(Erwinia)、泛菌属(Pantoea)、果胶杆菌属(Pectobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)以及雷尔氏菌属(Ralstonia)。其中，黄单胞菌属细菌是一类重要的病原细菌。该属病原菌含有27个种120多个致病变型(pathovar)，能在约124种单子叶和268种双子叶植物上引起病害。

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris，简称Xcc；又称为十字花科黑腐病菌)是十字花科植物一种重要的病原菌，能在世界范围内尤其是热带和亚热带地区引起十字花科作物(如大白菜、甘蓝及花椰菜等)发生黑腐病，造成严重的经济损失。另外，十字花科黑腐病菌所产生的胞外多糖在商业上称为黄原胶，是仅次于抗生素和溶剂的第三大类发酵产 品。在农业生产上，水稻白叶枯病和细菌性条斑病(简称细条病)均是水稻严重的病害，可造成严重损失。这两种病害分别由水稻黄单胞菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo；又称水稻白叶枯病菌)和水稻黄单胞菌水稻细菌性条斑病致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola，Xoc；又称水稻细条病菌)所引起。

现代分子植物病理学的研究发现，在Xcc以及其它黄单胞菌属病原菌中，主要有DSF(也可称rpf)和III型分泌系统(也可称Hrp)两个致病系统调控病原菌的致病性。其中，DSF致病系统是一个群体感应系统，调控细胞致病生化因子胞外酶和胞外多糖的合成，并影响细胞的运动性、生物被膜的形成等；III型分泌系统的致病系统主要有一个由hrp基因编码产物组成的III型分泌系统及依赖于III型分泌系统的效应蛋白组成。编码III型分泌系统的hrp基因失活后，突变体表现为丧失对寄主植物的致病性和在非寄主植物诱导过敏反应的功能，以及在基本培养基菌体生长正常而在寄主植物内繁殖能力下降。III型分泌系统是近十多年来证实在动植物病原菌保守存在并对病原菌的致病性具有重要作用的一类全新的分泌系统。病原菌通过该系统将效应分子(毒性因子)运送至寄主细胞中，刺激或干扰寄主正常的细胞程序，使寄主表现感病或产生抗病反应。在黄单胞菌中，hrp基因簇由约包含有26个基因的6个操纵子所构成(hrpA--hrpF)，已知这些基因的表达受若干个基因(hrpS、hrpG、hrpX和hrcT等)的编码产物所调控。

近二十年来，越来越多的微生物全基因组序列完成了测序。在几乎所有已完成测序的物种的基因组中，尚约有三分之一的基因的功能是未知的。人们通常将这些功能未知的基因注释为编码一个“假定蛋白”。对这些基因功能的鉴定和研究是后基因组时代重要的工作。人们迫切想知道，这部分功能未知的基因，是否是有确定功能的基因；如果是则这些基因到底具有哪些具体的功能。而对于病原微生物来说，人们十分期望通过利用功能基因组学的研究方法和手段，来鉴定和研究新的致病相关基因，以深入揭示病原菌致病的机理，为人们开发 新的防治病害途径提供基础。

主要参考文献

Barber，C.E.，Tang，J.L.，Feng，J.X.，Pan，M.Q.，Wilson，T.J.，Slater，H.，Dow，J.M.，Williams，P.&Daniels，M.J.(1997).A novel regulatory system required forpathogenicity of Xanthomonas campestris is mediated by a small diffusiblesignal molecule.Mol Microbiol 24，555-566.

Bonas，U.，Schulete，R.，Fenselau，S.，Minsavage，G.V.，Staskawicz，B.J.&Stall，R.E.(1991).Isolation of a gene cluster from Xanthomonas campestrispv.vesicatoria that determines pathogenicity and the hypersensitive responseon pepper and tomato.Mol Plant-Microbe Interact 4，81-88.

Büttner，D.&Bonas，U.(2010).Regulation and secretion of Xanthomonasvirulence factors.FEMS Microbiol Rev 34，107-33.

Büttner，D.&Bonas，U.(2002).Port of entry--the type III secretiontranslocon.Trends Microbiol 10，186-192.

Chan，J.W.Y.F.&Goodwin，P.H.(1999).The molecular genetics of virulenceof Xanthomonas campestris.Biotechnol Adv 17，489-508.

da Silva，A.C.，Ferro，J.A.，Reinach，F.C.et al.(2002).Comparison of thegenomes of two Xanthomonas pathogens with differing host specificities.Nature417(6887)，459-463.

Dow，J.M.，Crossman，L.，Findlay，K.，He，Y.Q.，Feng，J.X.&Tang，J.L.(2003).Biofilm dispersal in Xanthomonas campestris is controlled by cell-cellsignaling and is required for full virulence to plants.Proc.Natl.Acad.Sci.USA100，10995-11000.

Hueck，C.J.(1998).Type III protein secretion systems in bacterialpathogens of animals and plants.Microbiol Mol Biol Rev 62，379-433.

Leyns，F.，De Cleene M.，Swings，J.&De Ley，J.(1984).The host range of thegenus Xanthomonas.Bot Rev 50，305-355.

Li，R.F.，Lu，G.T.，Li，L.，Su，H.Z.，Feng，G.F.，Chen，Y.，He，Y.Q.，Jiang，B.L.，Tang，D.J.&Tang，J.L.(2014).Identification of a putative cognate sensor kinasefor the two-component response regulator HrpG，a key regulator controlling theexpression of the hrp genes in Xanthomonas campestris pv.campestris.EnvironMicrobiol 16，2053-2071.

Liu，Z.Y.，Zou，L.F.，Xue，X.B.，Cai，L.L.，Ma，W.X.，Xiong，L.，Ji，Z.Y.&Chen，G.Y.(2014).HrcT is a key component of the type III secretion system inXanthomonas spp.and also regulates the expression of the key hrptranscriptional activator HrpX.Appl Environ Microbiol 80，3908-3919.

Mole，B.M.，Baltrus，D.A.，Dangl，J.L.&Grant，S.R.(2007).Global virulenceregulation networks in phytopathogenic bacteria.Trends Microbiol 15，363-371.

Qian，W.，Jia，Y.，Ren，S.X.et al.(2005).Comparative and functionalgenomic analyses of the pathogenicity of phytopathogen Xanthomonas campestrispv.campestris.Genome Res 15，757-767.

Swings，J.G.&Civerolo，E.L.(1993).Xanthomonas 1st edition London：Chapman&Hall.

Wengelnik，K.&Bonas，U.(1996).HrpXv，an AraC-type regulator，activatesexpression of five of the six loci in the hrp cluster of Xanthomonascampestris pv.vesicatoria.J Bacteriol 178，3462-3469.

Wengelnik，K.，Van den Ackerveken，G.&Bonas，U.(1996).HrpG，a key hrpregulatory protein of Xanthomonas campestris pv.vesicatoria is homologous totwo-component response regulators.Mol Plant-Microbe Interact 9，704-712.

Wilson，T.J.G.，Bertrand，N.，Tang，J.L.，Feng，J.X.，Pan，M.Q.，Barber，C.E.，Dow，J.M.&Daniels，M.J.(1998).The rpfA gene of Xanthomonas campestris pathovarcampestris，which is involved in the regulation of pathogenicity factorproduction，encodes an aconitase.Mol Microbiol28，961-970.

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种黄单胞菌致病相关的基因的应用， 该基因作为抗病育种靶标或药物靶标应用于防治黄单胞菌引起的植物病害。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种黄单胞菌致病相关的基因hpaM在防治植物黄单胞菌病害上的应用，该基因的编号为XC_2847。

优选地，植物黄单胞菌病害包括由十字花科黑腐病菌所导致的十字花科黑腐病、水稻白叶枯病菌所导致的水稻白叶枯病和水稻细条病菌所导致的水稻细条病中的一种或多种。

优选地，该基因是下列核苷酸序列之一：

序列表中序列1的DNA序列；

与序列表中序列1限定的DNA序列中的第353～1402位核苷酸序列具有80％以上同源性的DNA序列。

优选地，基因自5′端的第353～1402位核苷酸为所述基因的开放阅读框，自5′端的第353～355位核苷酸为所述基因的起始密码子，自5′端的第1400～1402位核苷酸为所述基因的终止密码子。

优选地，该基因编码细胞膜蛋白，是序列表中序列2的蛋白质序列；该蛋白质序列预测分子量为38212道尔顿，等电点为6.14。

优选地，该基因的缺失突变体Δ2847、ΔhpaM_Xoo、ΔhpaM_Xoc以及携带该基因的质粒pL2847。

本发明在十字花科黑腐病菌、水稻白叶枯病菌和水稻细条病菌中鉴定到一种黄单胞菌致病性相关的基因，该基因编码一个细胞膜蛋白。该基因突变后，会使得病原菌对寄主植物的致病性基本丧失，诱导非寄主植物产生过敏反应的能力明显降低。由于该基因编码产物是一个细胞膜蛋白，能够感受细胞外的环境信号，因此是开发防治黄单胞菌植物病害新方法的一个潜在的抗病育种靶标或药物靶标。

附图说明

图1为hpaM基因(XC_2847)在十字花科黑腐病菌8004菌株基因组中的遗传图谱和物理图谱；

图2为hpaM基因的缺失突变体Δ2847及其互补菌株CΔ2847菌落形态及胞外酶活性检测；

图3为hpaM基因的克隆酶切电泳图谱；

图4为hpaM基因的缺失突变体Δ2847及其互补菌株CΔ2847在寄主萝卜叶片形成的病斑；

图5为hpaM基因突变体Δ2847及其互补菌株CΔ2847在辣椒叶片引起的过敏反应，hrcV基因突变体ΔhrcV和水作为对照；

图6为hpaM基因编码一个细胞膜蛋白，Xcc中的细胞膜蛋白HpaS和位于细胞核的转录因子HpaR1分别作为正对照和负对照；

图7表示出水稻白叶枯病菌中(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)中的hpaM_Xoo基因与致病性和过敏反应有关；

图8表示出水稻细条病菌中(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)中的hpaM_Xoc基因与致病性和过敏反应有关。

具体实施方式

在本发明中，首先在Xcc野生型菌株8004中证实了编号为XC_2847的基因与病原菌Xcc的致病性有关，并证实该基因编码一个细胞膜蛋白。根据基因组测序并注释，XC_2847被认为是编码一个假定蛋白，也即此前该基因的功能是未知的。该基因在黄单胞属病原菌中高度保守，其与其它黄单胞菌(如Xoo、Xoc等)中的同源基因的同源性往往超过90％。第一步，在Xcc中对XC_2847 基因的结构进行分析，确定了该基因的编码区；第二步，通过在Xcc中对该基因进行敲除，构建该基因的缺失突变体，并对该突变体进行反式互补，即是通过PCR反应扩增出该基因，并将该基因克隆到载体pLARF6，获得重组DNA分子，再将所得到的重组DNA分子导入到该基因的缺失突变体，观察所获得的互补菌株(也称互补的突变体)的表型是否与野生型菌株一致，证实了该基因与病原菌Xcc的致病性有关，即XC_2847基因是病原菌Xcc一个新的致病相关基因。在此，将该基因命名为hpaM(for hrp-associatedMembrane>

另外，本发明还对hpaM基因在Xoo和Xoc中的同源基因(被分别命名为hpaM_Xoo和hpaM_Xoc)进行分析，发现Xoo中的hpaM_Xoo和Xoc中的hpaM_Xoc被敲除后(即hpaM同源基因去除)，使Xoo和Xoc病原菌分别丧失在寄主水稻产生白叶枯病和细条病的能力，也都丧失了在非寄主植物烟草上诱导产生过敏反应的能力。因此，确定hpaM基因是黄单胞菌属病原菌中一个新的致病相关基因，其编码的膜蛋白可作为抗病育种靶标或药物靶标应用于防治黄单胞菌引起的植物病害。

下面结合附图和优选实施例详细描述本发明的技术方案。以下例举的实施例仅用于说明和解释本发明，而不用于限制本发明的技术方案。本发明的请求保护的范围由权利要求具体限定。

本发明鉴定的黄单胞菌的致病相关基因，编码一个细胞膜蛋白，能够作为抗病育种靶标或药物靶标应用于防治植物病害。

本发明提供的编码细胞膜蛋白的基因XC_2847(hpaM)，是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中序列1的DNA序列；

2)与序列表中序列1限定的DNA序列中的第353～1402位核苷酸序列具有 80％以上同源性的DNA序列。

序列表中序列1的DNA序列是十字花科黑腐病菌野生型菌株8004的基因组中的一段DNA序列，由1432个核苷酸组成。该DNA序列含完整的编码细胞膜蛋白的基因，编号为XC_2847；自5′端的第353～1402位核苷酸为该基因的开放阅读框(ORF，Open Reading Frame)，自5′端的第353～355位核苷酸为该基因的起始密码子ATG，自5′端的第1400～1402位核苷酸为终止密码子TAA。

序列表中序列2的蛋白质序列是XC_2847基因编码的细胞膜蛋白演绎的氨基酸序列，由349个氨基酸组成。该蛋白质序列预测分子量为38212道尔顿，等电点为6.14。

上述DNA序列已在美国国立生物技术信息中心(NCBI，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布，基因组序列号为NC_007086(或者CP000050)，该基因编码蛋白序列号为AAY49896.1(但在本实施例1中，本发明对该蛋白质的氨基酸序列进行了重新界定)。该基因的缺失突变体Δ2847及携带该基因的质粒pL2847已在广西大学生命科学与技术学院保存。

本发明还涉及含有上述基因(XC_2847)的表达载体，该表达载体优选为pL2847。

将本发明提供的黄单胞菌属(Xanthomonas)病原菌中的同源基因作为抗病育种靶标或药物靶标应用于防治植物病害。

在本发明的实施例中，所述植物病害是由黄单胞菌属病原菌所致的，包括十字花科黑腐病菌所导致的十字花科作物黑腐病，白叶枯病菌所导致的水稻白叶枯病以及细条病菌所导致的水稻细条病中的一种或多种。

在以下实施例中所用到的材料包括：

十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris)野生型菌株8004，购于英国植物病原细菌国家保藏中心(NCPPB，The National Collection of PlantPathogenic Bacteria)，保藏号为NCPPB No.1145；水稻白叶枯病菌 (Xanthomonas oryzaepv.oryzae)野生型菌株PXO99^A，为国际研究水稻白叶枯病的模式菌株，由本实验室收藏；水稻细条病菌(Xanthomonas>

大肠杆菌(Escherichia coli)株系JM109、载体pGEM-3Zf(+)购自Promega公司；

pLAFR3(Staskawicz et al.，1987)和不带启动子的pLAFR6(Huynh et al.，1989)为本研究室保存的柯斯质粒；

限制性内切酶、连接酶和其它修饰酶等试剂购自Promega、QIAGEN公司等。

PCR反应所用引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

实施例1

十字花科黑腐病菌XC_2847(hpaM，以下简称XC_2847基因)基因转录起始位点的确定

由于XC_2847基因在Xcc 8004菌株的全基因组测序中，被注释为编码一个“假定蛋白”，因此该基因是否是一个有确定功能的基因是首先要确定的问题。在此，首先采用5′-RACE(即5′末端快速扩增法，分子生物学中的一种实验方法)来确定XC_2847基因转录起始位点，具体方法可参看文献李瑞芳等的描述(Li et al.，2014，具体请参考后面列出的参考文献)。

为此，需要设计4个巢式引物2847RTP1-4：

2847RTP1：AGATAGATGCCCTGGCTGCC；

2847RTP2 CGGTGCGATTGAACGACACG；

2847RTP3：CGGTGCTGGCCACGATCTGCAT；

2847RTP4：ATCGGCCATGCGCAGCACGG)。

将Xcc 8004菌株在NYG(每升溶液含5g蛋白胨，3g酵母膏和20g甘油，pH 7.0)培养至OD₆₀₀≈0.6(即分光光度计在600纳米的波长上测定吸收值)，用总RNA提取试剂盒(Promega公司提供)提取RNA，并且用无RNA酶的DNA酶I(Qiagen公司，Hilden，Germany提供)处理，然后再次纯化。使用5′-RACE试剂盒(Invitrogen>

使用XC_2847基因序列特异性引物2848RTP1反转录RNA。

在通过脱氧核糖核苷酸末端转移酶将一个锚定序列添加到eDNA的3′末端，然后通过使用嵌套的特异性引物(2847RTP2，2847RTP3和2847RTP4)来直接扩增带尾的cDNA。

所得PCR产物分别克隆到PMD19-T载体，并测序。

将所得到的序列与XC_2847基因的序列对比，可确定XC_2847基因的转录起始位点为T，见图1。

图1是XC_2847基因在Xcc 8004菌株基因组中的遗传图谱和物理图谱。图中的上部表示Xcc 8004菌株基因组中的位置，根据基因组注释，基因组中核苷酸第3426325bp～3427485bp的位置为XC_2847基因的开放阅读框，长度为1161bp。而根据实施例中转录起始位点定位的结果，XC_2847基因的开放阅读框长度应该为1050bp，在基因组中3426436bp～3427485bp的位置。因此该基因所编码的蛋白质的氨基酸序列要比NCBI所公布的蛋白质(即AAY49896.1)缩短了37个氨基酸长度。图1下部表示本发明重新确定的XC_2847基因的开放阅读框的上游DNA序列，是XC_2847基因的启动子区，位于基因组3426325bp～3426444bp的区域。转录起始位点T用方框标注，下划线部分分别表示启动子的-10区和-35区。

实施例2

十字花科黑腐病菌XC_2847基因突变体的构建

构建XC_2847的缺失突变体，具体方法参照等所描述(Gene 1994，145：69-73)的方法。

根据XC_2847基因上下游的DNA序列(Xcc 8004菌株的基因组序列号为：NC_007086)，设计引物：

2847UF：ACAGTTGAATTC>

2847UR：ACAGTTTCTAGA>

2847DF：ACAGTTTCTAGA>

2847DR：ACAGTTAAGCTT>

以十字花科黑腐病菌8004菌株总DNA为模板，采用PCR法(95℃预变性4min；95℃变性1min，55℃复性30s，74℃延伸1min，30个循环；74℃延伸5min)分别扩增XC_2847基因上游747bp和下游726bp的DNA同源片段。

为方便克隆，引物的5′端分别加上相应的酶切位点序列(即上述DNA序列中的下划线部分)。将所得的两段PCR片段分别克隆到自杀质粒pK18mobsacB的EcoRI及HindIII位点上，获得重组质粒pLA2847。通过三亲本接合，将pLA2847导入十字花科黑腐病菌8004菌株，然后在含有5％蔗糖的NYG培养基上筛选XC_2847的缺失突变体。三亲本接合具体方法可参考Turner等所述(1985，具体见后面列出的参考文献)。XC_2847基因的缺失突变体Δ2847的菌落形态见图2。

实施例3

XC_2847基因的克隆、序列测定及XC_2847基因突变体的功能互补

根据XC_2847基因的DNA序列(NC_007086)，设计引物

2847F：ACAGTTGGATCC>

2847R：ACAGTTAAGCTT>

以Xcc 8004菌株总DNA为模板，用PCR法(95℃预变性4min；95℃变 性1min，55℃复性30s，74℃延伸2min，30个循环；74℃延伸5min)扩增包含XC_2847基因全长的1432bp的DNA序列。为方便克隆，引物的5′端分别加上BamHI和HindIII的酶切位点序列(即上述DNA序列的下划线部分)。

将所获得的DNA片段克隆至载体pGEM3Zf(+)中，用Sanger末端中止法在ABI377DNA自动测序仪上测定DNA核苷酸序列(见序列1)。

将测序验证正确的XC_2847基因DNA片段克隆至穿梭载体pLAFR6的BamH/HindIII位点上，获得了含该基因的重组质粒pL2847。该质粒用BamH、HindIII酶切，除了一条约22kb的载体DNA片段外，还有一条约1.5kb的外源片段，请参见图3；其中，bp即base pair，指碱基对，是分子生物学上衡量DNA长度的单位；kb即为千碱基对；M1：100bp标准DNA；1：XC_2847基因片段；2：重组质粒pL2847的酶切图；M2：λ/HindIII标准DNA。

XC_2847基因突变体的反式互补(也可称为功能互补)的实施，是采用Turner等所述的三亲本接合法将重组质粒pL2847导入XC_2847基因突变体Δ2847，获得携带重组质粒pL2847的互补菌株CΔ2847(也称为互补的突变体)，请参见图2。

实施例4

Xcc中XC_2847基因突变体的致病性试验及诱导过敏反应能力的检测

实验所用寄主植物为萝卜苗(种名为Raphanus sativus L.var.radiculusPers.)，所用的接种方法为剪叶法(Dow et al.，2003，具体见后面列出的参考文献)。Xcc菌株在NYG液体培养基在中28℃培养15-18个小时后，稀释到OD₆₀₀≈0.1，用灭过菌的剪刀在菌液浸泡5秒钟后，在健康叶片距叶尖1-2cm垂直叶脉的方向剪到中轴处，停留5秒钟，被接种的植物在25-30℃培养10天后观察结果，正对照选用Xcc野生型菌株8004，负对照用清水。致病试验表明，XC_2847基因突变体Δ2847在萝卜叶片上形成的病斑长度与野生型菌株8004相比显著降低，而互补菌株CΔ2847形成的病斑长度则与野生型基本相当，请>

过敏反应(hypersensitive reaction，HR)试验是在Xcc的非寄主植物辣椒ECW-10R(Capsicum annuum cv.ECW-10R)品种上进行。

将培养好的菌液用10mM磷酸缓冲液(5.8mM Na₂HPO₄，4.2mM>2PO₄，pH>600≈0.1(每毫升约1×10⁸个活菌)后，用不带针头的注射器将2μL的细菌悬浮液压渗到叶片的叶肉组织中。被接种的植物在28℃中培养16或24小时，观察拍照，请参见图5；该图中“ddH₂O”表示蒸馏纯净水，ΔhrcV是指Xcc中的与过敏反应有关的hrcV基因的突变体，用作对照。

实施例5

XC_2847基因与胞外多糖及胞外酶无关

对所获得的缺失突变体Δ2847的胞外多糖及胞外酶(如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等)进行检测，以确定XC_2847基因是否与DSF/rpf致病系统有关。所采用的方法参考Tang等所述(1991，具体见后面列出的参考文献)。

将十字花科黑腐病菌接种到10mL的NYG培养基中，28℃摇床培养过夜，对培养物浓度进行调节，使OD₆₀₀≈0.6，用移液器精确取2μL的培养物，分别接种于合2％葡萄糖的NYG培养基平板(Daniels>

对胞外酶如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等的检测，是取2μl浓度基本一致的待测菌株的过夜培养物，分别接种在含1％的脱脂乳、0.1％可溶性淀粉、0.5％(w/v)的羧甲基纤维素(CMC)的NYG培养基上，28℃培养24-48小时。对于胞外蛋白酶，则可通过比较菌落周围透明圈的大小来判断菌株间胞外蛋白酶的 差异。对于胞外淀粉酶，用1∶100的I₂(0.08Mol>2)及KI(3.2Mol>

实施例6

XC_2847基因编码一个细胞膜蛋白

为了XC_2847基因编码的蛋白质在细胞中的位置进行定位，需要构建能够表达融合有六个组氨酸标签(6xHis tag)的XC_2847基因产物的Xcc表达菌株。

根据XC_2847基因的DNA序列(可在GeneBank中获取：NC_007086)设计引物：

W2847F：ACAGTTGGATCCGCCTACAGCTTCTGAGCCTG；

W2847R：ACAGTTAAGCTTTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGTGGC>

采用PCR法扩增XC_2847基因的1050bp编码区，由于引物W2847R的5′端加入六个组氨酸标签的编码序列，因而PCR扩增出来的相应基因编码区的3′端带有六个组氨酸标签的编码序列。

将PCR扩增所得的DNA片段克隆到质粒载体pLAFR3上，获得重组质粒pL3H2847。然后将重组质粒通过三亲本接合导入到突变体Δ2847中，获得菌株Δ2847/pL3H2847。这一菌株表达所产生的XC_2847的编码蛋白质的C末端带有六个组氨酸标签，这标签可用于Western杂交检测。

将上述能表达融合有6xHis标签的目标蛋白的菌株(互补株)培养至适合浓度(OD₆₀₀≈1.0)后，分别提取互补菌株的细胞外膜蛋白、周质蛋白、总蛋白，用SDS-PAGE(含有十二烷基硫酸钠的聚丙烯酰胺凝胶)电泳分离，并将蛋白质转移到PVDF(聚偏氟乙烯)膜，经5％BSA(牛血清蛋白溶液)封闭后，>

实施例7

白叶枯病菌中hpaM的同源基因hpaM_Xoo与白叶枯病菌的致病性有关

为了解白叶枯病菌中XC_2847(hpaM)的同源基因hpaM_Xoo(在Xoo>A菌株的基因组中编号为PXO_01147)的功能，参考“实施例2”的方法构建Xoo>A菌株中hpaM_Xoo基因的突变体。

根据Xoo>A菌株hpaM_Xoo(PXO_01147)基因上下游序列(基因组序列号：CP000967)设计引物：

L01147F：ACAGTTGGATCCGCAGCGAGGGCATGGAAG；

L01147R：ACAGTTTCTAGAGCGGAAACGGAGCGGGCA)；

R01147F：ACAGTTTCTAGATATCGACCCGCAACGCTA；

R01147R：ACAGTTAAGCTTATTCTGTGGCGTCAGAAG)；

以水稻白叶枯病菌PXO099^A菌株总DNA为模板，采用PCR法(反应条件同实施例2)分别扩增hpaM_Xoo基因上游879bp和下游591bp的DNA同源片段。

将所得的两段PCR片段分别克隆到自杀质粒pK18mobsacB上，获得重组质粒。

通过电穿孔转化法，将所获的重组质粒转化到水稻白叶枯病菌PXO99^A菌株，然后在含有5％蔗糖的NYG培养基上筛选hpaM_Xoo基因缺失突变体。电穿孔转化法可参考Sambrook等所述(1989，具体请参见后面列出的参考文献)。所获得的hpaM_Xoo基因的缺失突变体命名为ΔhpaM_Xoo。

对hpaM_Xoo基因的克隆及ΔhpaM_Xoo基因突变体的功能互补具体方法参考“实>

C01147F：ACAGTTGGATCCATGCCTTTGCTTGCCCGCTC；

C01147R：ACAGAAGCTTTTATTGCTCCTGGCGCAC；

所用模板DNA为PXO099^A菌株总DNA。

将PCR扩增所获得的1053-bpDNA片段(包含hpaM_Xoo基因完整编码区)克隆至穿梭载体pLAFR3上，所获得的重组质粒通过电穿孔转化法导入ΔhpaM_Xoo基因缺失突变体，所获得的互补菌株(也称为互补突变体)命名为CΔhpaM_Xoo。

对Xoo野生型菌株PXO99^A、hpaM_Xoo基因缺失突变体ΔhpaM_Xoo和互补突变体CΔhpaM_Xoo致病性试验所采用的寄主植物为水稻栽培品种日本晴(Oryza>

将菌株在液体培养基中培养20个小时后，稀释到OD₆₀₀≈0.3，采用剪叶法(参考实施例4)接种至苗期为6周的水稻叶片上，被接种的植物在25-30℃培养14天后观察结果，每个处理选择25片叶子进行病斑长度测量。

致病试验表明，hpaM_Xoo基因突变体ΔhpaM_Xoo在水稻叶片上形成的白叶枯病斑长度与野生型菌株PXO99^A相比显著降低，而互补菌株CΔhpaM_Xoo形成的病斑长度则与野生型基本相当，请参见图7A和B；这表明了hpaM_Xoo基因与Xoo的致病性有关。

过敏反应(hypersensitiVe reaction，HR)试验是在Xoo的非寄主植物烟草(Nicotina benthamiana)品种上进行。

将培养好的菌液用10mM磷酸缓冲液(5.8mM Na₂HPO₄，4.2mM>2PO₄，pH>600≈0.3(约1×10⁸CFU/ml)后，用不带针头的注射器将2μL的细菌悬浮液压渗到叶片的叶肉组织中。

将被接种的植物在28℃中培养24小时，观察拍照，请参见图7C，该图中的ΔhrcC_Xoo是指Xoo中的与过敏反应有关的hrcC基因的突变体，用作对照。试验结果表明，hpaM_Xoo基因与Xoo在非寄主植物中引起过敏反应的能力有关，>Xoo基因突变后，可使Xoo不能在非寄主植物中引起过敏反应。

实施例8

细条病菌中hpaM的同源基因hpaM_Xoc与细条病菌的致病性有关

为了解细条病菌中hpaM的同源基因hpaM_Xoc(与Xoc>Xoc基因的突变体。

根据Xoc BSL256菌株XOC_3053基因(hpaM_Xoc)上下游序列(基因组序列号：CP003057)设计引物：

L3053F：ACAGTTGGATCCGCAGCGAGGGCCTGGAAG；

L3053R：ACAGTTTCTAGAGCGGAAACGGAGCGGGCA)；

R3053F：ACAGTTTCTAGATATCGACCCGCAGCGCTA；

R3053R：ACAGTTAAGCTTATTCTGTGGCGTCAGAAG；

以水稻细条病病菌GX01菌株总DNA为模板，采用PCR法(反应条件同实施例2)分别扩增hpaM_Xoc基因上游879bp和下游591bp的DNA同源片段。

将所得的两段PCR片段分别克隆到自杀质粒pK18mobsacB上，获得重组质粒。

通过电穿孔转化法，将所获的重组质粒转化到水稻白叶枯病菌GX01菌株，然后在含有5％蔗糖的NYG培养基上筛选hpaM_Xoc基因缺失突变体。所获得的hpaM_Xoc基因的缺失突变体命名为ΔhpaM_Xoc。对hpaM_Xoc基因的克隆及ΔhpaM_Xoc基因突变体的功能互补具体方法参考“实施例3”。

PCR法所用引物为：

C3053F：ACAGTTGGATCCATGCCTTTGCTTGCCCGCTC；

C3053R：ACAGAAGCTTTTATTGCTCGTGGCGCAC；

所用模板DNA为GX01菌株总DNA。

将PCR扩增所获得的1053-bpDNA片段(包含hpaM_Xoc基因完整编码区)克隆至穿梭载体pLAFR3上，所获得的重组质粒通过电穿孔转化法导入>Xoc基因缺失突变体，所获得的互补菌株命名为CΔhpaM_Xoc。

对Xoc野生型菌株GX01、hpaM_Xoc基因缺失突变体ΔhpaM_Xoc和互补突变体CΔhpaM_Xoc致病性试验所采用的寄主植物为水稻栽培品种日本晴(Oryza>

将菌株在液体培养基中培养20个小时后，稀释到OD600≈0.3，采用压渗法(即用不带针头的注射器将2μL的细菌悬浮液压渗到水稻叶片的叶肉组织中)接种至苗期为6周的水稻叶片上，被接种的植物在25-30℃培养14天后观察结果，每个处理选择25片叶子进行病斑长度测量。

致病试验表明，hpaM_Xoc基因突变体ΔhpaM_Xoc在水稻叶片上形成的细条病的病斑长度与野生型菌株GX01相比显著降低，而互补菌株CΔhpaM_Xoc形成的病斑长度则与野生型基本相当，请参见图8A和B；这表明了hpaM_Xoo基因与Xoc的致病性有关。

过敏反应(HR)试验是在Xoc的非寄主植物烟草(Nicotina benthamiana)品种上进行。具体做法与实施例8相同。试验结果见图8C，该图中的ΔhrcC_Xoc是指Xoc中的与过敏反应有关的hrcC基因的突变体，用作对照表明hpaM_Xoc基因与Xoo在非寄主植物中引起过敏反应的能力有关，hpaM_Xoc基因突变后，可使Xoc不能在非寄主植物中引起过敏反应。

从本发明的上述实施例可以看出，本发明鉴定的基因的失活直接导致十字花科黑腐病菌，水稻白叶枯病菌和水稻细条病菌等黄单胞菌属病原菌致病力的下降。因此，该基因可以用于黄单胞菌属病原菌植物病害防治，包括由十字花科黑腐病菌(Xanthomonascampestris pv.campestris)所导致的十字花科黑腐病、水稻白叶枯病菌(Xanthomonasoryzae pv.oryzae)所导致的水稻白叶枯病和水稻细条病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzicola)所导致的水稻细条病中的一种或多种。另外，本发明鉴定的基因可以作为开发用于植物病害防治的抗病育种 靶标或药物靶标。本领域技术人员可以根据本说明书的教导和启示，开发用于防治植物病害、特别是十字花科黑腐病、水稻白叶枯病和水稻细条病菌的药物。

参考文献

Daniels，M.J.，Barber，C.E.，Turner，P.C.，Sawczyc，M.K.，Byrde，R.J.W.&Fielding，A.H.(1984).Clonging of genes involved in pathogenicity ofXanthomonas campestris pv.campes tris using the broad-host-range cosmidpLAFR1.EMBO J3，3323-3328.

Dow，J.M.，Crossman，L.，Findlay，K.，He，Y.-Q.，Feng，J.-X.，&Tang，J.-L.2003.Biofilm dispersal in Xanthomonas campestris is controlled by cell-cellsignaling and is required for full virulence to plants.Proc Natl Acad Sci USA100，10995-11000.

Huynh，T.V.，Dahlbeck，D.&Staskawicz，B.J.(1989).Bacterial blight ofsoybean：regulation of a pathogen gene determining host cultivarspecificity.Science 245，1374-1377.

Li，R.F.，Lu，G.T.，Li，L.，Su，H.Z.，Feng，G.F.，Chen，Y.，et al.(2014)Identification of a putative cognate sensor kinase for the two-componentresponse regulator HrpG，a key regulator controlling the expression of the hrpgenes in Xanthomonas campestris pv.campestris.Environ Microbiol 16：2053-2071.

Newman，M.A.，von Roepenack-Lahaye，E.，Parr，A.，Daniels，M.J.&Dow，J.M.(2001).Induction of hydroxycinnamoyl-tyramine conjugates in pepper byXanthomonas campestris，a plant defense response activated by hrpgenedependent and hrp gene-independent mechanisms.Mol Plant-Microbe Interact14，785-792.

Qian，W.，Jia，Y.，Ren，S.X.et al.(2005).Comparative and functionalgenomic analyses of the pathogenicity of phytopathogen Xanthomonas campestrispv.campestris.Genome Res 15，757-767.

Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，and Maniatis，T.(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual.New York，USA：Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Salzberg，S.L.，Sommer，D.D.，Schatz，M.C.，et al.(2008).Genome sequenceand rapid evolution of the rice pathogen Xanthomonas oryzae pv.oryzaePXO99^A.BMC>

Staskawicz，B.，Dahlbeck，D.，Keen，N.&Napoli，C.(1987).Molecularcharacterization of cloned avirulence genes from race 0 and race 1 ofPseudomonas syringae pv.glycinea.JBacteriol 169，5789-5794.

Turner，P.，Barber，C.E.&Daniels，M.J.(1985).Evidence for clusteredpathogenicity genes in Xanthomonas campestris pv.campestris.Mol Gen Genet199，338-343.

Tang，J.L.，Y.N.Liu，C.E.Barber，J.M.Dow，J.C.Wootton，and M.J.Daniels.(1991)Genetic and molecular analysis of a cluster of rpfgenes involved inpositive regulation of synthesis of extracellular enzymes and polysaccharidein Xanthomonas campestris pathovar campestris.Mol.Gen.Genet.226：409-417.

A.，Tauch，A.，W.，Kalinowski，J.，Thierbach，G.，and Pühler，A.(1994)Small mobilizable multi-purposecloning vectors derived from theEscherichia coli plasmidspK18 and pK19：selection of defined deletions in thechromosomeof Corynebacteriumglutamicum.Gene 145：69-73。