水稻黄单胞菌水稻致病变种中7个与致病相关基因的功能鉴定

摘要

水稻白叶枯病是由植物病原细菌水稻黄单胞菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae以下简称Xoo)引起的，它是最严重的水稻病害之一。
　　 hrpG、hrpX是Xoo的两个关键致病基因。为了得到研究毒性基因表达调控的hrpG、hrpX突变体，我们通过同源自杀质粒整合的方法构建了hrpG、hrpX的突变体，致病性互补检测试验结果显示：hrpG、hrpX的突变体在水稻上完全丧失了致病性，而hrpG、hrpX互补株能恢复其在水稻上的致病性，说明我们的突变体构建成功。
　　 本实验室梁莹曾经构建过pdeA、pcaD、pin的突变体，但是没有成功构建其互补株，无法确认这些突变体的正确性，为了了解这几个基因在致病中的作用，我们构建了pdeA、pcaD、pin的突变体并成功互补。致病性检测发现，pdeA、pcaD、pin的突变体在水稻上的致病性显著降低，而互补株能恢复其在水稻上的致病性。
　　 为了进一步了解rpfG的作用，我们也成功的构建了rpfG的突变体以及rpfG、RpfG的HDc结构域的过量表达株。致病性检测结果显示：rpfG的突变体及rpfG、RpfG的HDc结构域的过量表达株在水稻上的致病性显著降低，rpfG突变后对过敏反应没有影响，但是它能减少可扩散性信号因子、胞外多糖、胞外木聚糖酶和胞外淀粉酶的产生。rpfG的互补株能恢复这些表型，RpfG的HDc结构域的单独互补只能部分恢复这些表型，RpfG的REC结构域单独互补时则对这些表型没有影响。这些结果表明：rpfG对Xoo的致病性是重要的，而REC结构域对rpfG基因功能的完整性则是必须的。
　　 RsmA(repressor of secondary metabolism)/CsrA(carbon storageregulator)在许多细菌中是一个转录后全局调控因子。RsmA/CsrA在动植物病原细菌的致病过程中起重要作用。虽然.rsmAXcc在Xcc中的作用已经知，但是rsmAxoo在Xoo中的作用还不清楚。由于Xcc中的rsmAxcc与Xoo中的rsmAXoo的一致性只有93％，所以rsmAXcc在Xoo中作用还是值得我们进一步研究的。
　　 为了进一步了解rsmAXoo的作用，我们也成功的构建了rsmAXoo的突变体及互补株。实验结果显示rsmAXoo的突变体完全丧失了引起过敏反应的能力，但是它的突变体中的可扩散性信号因子、胞外多糖、胞外纤维素酶和胞外淀粉酶的产量明显下降。另外，rsmAXoo突变以后还增加了细胞内糖原的产生，能形成生物膜。半定量PCR分析结果显示：rsmAXoo能正向调控avrXa7、xrvA、5个hrp操纵子以及hpa1、hpa2、hpaF，rafB、glgA、eglXoB、X000175。这些结果表明rsmAXoo对Xoo的致病性是必须的。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 前言

1.1水稻白叶枯病

1.2植物病原细菌与植物的相互作用

1.2.1植物病原细菌简介

1.2.2植物病原细菌与植物的相互作用

1.3植物病原细菌致病分子机理研究

1.3.1植物的致病因子

1.3.2 hrp基因和III型分泌系统

1.4植物病原细菌的致病调控研究进展

1.5本实验的研究目的和意义

第二章 材料和方法

2.1菌株及质粒

2.2培养基及培养条件

2.2.1培养基

2.2.2培养条件

2.2.3菌体保存

2.3抗生素

2.4常用溶液及缓冲液

2.5本研究所用的引物

2.6 DNA的提取

2.6.1总DNA的提取

2.6.2质粒DNA的碱裂解法提取

2.6.3 DNA的纯化

2.7 DNA的酶切、电泳及DNA片段浓度、大小测算

2.7.1 DNA的酶切

2.7.2琼脂糖凝胶电泳及DNA浓度、大小的测算

2.8 DNA片段的回收

2.9载体的脱磷酸化处理

2.10 DNA连接

2.11质粒DNA的转化

2.11.1 MgCl2-CacL法快速制备E.coli的感受态细胞

2.11.2转化反应

2.11.3质粒DNA的电脉冲导入

2.12细菌总RNA的提取

2.12.1提取总RNA前的准备及注意事项

2.12.2总RNA的提取

2.13 RNA的定量与纯度

2.13.1 RNA的纯度和浓度

2.13.2 RNA的电泳图谱

2.13.3保温试验

2.14总RNA的DNase再处理

2.15 cDNA的合成

2.16 PCR扩增反应

2.16.1 PCR引物的设计

2.16.2 PCR反应

2.16.3 Semi—RT—PCR

2.17 DNA测序

2.18三亲本接合

2.19植株试验

2.19.1水稻的剪叶接种试验

2.19.2蓖麻的过敏反应

2.20菌株在水稻体内的生长动力学检测

2.21胞外多糖测定

2.21.1胞外多糖的平板测定

2.21.2胞外多糖的定量检测

2.22细菌细胞内糖原积累的检测

2.22.1细菌细胞内糖原积累的平板测定

2.22.2细菌细胞内糖原积累的定量检测

2.23 DSF的检测

2.23.1 DSF的平板测定

2.23.2 DSF的定量检测

2.24胞外酶的检测

2.24.1胞外酶的平板检测

2.24.2胞外酶精确定量检测

2.25生物膜合成检测

2.26游动性检测

第三章 结果与分析

3.1 hrpG、hrpX的实验

3.1.1 hrpG、hrpX突变体的构建

3.1.2 Xoo hrpG、hrpX突变体的“互补株”的构建

3.1.3 Xoo hrpG突变体和hrpX突变体的致病性完全丧失

3.2 pdeA、pcaD、pin基因的功能鉴定

3.2.1 pdeA、pcaD、pin突变体的构建

3.2.2 Xoo pdeA、pcaD、pin突变体“互补株”的构建

3.2.3 pdeA、pcaD、pin突变体和互补株的植株试验

3.3 rpfG基因的功能鉴定

3.3.1 rpfG突变体的构建

3.3.2.Xoo rpfG突变体的“互补株”的构建

3.3.3.Xoo rpfG过量表达株的构建

3.3.4表型分析

3.4RsmAxoo基因的功能鉴定

3.4.1 RsmAxoo突变体的构建

3.4.2 Xoo rsmAxoo突变体的“互补株”的构建

3.4.3表型分析

第四章 讨论

4.1毒性基因表达调控所需的hrpG、hrpX突变体的构建

4.2 pdeA、pcaD、pin在致病性中的作用

4.3 rpfG参与的调控

4.4RsmAxoo调控与致病性、T3SS、胞外酶相关的基因

参考文献

致谢