检测稻黄单胞菌致病变种的特异性引物及应用

摘要

本发明披露了检测稻黄单胞菌致病变种的特异性引物及应用，致病变种包括分别针对栖稻致病变种Xoc、李氏禾致病变种Xol以及水稻致病变种Xoo的引物对，其中，针对Xoc的引物对的正向引物U_Xoc_1F如序列表中的序列1，其反向引物U_Xoc_1R如序列表中的序列2；针对Xol的引物对的正向引物U_Xol_2F如序列表中的序列3，其反向引物U_Xol_2R如序列表中的序列4；以及针对Xoo的引物对的正向引物U_Xoo_2F如序列表中的序列5，其反向引物U_Xoo_2R如序列表中的序列6。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域里黄单胞菌致病变种的检测和鉴别，尤其涉及检测鉴别稻黄单胞菌致病变种的特异性引物及应用。

背景技术

水稻作为最重要的粮食作物之一，其安全生产与人民生活、国家安全及社会稳定发展密切相关。水稻在生长过程中会受到多种病害的侵染，而导致产量和品质有所下降。水稻病害的早期诊断并有效地分辨各病害潜在的病原，是靶向施药、有效防控的基础。稻黄单胞菌包括三个致病变种：水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，简称Xoo)、栖稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola，简称Xoc)和李氏禾致病变种(Xanthomonasoryzae pv.leersiae，简称Xol)，它们分别会引起水稻的白叶枯病、条斑病和短条斑病。其中，水稻的白叶枯病和条斑病是主要的水稻病害，在我国主要稻区均有发生，已对水稻的安全生产构成威胁。2019年前，黄单胞菌在李氏禾上引起的条斑病害只是被认为是稻黄单胞菌的近亲，直到2019年通过分析确认，将该类病菌归类为稻黄单胞菌致病变种的一类。而目前在线发布的Xol相关引物无法鉴定本实验室存放的Xol菌株，且部分Xoo引物也无法区分Xoo和Xol菌株。

基于PCR(Polymerase Chain Reaction聚合酶链式反应)的分子检测技术是常用的快速、准确的DNA检测方法，广泛用于检验检疫、物种鉴定、物种溯源、种群分布和密度等方面。PCR引物，是指在核苷酸聚合作用起始时，刺激合成的一种具有特定核苷酸序列的大分子，在PCR过程的退火阶段，引物与单链模板结合，DNA聚合酶沿着引物的3’末端向后进行DNA的合成。特异性引物，则是在整个基因组中能且只能完成一段特定序列复制的单链寡核苷酸。

综上所述，现有的检测鉴别稻黄单胞菌致病变种技术亟需找到一种特异性引物，能够快速有效地检测鉴别稻黄单胞菌的不同致病变种。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种黄单胞菌致病变种的特异性引物，能够快速有效地检测鉴别出稻黄单胞菌的不同致病变种。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种检测稻黄单胞菌的不同致病变种的特异性引物，包括分别针对栖稻致病变种Xoc、李氏禾致病变种Xol以及水稻致病变种Xoo的引物对的一种或多种，其中，

针对Xoc的引物对，其

正向引物U_Xoc_1F：AGTTCGAGACGACGGATGC，

反向引物U_Xoc_1R：CCTAGCAATCCCGAACCTG；

针对Xol的引物对，其

正向引物U_Xol_2F：AGGGTTACTTGGAGGAGGC，

反向引物U_Xol_2R：CAGCGTCTTGATGTCCAGG；

以及针对Xoo的引物对，其

正向引物U_Xoo_2F：GCCGCAAACCCTGTGTTCAT，

反向引物U_Xoo_2R：CTGCACACGTAGAAGGCGAT；

在此，引物对U_Xoo_2F/U_Xoo_2R，是针对亚洲地区Xoo的引物对。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种特异性引物在检测稻黄单胞菌的不同致病变种方面的应用，包括检测栖稻致病变种Xoc、李氏禾致病变种Xol以及水稻致病变种Xoo的中的一种或多种。

本发明通过研究设计和筛选找出鉴别稻黄单胞菌不同致病变种的特异性引物，对各致病变种有高效的特异性，不仅能对低浓度的样本进行鉴定，且它们混合使用时也能将三类致病变种快速的识别鉴定，由此显现出本发明的特异性引物特有的高效、快速检测鉴别之优势。

附图说明

图1为本发明的特异性引物的电泳结果；

图2为本发明的特异性引物U_Xoc_1F/R检测结果；

图3为本发明的特异性引物U_Xoo_2F/R检测结果；

图4为本发明的特异性引物U_Xol_2F/R检测结果；

图5为本发明的特异性引物混合起来的检测结果；

图6为以Xoc菌株的基因组DNA为模板对本发明的U_Xoc_1F/R进行灵敏度检测；

图7为以Xoo菌株的基因组DNA为模板对本发明的U_Xoo_2F/R进行灵敏度检测；

图8为以Xol菌株的基因组DNA为模板对本发明的U_Xol_2F/R进行灵敏度检测。

具体实施方式

以下结合优选实施例对本发明的技术方案进行详细地阐述。应该理解，以下列举的实施例仅用于说明和解释本发明的技术方案，而不用于限制本发明。

以下实施例中所用的材料、试剂等，若无特殊说明，均可通过商业途径获得。

在李氏禾条斑并害被归类为稻黄单胞菌病害的一种后，我们查阅相关文献后使用该文献内的Xol引物无法鉴定本实验室保存的Xol菌株，且已发表的部分Xoo引物也无法将Xol与Xoo区分开来。针对这一现象，我们通过本地和在线Blast去寻找不同黄单胞菌致病变种中特定DNA区段的多样性来进行引物设计。并且，为了实现使用本发明的特异引物进行快速鉴定，将这三对引物进行了融合试验，在优化PCR程序和跑胶条件后，确保了其快速便捷使用的可能性。

根据上述的研究成果，本发明提供了一种检测稻黄单胞菌的不同致病变种的特异性引物，包括分别针对栖稻致病变种Xoc、李氏禾致病变种Xol以及水稻致病变种Xoo的引物对的一种或多种，其中，

针对Xoc的引物对，其

正向引物U_Xoc_1F：AGTTCGAGACGACGGATGC(序列表中序列1)，

反向引物U_Xoc_1R：CCTAGCAATCCCGAACCTG(序列表中序列2)；

针对Xol的引物对，其

正向引物U_Xol_2F：AGGGTTACTTGGAGGAGGC(序列表中序列3)，

反向引物U_Xol_2R：CAGCGTCTTGATGTCCAGG(序列表中序列4)；

以及针对Xoo的引物对，其

正向引物U_Xoo_2F：GCCGCAAACCCTGTGTTCAT(序列表中序列5)，

反向引物U_Xoo_2R：CTGCACACGTAGAAGGCGAT(序列表中序列6)。

在此，引物对U_Xoo_2F/U_Xoo_2R，是针对亚洲地区Xoo的引物对。

本发明提供了一种特异性引物在检测稻黄单胞菌的不同致病变种方面的应用，该检测包括如下步骤：

S1：采集水稻种子或叶片，疑似发病样品或无症状潜伏期样品；

S2：将样品剪碎、研磨，溶于去离子水；

S3：使用特异引物和样品溶液做PCR验证；

S4：做PCR结果分析。

以待检测样品的研磨液、提取液为模板，利用上述的特异性引物进行PCR扩增，得到扩增产物；将扩增产物进行凝胶电泳，依据凝胶电泳结果进行分析判断：

若扩增出280bp的产物，则样品中存在栖稻致病变种Xoc；

若扩增出119bp的产物，则样品中存在水稻致病变种Xoo；

若扩增出352bp的产物，则样品中存在李氏禾致病变种Xol。

实施例1引物设计及筛选

本发明通过Blast对相关的菌株和一些国际认可的菌株进行比对，由此找到它们各自的特异片段设计出关于Xol、Xoo及Xoc的三对引物。其中特异片段序列全部来源于美国NCBI(National Center for Biotechnology Information，国家生物技术信息中心)RefSeq基因组数据库中Xol、Xoo及Xoc已完成全基因组测序的菌株基因组(截止2021.03.19)。再将已设计好的引物放入NCBI的Primer-Blast中在nr核酸数据库进行特异性筛选。上述引物均在北京擎科生物技术有限公司南宁合成部合成。

上述菌株基因组，其中Xol菌株包括但不限于NCPPB4346、NJ611、BAI23、BB151-3、BB156-2；Xoo菌株包括但不限于PXO99

以下实施例里所提到的″菌株″，均由广西大学实验室所分离。

在对这三对引物进行融合试验的过程中，发现引物温度和循环次数会影响跑胶的结果呈现，所以将PCR扩增程序调高退火温度，减少循环次数，并且增加了琼脂糖凝胶的硬度。

对PCR反应引物退火温度进行优化，得到PCR最佳反应体系和反应程序及其反应条件。

PCR扩增的最佳反应体系为：待检测样品1μL，正向引物0.2μL，反向引物0.2μL，dNTPs(2.5mM each)0.2μL，Easy Taq DNA Polymerase 0.1μL，10×Easy Taq Buffer 1.0μL，ddH

PCR扩增的反应程序及反应条件为：1)95℃预变性5min，2)95℃变性30S，3)引物退火温度30S，4)72℃延伸10S，重复步骤2)～4)共30个循环，最后补齐延伸72℃5min。

反应结束后，于2％琼脂糖凝胶电泳，100V，50-60min，观察结果如图1所示。

图1中显示出使用100bp plus的maker为对照，泳道1使用引物U_Xoc_1F/R，样品为Xoc菌株的基因组DNA，条带大小为280bp；泳道2使用引物U_Xoo_2F/R，样品为Xoo菌株的基因组DNA，条带大小为119bp；泳道3使用引物U_Xol_2F/R，样品为Xol菌株的基因组DNA，条带大小为352bp。

实施例2引物特异性检测

用建立的PCR方法对收集到的疑似水稻白叶枯、条斑病、李氏禾短条斑的样本进行检测，并与实验室分离出的稻黄单胞菌不同致病变种的特异性PCR结果进行比较，结果发现样本PCR检测结果与实验室分离出的稻黄单胞菌不同致病变种的特异性PCR检测结果符合率为100％，说明本发明所述的特异性引物检测结果准确性较高，适合稻黄单胞菌不同致病变种的快速鉴定。

检测结果请分别参见图2～图5。

如图2所示，是本发明针对特异性引物U_Xoc_1F/R的检测结果，即以三种稻黄单胞菌致病变种菌株的细菌混合液及其致病叶片研磨液进行U_Xoc_1F/R特异性引物的鉴定。使用100bp plus的maker为对照，泳道1-4使用U_Xoc_1F/R特异性引物，样品依次为Xoc菌株、Xoo菌株、Xol菌株的细菌混合液(泳道1)，不含Xoc菌株的细菌混合液(泳道2)，Xoc菌株的致病叶片研磨液(泳道3)和空白对照(泳道4)。

图2中有条带显示即表示检测样品中存在该特异引物对应的稻黄单胞菌致病变种Xoc；即使检测样本为混合物，也只能检测出单一条带。说明U_Xoc_1F/R对Xoc致病变种特异性及检测结果的准确性。

如图3所示，是本发明针对特异性引物U_Xoo_2F/R的检测结果，即以三种稻黄单胞菌致病变种菌株的的细菌混合液及其致病叶片研磨液进行U_Xoo_2F/R特异引物的鉴定。使用100bp plus的maker为对照，泳道1-4使用U_Xoo_2F/R特异引物，样品依次为Xoc菌株、Xoo菌株、Xol菌株的细菌混合液(泳道1)，不含Xoo菌株的细菌混合液(泳道2)，Xoo菌株致病叶片研磨液(泳道3)和空白对照(泳道4)。

图3中有条带显示即表示检测样品中存在该特异引物对应的稻黄单胞菌致病变种Xoo；即使检测样本为混合物，也只能检测出单一条带。说明U_Xoo_2F/R对Xoo致病变种特异性及检测结果的准确性。

如图4所示，为本发明针对特异性引物U_Xol_2F/R的检测结果，即以三种稻黄单胞菌致病变种菌株的的细菌混合液及其的致病叶片研磨液进行U_Xo1_2F/R特异引物的鉴定。使用100bp plus的maker为对照，泳道1-4使用U_Xol_2F/R特异引物，样品依次为Xoc菌株、Xoo菌株、Xol菌株的细菌混合液(泳道1)，不含Xol菌株的细菌混合液(泳道2)，Xol菌株致病叶片研磨液(泳道3)和空白对照(泳道4)。

图4中有条带显示即表示检测样品中存在该特异引物对应的稻黄单胞菌致病变种Xol；即使检测样本为混合物，也只能检测出单一条带。说明U_Xol_2F/R对Xol致病变种特异性及检测结果的准确性。

如图5所示，是本发明的三对特异性引物的混合检测结果，亦即将特异性引物U_Xoc_1F/R、U_Xoo_2F/R和U_Xol_2F/R等量混合，使用100bp plus的maker为对照，泳道1为三种稻黄单胞菌致病变种菌株的细菌混合液，泳道2为Xoc菌株和Xoo菌株的细菌混合液，泳道3为Xoc菌株和Xol菌株的细菌混合液，泳道4为Xoo菌株和Xol菌株的细菌混合液，泳道5-8分别为菌液Xoc菌株、Xoo菌株、Xol菌株和空白对照。

从图5中可以看出，在引物混检的凝胶显示中，分别出现1-3个条带显示，表示只要检测样本中有稻黄单胞菌致病变种，就能被检测出相对应的条带。这有力地证明了本发明针对稻黄单胞菌不同致病变种的特异性引物对各相应的致病变种有高效的特异性，无论是将它们分离使用还是混合使用均能快速、有效的识别鉴定出三类致病变种。

实施例3灵敏度检测

通过对样品模板进行浓度梯度的稀释，来证明本发明三对引物具有高灵敏度的检测，在田间取样时，对已感染病害却未发病的稻草也能准确的进行病害鉴定。

如图6、图7及图8所示，是本发明分别以Xoc菌株的基因组DNA为模板对U_Xoc_1F/R进行灵敏度检测，以Xoo菌株的基因组DNA为模板对U_Xoo_2F/R进行灵敏度检测，以及以Xol菌株的基因组DNA为模板对U_Xol_2F/R进行灵敏度检测。这些试验均使用100bp plus的maker为对照，1-9泳道的模板浓度依次为5×10

从上述图6-图8可以看出：稻黄单胞菌栖稻致病变种DNA最低检测浓度为：1×10

序列表

序列1：

序列2：

序列3：

序列表4：

序列表5：

序列表6：

序列表

<110> 广西大学

<120> 检测稻黄单胞菌致病变种的特异性引物及应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

<210> 2

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6