一种凝血因子Ⅹ激活剂效价测定方法

摘要

本发明提供了一种凝血因子Ⅹ激活剂效价的测定方法，本发明的方法依据单位时间内生成ρNA的物质的量计算FⅩA的活性。本发明的方法不使用FⅩA和FⅩa标准品间接计算待测品效价，减少了测试过程中误差，准确、方便、快捷,本发明的方法具有较好的重复性、精密度、耐用性和线性，能够稳定的测定FⅩA的效价。

说明书

技术领域

本发明属于生物制品、药物分析技术领域，具体地涉及一种凝血因子Ⅹ激活剂的效价测定方法。

背景技术

蛇毒中含有多种能够影响哺乳动物凝血系统的酶类，这些酶类与凝血机制级联放大反应中的各个凝血因子之间有比较严格的专一性作用，其中凝血因子Ⅹ激活剂是一种能够直接作用于凝血因子Ⅹ的具有蛋白水解酶特性的酶类，在蝰亚科、蝮亚科、眼镜蛇科等蛇毒中分布广泛。

人体正常的血液系统处于促凝-抗凝之间的动态平衡，当机体受到外源伤害或疾病干扰时，机体的凝血平衡被打破，启动凝血瀑布级联放大反应以抵抗外来因素的影响。然而无论是外源凝血途径还是内源凝血途径，最终均是凝血因子Ⅹ（Coagulation FactorⅩ，FⅩ）被激活为活化状态，即活化的凝血因子Ⅹ（Coagulation Factor Ⅹ Activated，FⅩa），FⅩa激活凝血酶原生成凝血酶，发挥凝血作用。我公司自巴西矛头蝮蛇蛇毒中分离得到凝血因子Ⅹ激活剂（Coagulation Factor Ⅹ Activator，FⅩA），其为分子量为79000Da的单一组分的糖蛋白，含有一条重链和两条轻链，具有钙离子依赖性。体外研究表明，在Ca²⁺存在的条件下FⅩA可以特异性的水解FⅩ生成FⅩa，近而使人-枸橼酸血浆凝固。体内试验研究表明FⅩA可明显缩短正常小鼠的断尾出血时间，具有较好的止血作用，鉴于FⅩA高度特异性作用特点，初步判断对A型血友病小鼠也会有较好的止血效果，可缓解目前临床仅靠补充凝血因子Ⅷ治疗A型血友病的局面，可以降低患者的经济负担，具有较好的药物经济学价值。

目前，根据作用底物的不同可将FⅩA的活性测定方法分为两大类:第一大类为天然底物法，即以人血浆为底物，以FⅩA的加入血浆发生凝固的时间来进行FⅩA的活性测定，如公告号为CN101104847B的中国专利申请。该法在20世纪80年代初得到普遍应用，方法常规，但需目测判断血浆凝固时间，受检测者主观干扰，并且不同厂家的人质控血浆和普通人枸橼酸血浆FⅩ含量差异较大，血浆中FⅩ含量对FⅩA活性测定至关重要，因此导致FⅩA效价测试结果不一致。第二大类为生色底物法，即通过FⅩa水解生色底物产生有特征吸收的生色产物进行的活性测定，又可分为二步法和FⅩA外标法。二步法即在FⅩA作用于FⅩ一段时间后加入终止剂，同时加入生色底物，根据特定时间内FⅩa的生成量计算FⅩA的活性。此方法需要引入FⅩa标准品，不能排除在活化的早期阶段时间和FⅩa生成量之间可能存在的非线性关系（李晶，梁成罡，杨化新等，生色底物连续速率测定圆斑蝰蛇凝血因子Ⅹ激活剂的活性[J].中国新药杂志，2007,16（18）：1419），因而不能精确地反映FⅩA的活性作用特点。FⅩA外标法（如公开号为CN102798598的中国专利申请）通过检测FⅩA标准品不同浓度在405nm处ρNA的吸光度，绘制标准曲线计算待测样品效价。此方法需提供FⅩA标准品，而FⅩA标准品标定又以血浆为底物目测方法标定，同样会出现上述提到的第一类方法的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种凝血因子Ⅹ激活剂的效价测定方法，该方法是以凝血因子Ⅹ（FⅩ）为反应底物，FⅩA激活FⅩ生成活化的凝血因子Ⅹ（FⅩa），FⅩa水解生色底物生成显黄色的对硝基苯胺（ρNA），在405nm波长有最大吸收，在FⅩ和生色底物足量的条件下，ρNA浓度与FⅩA的活性相关且在一定的范围内具有线性相关性，依据单位时间内生成ρNA的物质的量计算FⅩA的活性。本发明的效价测定方法可以准确的测定FⅩA效价，不用FⅩA和FⅩa标准品间接计算待测品效价，减少测试过程中误差，准确、方便、快捷。该方法具有较好的重复性、精密度、耐用性和线性，能够稳定的测定FⅩA的效价。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种凝血因子Ⅹ激活剂的效价测定方法，所述方法包括：

1）将凝血因子Ⅹ用缓冲溶液A稀释，得到凝血因子X的浓度为1.0U/ml～2.0U/ml的溶液1；

2）将凝血因子Ⅹ激活剂用缓冲溶液B稀释，制成溶液2；

3）将生色底物用去离子水溶解，得到浓度为1.5mg/ml～3.0mg/ml的溶液3；

4）将溶液1、溶液2、缓冲溶液C混匀，置37℃水浴中保温8~12分钟，加入缓冲溶液D和溶液3，混匀，405nm波长下测定第0、1、2、3分钟光吸收值，以缓冲溶液B代替溶液2，同法操作，作为空白对照；所述溶液1、溶液2、溶液3、缓冲溶液C和缓冲溶液D的体积比为1∶1∶1∶1∶1；

5）按计算公式计算对硝基苯胺浓度，得到凝血因子Ⅹ激活剂效价；

其中，所述缓冲溶液A是以Na⁺离子含量计浓度为0.02mol/L的磷酸氢二钠缓-磷酸二氢钠冲液、以三羟甲基氨基甲烷含量计浓度为0.02mol/L的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液或以Na⁺离子含量计浓度为0.02mol/L的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液，均含有0.1mol/L氯化钠和0.001mol/L盐酸苯甲脒，pH为7.4；

所述缓冲溶液B是以Na⁺离子含量计浓度为0.01mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、以三羟甲基氨基甲烷含量计浓度为0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液或以Na⁺离子含量计浓度为0.01mol/L>

所述缓冲溶液C是以Na⁺离子含量计浓度为0.1mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、以三羟甲基氨基甲烷含量计浓度为0.1mol/L的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液或以Na⁺离子含量计浓度为0.1mol/L的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液，均含有0.3mol/L氯化钠、0.002mol/L盐酸苯甲脒和0.01mol/L氯化钙，pH为7.5；

所述缓冲溶液D是以Na⁺离子含量计浓度为1mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、以三羟甲基氨基甲烷含量计浓度为1mol/L的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液或以Na⁺离子含量计浓度为1mol/L的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液，均含有0.75mol/L氯化钠、0.05mol/LEDTA-Na₂，pH为8.3；

所述溶液2浓度控制在能使生成的ρNA浓度为0.05μmol·ml^-1·min^-1～0.25μmol·ml^-1·min^-1；

所述的计算公式为

△A_样表示样品的第t分钟与第0分钟的吸收值的差值；△A_空表示空白对照品的第t分钟与第0分钟的吸收值的差值；t代表以min计的样品和空白对照的测定时间，t﹥0，优选地，t=1、2或3；V_t表示以ml计的反应总体积；10.4表示以ml·μmol^-1·cm^-1计的ρNA的摩尔吸光系数；1表示以cm计的光程；V_s为以ml计的FⅩA供试品体积。

在根据本发明的一个实施方案中，所述溶液1的浓度为1.0U/ml～1.5U/ml；优选为1.25U/ml。

在根据本发明的一个实施方案中，所述溶液3的浓度为1.5mg/ml～3.0mg/ml；优选为1.5mg/ml。

在根据本发明的一个实施方案中，所述凝血因子Ⅹ为人源或牛源凝血因子。

在根据本发明的一个实施方案中，所述生色底物为含有对硝基苯胺基团（ρNA）的短肽或其盐酸盐。

在根据本发明的一个实施方案中，所述凝血因子Ⅹ激活剂来自蛇毒。

在根据本发明的一个实施方案中，所述蛇毒选自矛头蝮蛇蛇毒、茂基蝮蛇蛇毒和圆斑蝰蛇蛇毒中的一种或多种。

本发明人在研究中发现，在凝血因子Ⅹ和生色底物足量的条件下，对硝基苯胺的生成量仅与凝血因子Ⅹ激活剂的量有关，且具有较好的线性相关性，相关系数R≥0.99。该方法的重复性较好，RSD为2.1%。中间精密度及耐用性较好，包括不同试验测试者试验RSD为2.8%、不同厂家生色底物测试RSD为2.2%、不同厂家凝血因子Ⅹ测试RSD为6.8%、不同厂家紫外分光光度计测试RSD为2.6%。该方法的回收率为100.2%。由此可见该方法能够准确、稳定测试出凝血因子Ⅹ激活剂的效价，明显优于血浆底物法和FⅩa、FⅩA标准品的外标法，能够提供准确的临床使用剂量，提高临床用药的安全性和有效性。

附图说明

图1为FⅩA供试浓度确定中FⅩA稀释倍数倒数与ρNA浓度的线性关系曲线。

图2为计算回收率的线性关系曲线。

具体实施方式

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅作为更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

实施例1凝血因子Ⅹ（FⅩ）和生色底物优选浓度确定

FⅩ选择人源、生色底物选择S-2765。将FⅩ用pH7.4 0.02mol/L Tris-HCl缓冲液（含0.1mol/L NaCl、0.01mol/L盐酸苯甲脒）分别配制成0.75U/ml、1.0U/ml、1.25U/ml、1.5U/ml、2.0U/ml的溶液，作为溶液1。取FⅩA供试品用pH8.0 0.01mol/L Tris-HCl缓冲液适度稀释，作为溶液2。取生色底物S-2765，用去离子水溶解并分别稀释成浓度为1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml、2.5 mg/ml、3.0mg/ml的溶液，作为溶液3。配制pH7.5 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液（含NaCl 0.3mol/L、盐酸苯甲脒0.002mol/L、CaCl₂>2>

表1 FⅩ和S-2765的优选浓度结果。

结果显示，本发明中FⅩ浓度在1.0U/ml～2.0 U/ml范围内，S-2765浓度在1.5mg/ml～3.0mg/ml范围内，ρNA的浓度测定结果较为稳定，并且FⅩ和S-2765是足量的。

实施例2FⅩA供试浓度的确定

将FⅩ（人源）用pH7.4 0.02mol/L Tris-HCl缓冲液（含0.1mol/L NaCl、0.01mol/L盐酸苯甲脒）缓冲液配制成1.25 U/ml的溶液，作为溶液1；取FⅩA供试品用pH8.0 0.01mol/LTris-HCl缓冲液分别稀释20000倍、12500倍、8333倍、5000倍、4000倍、3030倍，作为溶液2；取生色底物S-2765，用去离子水溶解并稀释成浓度为1.5mg/ml的溶液，作为溶液3；配制pH7.5 0.2mol/L Tris-HCl缓冲液（含NaCl 0.6mol/L、盐酸苯甲脒0.004mol/L、CaCl₂0.02mol/L）作为缓冲溶液C；配制pH8.3>2>

对硝基苯胺（ρNA）的浓度范围确定结果如表2所示，近而限定FⅩA的最佳工作浓度范围。

表2FⅩA浓度确定结果。

以供试品稀释倍数的倒数为横坐标，ρNA浓度为纵坐标，绘制曲线（见图1），线性方程为Y=856.61X+0.00162，R²=0.99118。由表2数据可以得出，本发明中将FⅩA稀释适宜浓度使生成的ρNA浓度在0.042～0.274μmol·ml^-1·min^-1范围内，FⅩA的效价稳定。在本发明中，适宜稀释FⅩA供试品，使生成的ρNA浓度在0.05μmol·ml^-1·min^-1～0.25μmol·ml^-1·min^-1的范围内。

实施例33批FⅩA效价测定

将FⅩ（人源）用pH7.4 0.02mol/L Tris-HCl缓冲液（含0.1mol/L NaCl、0.01mol/L盐酸苯甲脒）缓冲液配制成1.25 U/ml的溶液，作为溶液1；取3批FⅩA供试品用pH8.0 0.01mol/LTris-HCl缓冲液适度稀释，能够使ρNA的浓度在0.05μmol/ml～0.25μmol/ml的范围内，作为溶液2；取生色底物S-2765，用去离子水溶解并稀释成浓度为1.5mg/ml的溶液，作为溶液3；配制pH7.5 0.2mol/L Tris-HCl缓冲液（含NaCl 0.6mol/L、盐酸苯甲脒0.004mol/L、CaCl₂0.02mol/L）作为缓冲溶液C；配制pH8.3>2>

以批号为150107FⅩA为例计算效价，V_t表示反应总体积1ml，V_s表示FⅩA供试品体积0.2ml，>样表示样品第3分钟与第0分钟的吸收值的差值1.092，△A_空表示空白对照品第3分钟与第0分钟的吸收值的差值0.000，代入公式计算得出ρNA的浓度为0.175μmol·ml^-1·min^-1，150107批次FⅩA稀释倍数为5000，得出效价为875U/ml，蛋白含量为0.155mg/ml，比活力为875/0.155=5645U/mg。

本发明中FⅩA活力单位定义：在37℃，pH 8.0条件下，1min内生成1μmol对硝基苯胺所需要的酶量，定义为1单位。

按实施例3方法测定3批次凝血因子Ⅹ激活剂效价，结果如表3。

表33批FⅩA的效价测定结果。

实施例4FⅩA效价测定方法重复性

按实施例3方法测定FⅩA效价，取供试品150107测试，重复6次，记录数据，结果如表4。

表4FⅩA效价测定方法重复性结果。

实施例5> FⅩA效价测定方法中间精密度考察

按实施例3方法测定FⅩA效价，取供试品150107，不同人员不同时间进行测试，记录测试数据，结果如表5。

表5FⅩA效价测定方法中间精密度结果。

实施例6> FⅩA效价测定方法耐用性考察

1）不同厂家生色底物S-2765测定FⅩA效价稳定性

按实施例3方法测定，取供试品150107，用不同厂家生色底物S-2765测定效价，记录测试数据，结果如表6。

表6 不同厂家S-2765测定FⅩA效价结果。

2）不同厂家反应底物FⅩ测定FⅩA效价的稳定性

按实施例3方法测定FⅩA效价，取供试品150107，用不同厂家反应底物FⅩ测定，记录测试数据，结果如表7。

表7 不同厂家FⅩ测定FⅩA效价结果。

3）不同型号紫外分光光度计测定FⅩA效价的稳定性

按实施例3方法测定FⅩA效价，取供试品150107，用不同型号紫外分光光度计测定效价，记录测试数据，结果如表8。

表8 不同型号仪器测定FⅩA效价结果。

实施例7> FⅩA效价测定方法的线性及准确度（回收率）

按实施例3方法测定FⅩA效价，取供试品150107，分别稀释8333倍、7143倍、6250倍、5000倍、4000倍，记录测试数据，结果如表9。

表9线性及回收率结果。

以供试品稀释倍数的倒数为横坐标，ρNA浓度为纵坐标，绘制曲线（见图2），线性方程为y=848.13x+0.00282 R²=0.99356，线性良好。

将稀释倍数倒数带入标准曲线，计算理论效价，实测效价与理论效价比值为回收率，回收率平均值为100.2%，RSD=2.6%，本发明方法准确度良好。

实施例8> 本发明中FⅩA效价测定方法与直接血浆为底物法测定结果的比较

1）普通人血浆为直接底物法测定FⅩA的效价

取FⅩA供试品，批号150107，用pH8.0的0.01mol/L Tris-HCl缓冲液稀释800倍，作为供试品溶液。取普通人血浆（血站来源），37℃水浴完全融化，备用。用去离子水配制氯化钙溶液，浓度为0.02mol/L，备用。

取0.2ml普通人血浆至小试管中于37试预热2min，加入0.1ml供试品溶液，加入0.1ml 0.02mol/L氯化钙溶液，摇匀，计时，记录血浆出现白色絮团的时间，测定结果如表10所示。

由下表10可以看出，血浆之间测试结果差异较大，不能准确稳定测试出FⅩA效价。

表10 普通人血浆为直接底物测定FⅩA效价结果。

2）人凝血质控血浆为直接底物法测定FⅩA的效价

取FⅩA供试品，批号150107，用pH8.0的0.01mol/L Tris-HCl缓冲液稀释800倍，作为供试品溶液。取人凝血质控血浆（分别购于两个厂家），每个厂家取2批，分别用去离子水1ml溶解，备用。用去离子水配制氯化钙溶液，浓度为0.02mol/L，备用。

取0.2ml人凝血质控血浆至小试管中于37至预热2min，加入0.1ml供试品溶液，加入0.1ml 0.02mol/L氯化钙溶液，摇匀，计时，记录血浆出现白色絮团的时间，测定结果如表11所示。

由下表11可以看出，同一生产厂家不同批次血浆之间测试结果存在差异，不同厂家之间的血浆测试结果也存在差异，不能准确稳定测试出FⅩA效价。

表11 人凝血质控血浆为直接底物测定FⅩA效价结果。

尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

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