广西圆斑蝰蛇毒凝血因子X激活剂的分离纯化及其止血作用的研究

摘要

凝血因子X激活剂可以在血管破损处激活因子X，促进凝血酶生成，加速凝血过程，以达到迅速止血的目的，因而具有潜在利用价值，有可能开发为强效的止血药。本文应用层析方法从广西圆斑蝰蛇毒中分离纯化凝血因子X激活剂(factor Xactivator from Russel1's viper venom，RVV-VA)并观察其部分活性影响因素和止血作用，旨在为进一步研发提供实验资料。
　　 1.RVV-VA的分离纯化
　　 广西圆斑蝰蛇粗毒过HiPrep16/10 DEAE FF阴离子交换色谱，获得6个蛋白质组分。采用测定复钙化时间，对各洗脱峰进行活性测定，发现组分V的促凝活性具有钙依赖性。该组分浓缩后经Superdex G-75凝胶过滤色谱纯化获4个蛋白峰，其中第一峰具有凝血因子X激活活性。该组分经10％SDS-PAGE，在非还原性条件下呈单一蛋白带，分子量约为97.8kDa，还原性条件下呈一条重链(约76.3kDa)和一条轻链(约21.5kDa)，暂名为RVV-VA。
　　 2.影响RVV-VA活性的因素
　　 在体外观察不同条件下RVV-VA对家兔血浆活化部分凝血活酶时间(APTT)的影响，了解影响RVV-VA活性的因素。结果显示，RVV-VA在pH6～9范围内活性最高，在温度低于40℃时活性变化不大，温度高于40℃时活性迅速下降。EDTA可完全抑制RVV-VA活性，L-半胱氨酸也可使RVV-VA活性显著下降，但抑肽酶和苯甲基磺酰氟化物(PMSF)对其无影响。
　　 3.RVV-VA对正常小鼠出血时间(BT)和凝血时间(CT)的影响
　　 小鼠尾静脉注射RVV-VA0.313mU/kg～10mU/kg，用断尾出血法和试管法测定小鼠BT和CT以选定实验的给药剂量。结果显示，在0.625mU/kg～10mU/kg剂量范围内，小鼠BT和CT均随RVV-VA剂量增加而缩短(p＜0.05或p＜0.01)，其BT分别为3.53±0.25min、2.88±0.24min、2.95±0.20min、2.35±0.27min及2.58±0.26min，CT分别为2.45±0.26min、2.48±0.28mi n、1.78±0.25min、1.83±0.21min及1.55±0.20min，从中选择0.625mU/kg、2.5mU/kg、10mU/kg作为后续实验的给药剂量。
　　 4.RVV-VA对凝血功能障碍小鼠CT的影响
　　 采用肝素化和华法林化小鼠模型观察静脉注射RVV-VA对凝血功能障碍小鼠CT的影响。结果显示，肝素模型组小鼠CT由1.53±0.30min(对照组)延长至5.25±0.33min，华法林模型组小鼠CT由1.58±0.24min(对照组)延长至4.43±0.41min，表明造模成功。与相应的模型组比较，RVV-VA10mU/kg和2.5mU/kg组小鼠CT分别为3.70±0.28min和4.88±0.27min，显著缩短肝素化小鼠的CT(p＜0.01或p＜0.05)。RVV-VA10mU/kg、2.5mU/kg和0.625mU/kg组小鼠CT分别为2.20±0.26min、3.23±0.32min和3.98±0.30min，显著缩短华法林化小鼠的CT(p＜0.01或p＜0.05)，说明RVV-VA能一定程度减少肝素和华法林所致的出血倾向。
　　 5.RVV-VA对家兔全血凝固时间的影响
　　 观察家兔静脉注射RVV-VA后，CT在24h内的变化情况，以了解RVV-VA的药效及作用特点。结果发现家兔iv RVV-VA20mU/kg、5mU/kg或1.25mU/kg10min后CT分别为2.75±0.35min、3.13±0.34min及3.46±0.49min，均比给药前的4.08±0.30min、4.17±0.41min及4.21±0.37min显著缩短(p＜0.01)。给药30min后，药效达高峰，其CT分别为2.33±0.26min、2.54±0.29min及2.88±0.41min。至给药后12h，RVV-VA20mU/kg和5mU/kg组CT分别为3.38±0.28min和3.63±0.26min，仍比给药前显著缩短(p＜0.01或p＜0.05)，提示RVV-VA具有较长的促凝作用。
　　 6.RVV-VA对家兔肝脏创伤出血模型出血时间和出血量的影响
　　 采用家兔肝脏创伤出血模型，观察静脉注射RVV-VA前后家兔肝脏切口出血时间和出血量的变化情况。结果显示，家兔iv RVV-VA20mU/kg、5mU/kg或1.25mU/kg后肝脏切口出血时间分别为1.19±0.05min、1.39±0.10min及1.58±0.20min，均比给药前的2.15±0.25min、2.18±0.21min及2.24±0.21min显著缩短(p＜0.01)；给药后出血量分别为34.5±3.7mg、35.9±2.6mg及41.0±2.1mg，均比给药前的77.0±7.8mg、79.0±2.0mg及71.4±2.4mg显著减少(p＜0.01)，说明RVV-VA对破损的血管有明显的止血作用。
　　 7.RVV-VA对家兔APTT、PT和TT的影响
　　 家兔iv RVV-VA20mU/kg、5mU/kg或1.25mU/kg，30min后测定家兔APTT、P1和TT。结果发现与对照组相比，RVV-VA对家兔APTT、PT、TT无影响，说明RVV-VA对血管没有损伤的动物没有促凝血作用。
　　 结论：用层析方法可以从广西圆斑蝰蛇毒中分离得到凝血因子X激活剂，该激活剂具有较强的止血活性。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一章 广西圆斑蝰蛇毒凝血因子X激活剂的分离纯化及鉴定

材料与方法

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

第二章 RVV-VA生物活性测定

材料与方法

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

第三章、RVV-VA止血作用的动物实验观察

材料与方法

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

结论

参考文献

致谢

综述 蛇毒凝血因子X激活剂的研究进展