一种肿瘤靶向多功能纳米递药系统及制备方法和用途

摘要

本发明公开了一种肿瘤靶向多功能纳米递药系统及制备方法和用途，其系统包括肿瘤穿透肽RGERPPR修饰的多功能纳米粒及抗肿瘤药物，所述多功能纳米粒为T1‑T2双模磁共振造影剂；所述抗肿瘤药物为阿霉素或表阿霉素；其抗肿瘤药物在系统中重量百分比为10%‑35%。该递药系统具有以下特征：粒径在60‑200nm，呈球形；将T1造影剂Gd‑DTPA与T2造影剂Fe3O4同时利用，提供高度准确的诊断信息；提高了药物的水溶性和生物相容性，提高了药物的疗效和生物利用度；可用于静脉注射，由RGERPPR介导作用和肿瘤EPR效应靶向至肿瘤组织，该系统对脑胶质瘤肿瘤生长有明显抑制作用；该递药系统可用于肿瘤诊断和肿瘤治疗的诊疗一体化。

说明书

技术领域

本发明属药物制剂领域，涉及一种多肽修饰的靶向纳米递药系统，具体地说是肿瘤穿透肽RGERPPR修饰的主动靶向多功能纳米递药系统及制备方法和用途。

背景技术

癌症是世界上大多数国家面临的主要公共卫生问题，是全球第二大死亡原因。目前，化学疗法仍然是临床中治疗癌症的最有效的方法之一。然而，由于常规的化疗药物在体内无法被实时示踪，其在肿瘤组织的分布情况无法得知，因此无法为药物的临床有效性提供及时反馈。这也是肿瘤化疗无法实现个体化治疗的主要原因，被很多科学家认为是目前传统化疗临床上面临的主要问题，急需一种有效技术加以解决。

诊疗一体化整合了癌症诊断和癌症治疗的功能，已经成为癌症治疗的新趋势。随着纳米科学和纳米技术的快速发展，纳米医学的建立和发展为癌症等主要疾病的早期诊断和精准治疗提供了一个新的多功能平台。新型纳米探针可以整合诊断和治疗的功能，可以同时实现肿瘤的成像和治疗。

核磁共振成像(MRI)是一种无创伤性诊断技术，具有较高的空间分辨率，目前临床上广泛应用于肿瘤成像。MRI造影剂通常用来增强正常组织和病变组织之间的对比度，从而提高诊断的准确性。经过多年来的发展，造影剂大致分为T1造影剂和T2造影剂，目前T1造影剂主要提供更明亮的图像，而T2造影剂通常是产生更暗的图像。虽然T1和T2造影剂的发展已经取得了成功，但是这种单一模式的造影剂各有优缺点，日益面临着新的挑战。因此，对T1-T2双模式核磁共振成像造影剂的开发是极具吸引力的，因为两个不同成像模式(T1和T2)可以同时利用，提供高度准确的诊断信息。

阿霉素是常用的抗肿瘤药物之一，抗瘤谱较为广泛，属于细胞周期非特异性药物，对处于各生长周期的肿瘤细胞都会有杀伤作用。但是其临床疗效受制于严重的心毒性等副作用，故治疗效果并不是太理想。靶向药物递送系统，尤其是配体修饰的肿瘤主动靶向递药系统，由于其精确的肿瘤靶向能力，增强了抗肿瘤功效和降低了全身毒副作用等优点而受到越来越多的关注。靶向配体如肽，抗体及其片段，在肿瘤靶向中起关键作用，其通过与肿瘤组织中特异性表达的受体相互作用而介导纳米递药系统的细胞内吞。NPR-1是一种在胶质母细胞瘤和肿瘤血管内皮细胞表面均有高表达的受体。RGERPPR多肽，NPR-1的特异性配体，是一种肿瘤穿透肽，具有穿透肿瘤血管壁和肿瘤组织的能力。RGERPPR修饰的递药系统与肿瘤血管内皮细胞表面和肿瘤细胞表面NPR-1受体特异性结合，穿透肿瘤血管壁和肿瘤细胞，进入肿瘤细胞，发挥阿霉素的抗肿瘤生长作用，实现对胶质母细胞瘤靶向治疗的目的。并且可以提高递药系统的肿瘤选择性，改善了药动学行为，增加了耐受剂量，减少了副作用，并提高了抗肿瘤效果。

发明内容

本发明的目的在于针对递药系统在体内缺少示踪、疗效差的问题，提供一种肿瘤穿透肽RGERPPR修饰的肿瘤靶向多功能纳米递药系统，Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE用于肿瘤诊断和肿瘤治疗的诊疗一体化。本发明的递药系统Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE可以通过静脉注射给药，由RGERPPR介导作用和肿瘤EPR效应靶向至肿瘤组织，杀死肿瘤细胞，另外，其将T1造影剂Gd-DTPA与T2造影剂Fe₃O₄同时利用，可以通过核磁共振成像示踪纳米药物，提供高度准确的诊断信息，从而实现肿瘤诊断和肿瘤治疗的诊疗一体化。

本发明的目的是这样实现的：

一种肿瘤靶向多功能纳米递药系统，Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE，特点在于该递药系统由肿瘤穿透肽RGERPPR修饰的多功能纳米粒及抗肿瘤药物构成，所述多功能纳米粒为T1-T2双模磁共振造影剂；所述抗肿瘤药物为阿霉素或表阿霉素；其抗肿瘤药物在系统中重量百分比为10％-35％。其结构如下：

其中：递药系统为纳米粒，粒径在60-200nm，粒径分布PDI为0.10-0.60，n为聚合度，n＝9-227。

一种上述纳米递药系统的制备方法，该方法包括以下具体步骤：

步骤1：制备Fe₃O₄纳米粒子

1.39-5.56g油酸铁在30℃真空干燥箱静置24小时后，加入0.24-0.96mL十八烯；混合物以升温速率3.3℃min^-1加热至320℃，然后保持在该温度下反应60分钟。反应后，冷却至室温，经5-20mL正己烷和20-80mL丙酮洗涤、离心，得到Fe₃O₄纳米粒子；

步骤2：制备Fe₃O₄/SiO₂纳米粒子

3.4-13.6mg Fe₃O₄纳米粒子和4-16mL>3O₄/SiO₂纳米粒子；

步骤3：制备Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂纳米粒子

1-4g CTAC和Fe₃O₄/SiO₂纳米粒子溶解在10-40mL水中，超生30分钟。然后，加入41-164μLTEA，80℃反应60分钟。再加入0.75-3mL>3O₄/SiO₂/mSiO₂纳米粒子；

步骤4：制备Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂-NH₂纳米粒子

25-100mg Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂溶解在25-100mL乙醇中，加入50-200μL>3O₄/SiO₂/mSiO₂-NH₂纳米粒子；

步骤5：制备Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂-(Gd-DTPA)纳米粒子

25-100mg DTPA和Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂-NH₂溶解在10-40mL水中，40℃搅拌3小时，再加入50-200mgGdCl₃，搅拌12小时，用水洗涤，收集Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂-(Gd-DTPA)纳米粒子。

步骤6：制备Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂-(Gd-DTPA)-PEG-RGE纳米粒子

25-100mg RGERPPR-PEG-COOH和Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂-(Gd-DTPA)溶解在10-40mL乙醇中，40℃搅拌3小时，用乙醇和水洗涤，收集Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂-(Gd-DTPA)-PEG-RGE纳米粒子。

步骤7：制备Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE纳米粒子

0.5-2mL溶度为0.33mg/mL的DOX PBS溶液和Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂-(Gd-DTPA)-PEG-RGE，搅拌12小时，收集Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE纳米粒子，该纳米粒子为所述纳米递药系统，其紫外测量DOX载药量为10-35％。

所述RGERPPR-PEG-COOH中PEG分子量为400-10000。

所述离心分离的转速为2000-12000转/分钟，5-30分钟。

所述纳米递药系统的应用，特点在于该递药系统用于脑胶质瘤治疗药物的靶向递送。

对本发明的纳米递药系统分别作了如下测定：

测定所述纳米递药系统的粒径；

测定所述纳米递药系统弛豫率；

测定所述纳米递药系统对U87MG细胞的摄取；

测定所述纳米递药系统在脑胶质瘤裸鼠体内的核磁共振成像；

测定所述纳米递药系统对脑胶质瘤肿瘤生长的抑制作用。

测定结果表明，本发明的纳米递药系统可用作肿瘤影像诊断示踪药物，也可用作抗肿瘤药物的递送，肿瘤诊断和肿瘤治疗的一体化。

本发明的递药系统提供一种肿瘤穿透肽RGERPPR修饰的肿瘤靶向多功能纳米递药系统，Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE用于肿瘤诊断和肿瘤治疗的诊疗一体化。本发明的递药系统Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE可以通过静脉注射给药，由RGERPPR介导作用和肿瘤EPR效应靶向至肿瘤组织，杀死肿瘤细胞，另外，其将T1造影剂Gd-DTPA与T2造影剂Fe₃O₄同时利用，可以通过核磁共振成像示踪纳米药物，提供高度准确的诊断信息，从而实现肿瘤诊断和肿瘤治疗的诊疗一体化。

附图说明

图1为本发明Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE递药系统制备路线图；

图2为本发明Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE透射电镜图；

图3为本发明Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE弛豫率实验图；

图4为本发明Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE细胞定性定量摄取实验图；

图5为本发明Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE核磁共振成像实验图；

图6为本发明Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE动物疗效实验图。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面用实施例来进一步阐明本发明，但本发明的内容不仅仅局限于下面实施例。

实施例1

制备Fe₃O₄纳米粒子

2.78g油酸铁在30℃真空干燥箱静置24小时后，加入0.48mL十八烯。混合物以升温速率3.3℃min^-1加热至320℃，然后保持在该温度下反应60分钟。反应后，冷却至室温，经10mL正己烷和40mL丙酮洗涤、离心，得到Fe₃O₄纳米粒子。

实施例2

制备Fe₃O₄/SiO₂纳米粒子

6.8mg Fe₃O₄纳米粒子和8mL>3O₄/SiO₂纳米粒子。

实施例3

制备Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂纳米粒子

2g CTAC和Fe₃O₄/SiO₂纳米粒子溶解在20mL水中，超生30分钟。然后，加入82μLTEA，80℃反应60分钟。再加入1.5mL>3O₄/SiO₂/mSiO₂纳米粒子。

实施例4

制备Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂-NH₂纳米粒子

50mg Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂溶解在50mL乙醇中，加入100μL>3O₄/SiO₂/mSiO₂-NH₂纳米粒子。

实施例5

制备Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂-(Gd-DTPA)纳米粒子

50mg DTPA和Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂-NH₂溶解在20mL水中，40℃搅拌3小时，再加入100mgGdCl₃，搅拌12小时，用水洗涤，收集Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂-(Gd-DTPA)纳米粒子。

实施例6

制备Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂-(Gd-DTPA)-PEG-RGE纳米粒子

50mg RGERPPR-PEG-COOH和Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂-(Gd-DTPA)溶解在20mL乙醇中，40℃搅拌3小时，用乙醇和水洗涤，收集Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂-(Gd-DTPA)-PEG-RGE纳米粒子。

实施例7

制备Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE纳米粒子

1mL溶度为0.33mg/mL的DOX PBS溶液和Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂-(Gd-DTPA)-PEG-RGE，搅拌12小时，收集Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE纳米粒子，紫外测量DOX载药量为27.2％。

实施例8

将Fe₃O₄(图2A)、Fe₃O₄/SiO₂(图2B)、Fe₃O₄/SiO₂/SiO₂(图2C)和Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂(图2D)形态通过透射电子显微镜来观察，具体如下：(1)滴一滴样品溶液于铜网上，(2)空气中干燥约10分钟，用滤纸吸去多余的液体，(3)待样品干燥后置于透射电镜下观察。图2结果显示纳米粒形态均比较规则，呈球形。

实施例9

使用3T MRI测量不同Gd浓度下探针的T1弛豫时间和T2弛豫时间。以Gd浓度和驰豫时间1/T1的线性曲线的斜率计算相应的r1，以Fe浓度和驰豫时间1/T2的线性曲线的斜率计算相应的r2。Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE稀释在蒸馏水中，Gd浓度范围为0.1-0.5mM。将样品转移到96孔板中，并用以下参数测量T1弛豫时间：TR＝7000ms，TE＝11ms，TI＝24，100，200，400，600，900，1200，2000，3000和5000ms，FOV＝120×85mm，average＝1。以下参数测量T2弛豫时间：TR＝3000ms，TE＝14.3ms，FOV＝87x280mm，matrix＝240x768，slice>-1S^-1，Fe₃O₄的r2弛豫率36.89mM^-1S^-1。

实施例10

体外细胞摄取：以U87MG细胞为模型，将细胞以3×10⁴cells/ml的密度种于24孔板中培养24小时，然后用载有荧光染料DIO的Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG和Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE药物处理4h。加药处理后用PBS洗涤三次，分别用激光共聚焦定性和流式细胞仪定量评价细胞摄取情况。用激光共聚焦定性分析需要将细胞核用Hochest染成蓝色。流式细胞仪分析的细胞先用PBS洗涤三次，用用PBS洗涤，消化、离心，将沉淀重悬，流式细胞仪检测。如图4B所示，激光共聚焦结果定性观察显示，肿瘤穿透肽修饰的Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE容易被细胞摄取。流式细胞仪定量考察结果也显示，Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE纳米粒子容易被细胞摄取。

实施例11

进行MR成像研究。在裸鼠接种U87MG细胞两周后，通过腹膜内注射戊巴比妥钠(50μL，2.5％，50mg/kg)将小鼠(n＝3)麻醉。MR图像在具有动物线圈的3T MRI扫描仪上获得。通过尾静脉以0.07mmol-Gd/kg体重的剂量注射Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE(CT1和D>3O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG(A>3O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE在8小时有较好的造影效果，肿瘤穿透肽RGERPPR介导作用和肿瘤EPR效应使Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE在肿瘤部位富集，为肿瘤诊断和肿瘤治疗的诊疗一体化提供了可行性。

实施例12

将U87MG细胞按常规条件(37℃，5％CO₂)培养，待细胞融合度达到80-90％时，用含EDTA的0.25％胰酶消化细胞并离心收集，用PH>6个/mL的单细胞悬液，用1mL注射器将细胞接种到裸鼠的右肩皮下，每只裸鼠接种0.1mL，当肿瘤长至100-120mm³时备用。当肿瘤长至100-120mm³时(记作0天)，将荷瘤小鼠随机分成4组，每组6只，分别设为生理盐水对照组，DOX(5mg/kg)组，Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG(5mg/kg)组，Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE(5mg/kg)组，尾静脉注射给药,考察如下指标：

肿瘤生长曲线：每两天用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，根据公式v＝1/2(长径*短径²)，计算肿瘤的体积，绘制肿瘤体积随时间变化的生长曲线。

疗效实验结果如图6所示，与生理盐水对照组相比，Fe₃O₄/SiO₂/mSiO₂/DOX-(Gd-DTPA)-PEG-RGE组表现出明显的抑制肿瘤生长的效果。