一种用于检测大鼠鼠源性成分的特异性引物组及其应用

摘要

本发明涉及一种用于检测大鼠鼠源性成分的特异性引物组及其应用。所述用于检测大鼠鼠源性成分的特异性引物组，由一对特异性引物和特异性探针组成，上游特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明设计的引物和探针具有良好的特异性和重复性，利用所述的引物和探针进行的实时荧光定量PCR法检测大鼠鼠源性成分，操作简便、耗时少、特异性高，实验结果清晰可见、易于判定，为快速检测大鼠鼠源性成分提供了新的途径。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测大鼠鼠源性成分的特异性引物组及其应用，特别涉及利用实时荧光定量PCR(聚合酶链式反应)法检测大鼠鼠源性成分的特异性引物和探针及其应用，属于动物源性成分检测技术领域。

背景技术

随着人民群众生活水平的日益提高，牛羊肉的消费量逐年增加。因牛羊肉价格高、加工企业小散乱多难以监管，"挂羊头卖狗肉"的现象屡禁不止，老鼠肉冒充价格昂贵的牛羊肉的事件偶有发生，老鼠肉直接冒充牛羊肉或掺杂在牛羊肉制品中流入老百姓的餐桌，造成了及其恶劣的社会影响，其对食用者造成巨大的人身伤害。老鼠由于自身携带多种病菌，是多种传染病病原的储存宿主和主要传染源，同时，老鼠肉所含的铅和砷等有毒有害物质的含量也远高于其他肉类，直接食用会给人们带来极大的身体危害和疫病传染风险，轻则中毒，重则死亡。但目前，尚没有大鼠鼠源性成分检测的国家标准或者行业标准，普通消费者乃至食药质监部门通过肉眼难以鉴别，而传统检测方法繁琐、耗时长也导致其检测存在极大难度。

荧光定量PCR(聚合酶链式反应)是PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时，探针结合在DNA任意一条单链上；PCR扩增时，Taq酶的5'端-3'端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。该技术目前已广泛应用于物种鉴别领域。

中国专利文献CN105648046A(申请号201410644049.0)公开了利用动物种属间特异性较强的线粒体DNA序列设计5种动物(绵羊、山羊、水貂、海狸鼠和鸭)种属特异性引物，通过PCR反应得到长度各不相同的特异性扩增片段，对扩增产物电泳检测，能够一次性、准确、稳定、简单快捷的鉴别绵羊肉、山羊肉、水貂肉、海狸鼠肉和鸭肉，以及混合或加工过的肉制品中的这五种肉的成分。该技术虽然可以区分上述五种动物，但由于引物的特异性，其无法区分大鼠鼠源性成分，特别是与大鼠遗传关系较近的诸如小鼠等来源的成分。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种用于检测大鼠鼠源性成分的特异性引物组及其应用，为大鼠鼠源性成分的检测提供技术支持，为标准检测方法的建立提供实验支撑，为打击肉类掺假行政执法提供有力的科学依据。

本发明技术方案如下：

一种用于检测大鼠鼠源性成分的特异性引物组，由一对特异性引物和特异性探针组成，上游特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

根据本发明优选的，所述特异性探针的核苷酸序列5’端连接有FAM荧光基团，3’端连接有TAMRA淬灭基团。

上述用于检测大鼠鼠源性成分的特异性引物组在制备检测大鼠鼠源性成分的检测试剂盒中的应用。

一种用于检测大鼠鼠源性成分的检测试剂盒，包括：

上述用于检测大鼠鼠源性成分的特异性引物组；

DNA提取试剂；

PCR反应试剂。

根据本发明优选的，所述的用于检测大鼠鼠源性成分的特异性引物组中，上游特异性引物的浓度为10μM，下游特异性引物的浓度为10μM，特异性探针的浓度为10μM。

根据本发明优选的，所述的DNA提取试剂为深加工食品DNA提取试剂盒。深加工食品DNA提取试剂盒为本领域常规市售产品，如天根生化科技有限公司等均有销售。

根据本发明优选的，所述的PCR反应试剂为2×RealStar Power Probe MixtureUNG和Rnase-free H₂O。

有益效果

1、本发明设计的引物和探针具有良好的特异性和重复性，利用所述的引物和探针进行的实时荧光定量PCR法检测大鼠鼠源性成分，操作简便、耗时少、特异性高，实验结果清晰可见、易于判定，为快速检测大鼠鼠源性成分提供了新的途径；

2、本发明所述的用于检测大鼠鼠源性成分的检测试剂盒，成本低、使用方便，能够快速检测大鼠鼠源性成分，并且准确率高，为打击肉类掺假提供有力的检测手段，具有显著的经济效益和应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例2涉及的PCR扩增曲线图；

图中:①实施例2中3个平行样的大鼠鼠源性成分的PCR扩增曲线；

图2为本发明实施例3涉及的PCR扩增曲线图；

图中:①鼠样本中大鼠鼠源性成分的PCR扩增曲线；②猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅、貂、狐狸、马、驴不同物种样本中大鼠鼠源性成分的PCR扩增曲线；

图3为本发明实施例4涉及的PCR扩增曲线图；

图中:①大鼠样品中3个平行试验的大鼠鼠源性成分的PCR扩增曲线；②小鼠样本中3个平行试验的大鼠鼠源性成分的PCR扩增曲线；

图4为本发明对比例1涉及的PCR扩增曲线图；

图中:①大鼠样本中2个平行试验的大鼠鼠源性成分的PCR扩增曲线；②小鼠样本中2个平行试验的大鼠鼠源性成分的PCR扩增曲线；③2个空白对照的扩增曲线；

具体实施方式

下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

试剂来源

深加工食品DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；

2×RealStar Power Probe Mixture UNG购自北京康润诚业生物科技有限公司生产；Rnase-free H₂O按本领域常规方制备；

实施例1

利用NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)网站核酸数据库采集大鼠、小鼠、家猪、野猪、家鸡、鲫鱼、山羊、绵羊、黄牛、牛、猪、鸡、鸭的动物线粒体DNA CyTB基因全序列。采用ClustalX进行不同物种间序列比对，分析不同物种间保守区域与非保守区域。选取能够将大鼠鼠源序列同其它物种相互区分的区域设计引物与探针，引物探针序列具有在鼠中完全同源，而在其它物种中不存在的多态性位点，故以此将鼠与其它物种区分开来。

用于检测大鼠鼠源性成分的特异性引物和探针根据Genbank中鼠的线粒体细胞色素b基因序列，通过与多物种进行同源性比对分析而设计合成的；

所述特异性引物的上游引物F的碱基序列为：5’-CCTACTTACTGTTCCAATATTC-3’，

所述特异性引物的下游引物R的碱基序列为：5’-GATGCTATGGTTAGGATTATG-3’，

所述特异性探针的碱基序列为：5’-fam-AACTCAGCAACAACAATCAACACA-tamra-3’；

一种用于检测大鼠鼠源性成分的检测试剂盒，包括：

用于检测大鼠鼠源性成分的特异性引物组；上游特异性引物的浓度为10μM，下游特异性引物的浓度为10μM，特异性探针的浓度为10μM；

DNA提取试剂为深加工食品DNA提取试剂盒；

PCR反应试剂为2×RealStar Power Probe Mixture UNG和Rnase-free H₂O。

实施例2

利用实施例1所述的检测试剂盒检测大鼠鼠源性成分的方法，步骤如下：

(1)取鼠肌肉组织1g研磨成糜状，然后按照深加工食品DNA提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)使用说明操作，提取DNA，经核酸蛋白分析仪测定提取的DNA的浓度为360ng/μL，纯度为1.90，备用；

(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增，设置三组平行实验；

所述PCR反应体系50μL，成分如下：

DNA模板1μL，浓度为10μM的上游特异性引物1μL，浓度为10μM的下游特异性引物1μL，浓度为10μM的特异性探针1μL，2×RealStar Power Probe Mixture UNG 25ul，剩余部分用Rnase-free H₂O补足；

所述PCR反应程序如下：

50℃5min；95℃10min；95℃15s，62℃15s，72℃35s，40个循环，在72℃采集荧光信号；

(3)测得三个平行样的Cp平均值为15.99<35，曲线有明显指数增长期，呈现阳性，则检出大鼠鼠源性成分，表明利用该引物和探针能够实现大鼠鼠源性成分的检测，且特异性和重复性良好。

大鼠鼠源性成分分析结果评价：三个平行实验的Cp分别为15.23；16.22；16.51，其Cp平均值为15.99<35，曲线有明显指数增长期，呈现阳性，说明样本中检出大鼠鼠源性成分，表明利用该引物和探针能够实现大鼠鼠源性成分的检测，且特异性和重复性良好。结果如图1所示。

本实施例涉及的特异性引物和探针结果有明显的单一“S”型扩增曲线，没有其他峰，Cp值小于35，实验结果清晰可见、易于判定，对大鼠鼠源性成分有针对性，引物和探针具有特异性性，只能合成单一物质。

本实施例涉及的特异性引物的碱基序列是由上海捷瑞生物工程有限公司合成的；实时荧光定量PCR仪为Roche(罗氏)生物科技公司生产的Light Cycler 480式实时荧光定量PCR；核酸蛋白分析仪为Biochrom(柏诺)有限公司生产的BioDrop-μLite式核酸蛋白分析仪；高速冷冻离心机是湖南湘仪实验设备有限公司生产的台式高速冷冻离心机；2×RealStar Power Probe Mixture UNG为北京康润诚业生物科技有限公司生产的；DNA提取试剂盒为天根生化科技有限公司生产的深加工食品DNA提取试剂盒。

实施例3

利用实施例1所述的检测试剂盒检测大鼠鼠源性成分的方法，步骤如下：

(1)取猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅、貂、狐狸、马、驴、大鼠不同物种样本的肌肉组织各1g，标记后研磨成糜状，然后按照深加工食品DNA提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)使用说明操作，提取DNA，经核酸蛋白分析仪测定提取的DNA的浓度为360ng/μL，纯度为1.90，备用；

(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增；

所述PCR反应体系50μL，成分如下：

DNA模板1μL，浓度为10μM的上游特异性引物1μL，浓度为10μM的下游特异性引物1μL，浓度为10μM的特异性探针1μL，2×RealStar Power Probe Mixture UNG 25ul，剩余部分用Rnase-free H₂O补足；

所述PCR反应程序如下：

50℃5min；95℃10min；95℃15s，62℃15s，72℃35s，40个循环，在72℃采集荧光信号；

(3)测得猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅、貂、狐狸、马、驴不同物种样本中的结果均无Cp值，扩增曲线无明显的指数增长期，呈现阴性，说明样本中均未检出大鼠鼠源性成分；鼠样本中Cp＝16.08＜35，且扩增曲线明显指数增长期，呈阳性，说明样本中检出大鼠鼠源性成分。表明利用该引物和探针能够实现大鼠鼠源性成分的检测，且特异性和重复性良好；结果如图2所示。

大鼠鼠源性成分分析结果评价：

本实施例涉及的特异性引物和探针结果有明显的单一“S”型扩增曲线，没有其他峰，Cp值小于35，实验结果清晰可见、易于判定，对大鼠鼠源性成分有针对性，引物和探针具有特异性性，只能合成单一物质。

本实施例涉及的特异性引物的碱基序列是由上海捷瑞生物工程有限公司合成的；实时荧光定量PCR仪为Roche(罗氏)生物科技公司生产的Light Cycler 480式实时荧光定量PCR；核酸蛋白分析仪为Biochrom(柏诺)有限公司生产的BioDrop-μLite式核酸蛋白分析仪；高速冷冻离心机是湖南湘仪实验设备有限公司生产的台式高速冷冻离心机；2×RealStar Power Probe Mixture UNG为北京康润诚业生物科技有限公司生产的；DNA提取试剂盒为天根生化科技有限公司生产的深加工食品DNA提取试剂盒。

实施例4

利用实施例1所述的检测试剂盒检测大鼠鼠源性成分的方法，步骤如下：

(1)取大鼠、小鼠样本的肌肉组织各1g，标记后研磨成糜状，然后按照深加工食品DNA提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)使用说明操作，提取DNA，经核酸蛋白分析仪测定提取的DNA的浓度为360ng/μL，纯度为1.90，备用；

(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增，设置三组平行实验；

所述PCR反应体系50μL，成分如下：

DNA模板1μL，浓度为10μM的上游特异性引物1μL，浓度为10μM的下游特异性引物1μL，浓度为10μM的特异性探针1μL，2×RealStar Power Probe Mixture UNG 25ul，剩余部分用Rnase-free H₂O补足；

所述PCR反应程序如下：

50℃5min；95℃10min；95℃15s，62℃15s，72℃35s，40个循环，在72℃采集荧光信号；

(3)测得小鼠样本中的结果无Cp值，扩增曲线无明显的指数增长期，呈现阴性，说明样本中均未检出大大鼠鼠源性成分；大鼠样本中Cp平均值为16.50＜35，且扩增曲线明显指数增长期，呈阳性，说明样本中检出大鼠鼠源性成分。表明利用该引物和探针能够实现大鼠鼠源性成分的检测，且特异性和重复性良好；结果如图3所示。

对比例1

如实施例4所述的方法，不同之处在于，特异性引物如下所示：

上游引物的碱基序列为:5’-CCAACTTATATGTGAAAATTCA-3’；

下游引物的碱基序列为:5’-TCGTGCATTATATAAATGATTAG-3’；

特异性探针的碱基序列为：5’-fam-TAGGACCTAAGCCCAATA-tamra-3’

如实施例4所述的方法，不同之处在于，特异引物分别采用对比例1中的特异性引物和探针，设置空白对照，设置2组平行实验，经检测，空白对照无Cp值，大鼠样本的大鼠鼠源性成分Cp平均值为28.30，小鼠样本的大鼠鼠源性成分Cp平均值为29.85，Cp值略微偏大；而且，二者无明显差异，结果表明在大鼠和小鼠样本中均能检出大鼠鼠源性成分，无法区分大小鼠样本。结果如图4所示。

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<110> 青岛正方元信公共卫生检测有限公司

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