食用菌病害宏基因组rRNA基因初步分析及特异性检测引物设计

摘要

随着食用菌生产的周年化、规模化的发展，食用菌病害对食用菌生产的影响成为目前主要面临的问题。但我国对于食用菌病害的研究基础相对薄弱，因此，加强对食用菌病害的深入研究是非常重要的。 本实验研究期间，针对山东省内草菇、鸡腿菇、平菇、金针菇、双孢菇、香菇等菇类共采集病害样品58份。其中真菌病害有16种，细菌病害7种。通过统计发现，在食用菌栽培过程中发菌期的病原微生物主要以真菌为主，褐斑及腐烂病大多都是细菌性的。 通过CTAB法、CTAB法结合DNA凝胶回收试剂盒法、SDS法及CTAB法后纯化4种DNA提取方法比较，得出最佳的病害样品宏基因组DNA提取方法为CTAB法结合DNA凝胶回收试剂盒法。 本研究主要以平菇黄腐病、双孢菇褐斑病、鸡腿菇黑头病、疑似金针菇胡桃肉状菌病4种食用菌病害作为研究材料，利用16S rDNA和18S rDNA通用引物分别对病害样品基因组DNA进行PCR扩增，其产物纯化后，连接转化并进行单克隆测序。序列分析结果表明:两种细菌性病害即平菇黄腐病和双孢菇褐斑病的病原微生物分别为荧光假单胞杆菌（Pseudomonas fluorescens）和假单胞杆菌（Pseudomonas sp.）。两种真菌性病害即鸡腿菇黑头病和疑似金针菇胡桃肉状菌病的病原微生物分别为轮枝菌(Lecanicilliumsp.)和Pezizomycetes sp.。 通过对所测病原菌序列与其相关菌的16S rDNA或18S rDNA序列进行同源位点排列和比对，利用Primer Premier5.0软件对每种病害设计出了1对相对最佳的特异引物。平菇黄腐病:PHF/PHR;双孢菇褐斑病:SHF/SHR;鸡腿菇黑头病:JHF/JHR;疑似金针菇胡桃肉状菌病:JWF/JWR。 对所设计的4对引物进行特异性检测，通过对引物特异性扩增体系及条件进行了优化，获得了优化的PCR体系及其PCR扩增条件。引物PHF/PHR:最适2.5 mmol的dNTPs2.5μL，2.5 U·μL-1的Taq酶0.25μL，MgCl21.5 mM;最佳退火温度53℃。引物SHF/SHR:最适2.5 mmol的dNTPs2.5μL，2.5 U·μL-1的Taq酶0.2μL，MgCl22.0 mM;最佳退火温度54℃。引物JHF/JHR:最适2.5 mmol的dNTPs2.0μL，2.5 U·μL-1的Taq酶0.25μL，MgCl22.0 mM;最佳退火温度55℃。引物JWF/JWR:最适2.5 mmol的dNTPs2.5μL，2.5U·μL-1的Taq酶0.25μL，MgCl22.0 mM;最佳退火温度51℃。 对不同特异引物PCR扩增的灵敏度进行检验，结果表明:平菇黄腐病和疑似金针菇胡桃肉状菌病的特异引物可以检测到4×10-3 ng·μL-1以上的病害样品基因组DNA，双孢菇褐斑病和鸡腿菇黑头病可以检测到4×10-2 ng·μL-1以上的病害样品基因组DNA。 为了能够进一步完善和改进特异性引物对食用菌病害的检测诊断，还需要对引物特异性在更多种类的病原菌或病害样品进行的检验。基于宏基因组技术对食用菌病害的初步分析研究，以及通过特异引物对病害的检测为食用菌病害的研究提供新的理论依据。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 食用菌概述

1．2 国内外食用菌生产现状

1．3 食用菌病害的研究现状

1．4 宏基因组学

1．4．1 宏基因组研究策略

1．4．2 宏基因组的应用现状

1．5 高通量测序研究现状

1．6 PCR技术对病害检测的研究

1．7 研究目的和意义

第二章 常见食用菌病原微生物分离纯化

2．1 器材与试剂

2．1．1 材料

2．1．2 试剂

2．1．3 仪器

2．2 方法

2．2．1 食用菌病害样品的采集

2．2．2 培养基制备

2．2．3 病原微生物的分离纯化

2．2．4 病原真菌鉴定

2．2．5 病原细菌鉴定

2．3 结果与分析

2．3．1 不同寄主病害样品统计

2．3．2 病原真菌分离

2．3．3 病原细菌分离

2．4 小结与讨论

第三章 食用菌病害样品的宏基因组提取及rDNA测序分析

3．1 器材与试剂

3．1．1 材料

3．1．2 仪器

3．1．3 主要试剂

3．1．4 溶液配制

3．2 方法

3．2．1 样品总基因组DNA提取方法筛选

3．2．2 16S rDNA／18S rDNA通用引物设计及合成

3．2．3 通用引物PCR扩增

3．2．4 PCR产物纯化

3．2．5 纯化PCR产物与pUCm-T载体连接

3．2．6 感受态细胞的制各

3．2．7 重组质粒的转化

3．2．8 单菌落PCR检测

3．2．9 单克隆测序

3．2．10 序列分析

3．3 结果与分析

3．3．1 基因组DNA提取方法的筛选

3．3．2 PCR扩增结果

3．3．3 单菌落PCR验证结果

3．3．4 测序结果

3．3．5 Blast对比结果

3．3．6 亲缘关系分析

3．4 小结与讨论

第四章 食用菌病害PCR快速检测的特异性引物设计

4．1 材料

4．1．1 病原菌与其近缘种及相关种的16S rDNA／18S rDNA序列

4．1．2 主要试剂

4．1．3 主要仪器

4．2 方法

4．2．1 序列比对

4．2．2 特异引物设计

4．2．4 引物特异性检验

4．2．5 引物灵敏度检验

4．3 结果与分析

4．3．1 序列比对结果

4．3．2 特异引物设计

4．3．3 引物特异性检验

4．3．4 PCR扩增灵敏度检测

4．4 小结与讨论

第五章 全文总结

参考文献

缩写词及中英文对照

致谢

论文发表情况