克雷伯氏肺炎杆菌生产α-酮异戊酸和异丁醇的方法

摘要

本发明公开了一种改造的克雷伯氏肺炎杆菌及其生产α-酮异戊酸和异丁醇的应用。该改造的克雷伯氏肺炎杆菌为乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶失活的克雷伯氏肺炎杆菌。利用改造的克雷伯氏肺炎杆菌在中性pH和微氧条件下发酵生产α-酮异戊酸和异丁醇。本发明提供的方法，生产菌株中未引入外源基因，菌株遗传稳定性高，产物终浓度高，原料范围广。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及克雷伯氏肺炎杆菌生产α-酮异戊酸和异丁醇的方法。

背景技术

α-酮异戊酸是一种α-酮酸，α-酮酸不稳定，容易脱羧，导致自然界天然存在的α-酮酸很少。在生物体内，α-酮酸一般仅以中间体的形式存在，作为生物体内多种物质的前体。α-酮异戊酸是一种重要的细胞中间代谢产物。α-酮异戊酸是L-缬氨酸，L-亮氨酸和泛酸合成的前体，现在作为慢性肾脏疾病患者服用L-缬氨酸，L-亮氨酸的替代品。利用α-酮异戊酸作为原料，利用L-缬氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶催化反应，可以还原氨基化合成L-缬氨酸(Appl Microbiol Biotechnol,1990,34:236-241)。

目前未见野生微生物合成α-酮异戊酸的公开报道。肉桂地链霉菌通过诱变筛选2-酮基丁酸和缬氨酸耐受突变株，或2-酮基丁酸和异亮氨酸耐受突变株。通过诱变筛选获得一株突变株，72小时可以合成2.4g/Lα-酮异戊酸。谷氨酸棒杆菌中敲除aceE基因，aceE是丙酮酸脱氢酶复合物中一个亚基的编码基因，敲除转氨酶基因ilvE，同时表达ilvBNCD基因，再敲除丙酮酸：醌氧化还原酶基因pqo构建工程菌株，该工程菌株可以21.8g/L的α-酮异戊酸(Applied And Environmental Microbiology,2010,8053–8061)。

异丁醇是一种支链脂肪醇，用作溶剂和合成其他种化学品的原料。异丁醇具有与汽油接近的能量密度，吸水性弱，挥发性低，辛烷值高，这些特点使得异丁醇成为一种潜在的液体燃料。目前仅发现酿酒酵母等少数微生物可以合成微量的异丁醇，商品异丁醇由化学合成法生产(Nature,2008,451,86-89)。目前报道的其他生物法合成异丁醇都是在宿主细胞中构建新的代谢途径来实现。将来源于将乳脂乳球菌的2-酮酸脱羧酶基因克隆到大肠杆菌，并 同时表达alsS，ilvC和ilvD基因，工程菌株可以利用葡萄糖合成3g/L的异丁醇(生物技术通报，2011,8,208-212)。将宿主大肠杆菌基因组的pflB，frdAB，fnr和AdhE基因敲除后，工程菌株的异丁醇产量提高到4.2g/L(生物技术通报，2012,170-175)。利用谷氨酸棒杆菌为宿主，表达来源于枯草芽孢杆菌的alsS基因，来源于谷氨酸棒杆菌的ahdA，ilvC和ilvD基因，来源于乳脂乳球菌的kivd，工程菌株28小时可以合成2.6g/L的异丁醇(Appl Microbiol Biotechnol,2010,87:1045–1055)。利用枯草芽孢杆菌为宿主细胞，表达枯草芽孢杆菌来源的alsS基因，酿酒酵母来源的adh2基因，来源于乳脂乳球菌的kivd基因，通过其他基因改造后获得的工程菌株可以合成2.62g/L的异丁醇(Appl Microbiol Biotechnol,2011,91:577–589)。

克雷伯氏肺炎杆菌是一种重要的工业微生物，具有生长旺盛、能利用多种碳源进行生长等特点。目前克雷伯氏肺炎杆菌用于1,3-丙二醇、2,3-丁二醇、2-酮基葡萄糖酸、乙偶姻等生产菌株，具有底物转化率高和产物终浓度高等优点。未发现关于克雷伯氏肺炎杆菌生产α-酮异戊酸和异丁醇的公开报道。

发明内容

本发明的目的是，提供改造的克雷伯氏肺炎杆菌及其应用于生产α-酮异戊酸和异丁醇的方法。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：

一种改造的克雷伯氏肺炎杆菌，该改造的克雷伯氏肺炎杆菌为乙酰乳酸脱羧酶失活的克雷伯氏肺炎杆菌。

优选地，一种改造的克雷伯氏肺炎杆菌，该改造的克雷伯氏肺炎杆菌为乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶同时失活的克雷伯氏肺炎杆菌。

所述乙酰乳酸脱羧酶是指催化乙酰乳酸脱羧生成乙偶姻的酶。其在克雷伯氏肺炎杆菌342基因组中的基因阅读框如SEQ ID NO.1所示，Genebank编号为(gene ID 206569613)；所述乳酸脱氢酶是指催化丙酮酸还原成乳酸的酶。其在克雷伯氏肺炎杆菌342中基因阅读框如SEQ ID NO.2所示，Genebank编号为(gene ID 206567865)。

本发明还提供了所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌在生产α-酮异戊酸和异丁醇中的应用。

本发明还提供了所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌生产α-酮异戊酸和异丁醇的方法，该方法为：将改造的克雷伯氏肺炎杆菌接种到培养基中，进行发酵培养。

优选地，所述发酵培养基的组成包括：碳源10-200g/L，氮源1-50g/L，无机盐0-10g/L。

碳源选自能代谢转化成丙酮酸的化合物，具体包括葡萄糖、甘油、木糖、生物质水解液、以及它们的混合物。

所述氮源选自玉米浆、酵母提取物、蛋白胨、豆饼粉、尿素、氨、铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐。

所述无机盐选自钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐。

优选地，所述发酵条件为：将菌株接种到发酵培养基，发酵温度25-45℃，发酵过程中供氧，保持发酵过程中发酵液的pH值在5.5-8.5之间。

进一步优选地，所述发酵条件为：将菌株接种到发酵培养基，发酵温度30-40℃，发酵过程中微量供氧，保持发酵过程中发酵液的pH值在6.5-7.5之间。

优选地，所述的改造的克雷伯氏肺炎杆菌生产α-酮异戊酸和异丁醇的方法还包括：发酵过程中待碳源消耗至1-20g/L时流加碳源进行补料发酵。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明通过乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶失活对克雷伯氏肺炎杆菌进行改造，改造后的克雷伯氏肺炎杆菌利用碳源进行发酵培养时，碳源转化形成α-酮异戊酸和异丁醇，并在发酵液中积累。本发明提供的方法，生产菌株中未引入外源基因，菌株遗传稳定性高，产物终浓度高，原料范围广。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试 剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。

以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。

实施例1

利用基因重组方法对克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366的菌株(该菌株也称为TUAC01，AC01)乙酰乳酸脱羧酶基因进行失活，来实现乙酰乳酸脱羧酶活性失活。

为CGMCC 1.6366的菌株已经在公开文献(Wei Dong,Wang Min,Shi Jiping,Hao Jian.Red recombinase assisted gene replacement in Klebsiella pneumoniae.Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology.201239:1219–1226)中也已经公开该菌株。该菌株是一株用于生产1,3-丙二醇，2,3-丁二醇，乙偶姻和2-酮基葡萄糖酸的菌株。该菌分离自土壤，分离过程及性状描述见(Hao Jian,等.Isolation and characterization of microorganisms able to produce 1,3-propanediol under aerobic conditions.World Journal of Microbiology Biotechnology 2008,24:1731-1740)。

1)利用PCR扩增CGMCC 1.6366菌株乙酰乳酸脱羧酶基因序列，通过TA克隆方法连接到克隆载体，并进行DNA序列测定。

克雷伯氏肺炎杆菌342是一株用于固氮研究的克雷伯氏肺炎杆菌，其全基因组已经测序，并且提交到了genebank。根据克雷伯氏肺炎杆菌342(Genbank:NC_011283)基因组信息，设计乙酰乳酸脱羧酶基因PCR引物，上游引物budA-s：GAAGATCAGAACATCGCCAGA(SEQ ID NO.3所示)，下游引物budA-a：CTCTGATGGACCTGCTTCGCCTTAT(SEQ ID NO.4所示)。

通过上述引物，以克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366基因组DNA为模板，经PCR扩增，获得乙酰乳酸脱羧酶基因及相邻片段，通过TA克隆方法连接到pMD-18T simple质粒(商业产品)上，得到的重组质粒命名为pMD18T-budA质粒。测序确定这段DNA序列如(SEQ ID NO.5所示)

2)利用步骤1克隆到的基因序列，制备两侧连有长同源臂中间连接抗性盒的DNA片段。

本步骤中的操作，采用在大肠杆菌中利用Red重组酶催化，具有短同源臂连接抗性盒的DNA片段与pMD18T-budA质粒进行同源重组，获得pMD18T-budA质粒上重组失活的budA基因，利用该质粒作为模板通过PCR扩增具有长的同源臂的DNA片段，该片段两侧连有与budA基因同源的序列， 中间连接抗性盒。

本步骤操作原理和使用的质粒和菌株等材料可参见(Wei et.al.Red recombinase assisted gene replacement in Klebsiella pneumoniae Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology 2012)，具体步骤如下：

a.pMD18T-budA质粒热击转化到含有pIJ790质粒的大肠杆菌DH5α-pIJ790中，命名为DH5α-pMD18T-budA。

b.设计引物budA-F-s和budA-F-a，序列分别为：

GCCCTGCTGAGCGGGGTTTACGAAGGCAGCACCACCATCATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ ID NO.6所示)和TTGCGGTCATCGGTTATAAAGTGCTCGTGATACCCGGCGATGTAGGCTGGAGCTGCTTC

(SEQ ID NO.7所示)。

利用引物budA-F-s和budA-F-a，以质粒pIJ778为模板扩增出长约1.4Kb的DNA片段A。该片段的两端分别具有与budA序列同源的同源臂，中间包含了来源于pIJ778质粒的链霉素抗性基因aadA。

c.利用DNA片段A转化感受态DH5α-pMD18T-budA感受态细胞。利用电击转化方法，转化电压为2000V，选择链霉素抗性的菌株，链霉素用量为50mg/L。

DNA片段A两侧的同源序列与质粒pMD18T-budA上的budA同源部分发生重组，获得质粒，并命名为pMD18T-ΔbudA质粒。

d.利用引物budA-s2TGCCTCAGTGCATGGCCTGGTAG(SEQ ID NO.8所示)和budA-a2TGGCCTCCAGCAAGCGGCGTAGC(SEQ ID NO.9所示)，以pMD18T-ΔbudA质粒为模板进行PCR扩增，获得2.8Kb的DNA片段B。

DNA片段B两端具有budA基因序列，该序列作为同源臂。DNA片段B中间具有链霉素抗性基因aadA，DNA片段B用于进行CGMCC1.6366染色体上budA基因重组的线性DNA片段。

3)利用转化将制备的DNA片段B转入到克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366中，DNA片段B与染色体上的乙酰乳酸脱羧酶基因相邻的序列进行同源重组，筛选获得菌株染色体乙酰乳酸脱羧酶重组失活的菌株，具体步骤如下：

将pDK6-red质粒转化到CGMCC 1.6366中，将转化有pDK6-red质粒的CGMCC 1.6366命名为CGMCC 1.6366-pDK6-red菌株，线性DNA片段B电 击转化CGMCC 1.6366-pDK6-red感受态细胞。利用链霉素筛选抗性菌株，筛选获得的抗性菌株命名为Kp-ΔbudA，该菌株的乙酰乳酸脱羧酶基因通过同源重组而失活。

实施例2

利用基因重组方法对克雷伯氏肺炎杆菌SARI 01、SARI 02菌株乙酰乳酸脱羧酶基因进行失活，来实现乙酰乳酸脱羧酶活性失活。SARI 01和SARI 02菌株为中国科学院上海高等研究院从土壤中分离到的两株克雷伯氏肺炎杆菌。分离过程与(Hao Jian,等.Isolation and characterization of microorganisms able to produce 1,3-propanediol under aerobic conditions.World Journal of Microbiology Biotechnology 2008,24:1731-1740)描述相同。

将pDK6-red质粒转化到SARI 01中，将转化有pDK6-red质粒的SARI 01命名为SARI 01-pDK6-red菌株。实施例1中获得的线性DNA片段B电击转化SARI 01-pDK6-red感受态细胞。利用链霉素筛选抗性菌株，筛选获得的抗性菌株命名为KpS1-ΔbudA，该菌株的乙酰乳酸脱羧酶基因通过同源重组而失活。

将pDK6-red质粒转化到SARI 02中，将转化有pDK6-red质粒的SARI 02命名为SARI 02-pDK6-red菌株。实施例1中获得的线性DNA片段B电击转化SARI 02-pDK6-red感受态细胞。利用链霉素筛选抗性菌株，筛选获得的抗性菌株命名为KpS2-ΔbudA，该菌株的乙酰乳酸脱羧酶基因通过同源重组而失活。

实施例3

利用基因重组方法构建乙酰乳酸脱羧酶基因和乳酸脱氢酶基因同时失活的克雷伯氏肺炎杆菌，来实现乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶活性同时失活。

1)利用PCR扩增克雷伯氏肺炎杆菌乳酸脱氢酶基因序列，通过TA克隆方法连接到克隆载体，并进行DNA序列测定。

根据克雷伯氏肺炎杆菌342基因组信息，设计乳酸脱氢酶基因PCR引物，上游引物ldhA-s：AGAGCGCACAGGACCACTATCCA(SEQ ID NO.10所示)，下游引物ldhA-a：TCGGCGAGCTTATAGACCAGCGT(SEQ ID NO.11所示)。

通过上述引物，以克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366基因组DNA为模板， 经PCR扩增，获得乳酸脱氢酶基因及相邻片段，通过TA克隆方法连接到pMD-18T simple质粒(商业产品)上，得到的重组质粒命名为pMD18T-ldhA质粒。经过序列测定，其序列如(SEQ ID NO.12所示)

2)利用步骤1克隆到的基因序列，制备两侧连有长同源臂中间连接抗性盒的DNA片段。

本步骤中的操作，采用在大肠杆菌中利用Red重组酶催化，具有短同源臂连接抗性盒的DNA片段与pMD18T-ldhA质粒进行同源重组，获得pMD18T-ldhA质粒上重组失活的ldhA基因，利用该质粒作为模板通过PCR扩增具有长的同源臂的DNA片段，该片段两侧连有与ldhA基因同源的序列，中间连接抗性盒。

具体步骤如下：

a.pMD18T-ldhA质粒热击转化到含有pIJ790质粒的大肠杆菌DH5α-pIJ790中，命名为DH5α-pMD18T-ldhA。

b.设计引物ldhA-F-s和ldhA-F-a，序列分别为：

ACCGCCAAAACCGCCCACGGTTGCGAAGCGGTATGCATATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ ID NO.13所示)和CAGCGCCTCGGCGGTGAGGAACGCCTGATGGCCGGTGAACTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO.14所示)。

利用引物ldhA-F-s和ldhA-F-a，以质粒pIJ773为模板扩增出长约1.4Kb的DNA片段A2。该片段的两端分别具有与乳酸脱氢酶序列同源的同源臂，中间包含了来源于pIJ773质粒的安普霉素抗性基因aac(3)IV。

c.利用DNA片段A2转化感受态DH5α-pMD18T-ldhA感受态细胞。利用电击转化方法，转化电压为2000V，选择安普霉素抗性的菌株，安普霉素用量为50mg/L。

DNA片段A2两侧的同源序列与质粒pMD18T-ldhA上的ldhA同源部分发生重组，获得质粒，并命名为pMD18T-ΔldhA质粒。

d.利用引物ldhA-s2CTGCTGCTGCTGGGAACATTC(SEQ ID NO.13所示)和ldhA-a(SEQ ID NO.10所示)，以pMD18T-ΔldhA质粒为模板进行PCR扩增，获得2.8Kb的DNA片段B2。

DNA片段B2两端具有ldhA基因序列，该序列作为同源臂。DNA片段B2中间具有安普霉素抗性基因aac(3)IV，DNA片段B用于进行CGMCC1.6366 染色体上ldhA基因重组的线性DNA片段。

3)利用转化将制备的DNA片段B2转入到克雷伯氏肺炎杆菌Kp-ΔbudA中，DNA片段B2与染色体上的乳酸脱氢酶基因进行同源重组，筛选获得菌株染色体乳酸脱氢酶重组失活的菌株，具体步骤如下：

线性DNA片段B2电击转化已经含有pDK6-red质粒的Kp-ΔbudA感受态细胞。利用安普霉素筛选抗性菌株，筛选获得的抗性菌株命名为Kp-ΔbudA-ΔldhA，该菌株的乙酰乳酸合成酶基因和乳酸脱氢酶基因通过同源重组而同时失活。

4)线性DNA片段B2电击转化已经含有pDK6-red质粒的KpS1-ΔbudA感受态细胞。利用安普霉素筛选抗性菌株，筛选获得的抗性菌株命名为KpS1-ΔbudA-ΔldhA，该菌株的乙酰乳酸合成酶基因和乳酸脱氢酶基因通过同源重组而同时失活。

线性DNA片段B2电击转化已经含有pDK6-red质粒的KpS2-ΔbudA感受态细胞。利用安普霉素筛选抗性菌株，筛选获得的抗性菌株命名为KpS2-ΔbudA-ΔldhA，该菌株的乙酰乳酸合成酶基因和乳酸脱氢酶基因通过同源重组而同时失活。

实施例4

将实施例1-3中获得的菌株进行摇瓶批次发酵实验。

将出发菌株克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366、SARI 01、SARI 02和实施例1-3中获得的改造的菌株接种到250ml锥形瓶中，其中装有50ml发酵培养基，摇瓶柜转速100转每分钟，恒温30℃进行发酵培养。

培养基组分为：葡萄糖10g/L，酵母膏1g/L，碳酸钙0.5g每瓶。

培养24小时，测定发酵液中组分。测定采用液相色谱法测定，利用HPX-87H色谱柱对发酵液组分进行分离，利用视差和紫外检测器检测。流动相0.05mol/L硫酸水溶液，流速0.8ml/min，柱温箱60℃。α-酮异戊酸和α-酮异戊酸盐在本发明中不做区分，都以α-酮异戊酸计。用气相色谱法测定异丁醇，利用DB-WAX色谱柱对组分进行分离，利用氢火焰检测器检测。各菌株发酵结果如表1所示。

表1，摇瓶发酵实验中各菌株的发酵数据结果

从表1的数据结果可以看出：野生型克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366，SARI 01和SARI 02利用葡萄糖好氧发酵主要合成2,3-丁二醇，不合成α-酮异戊酸和异丁醇。乙酰乳酸脱羧酶活性消除的菌株(Kp-ΔbudA，KpS1-ΔbudA，KpS2-ΔbudA)利用葡萄糖培养合成α-酮异戊酸和少量异丁醇。乙酰乳酸脱羧酶活性和乳酸脱氢酶活性同时消除的菌株(Kp-ΔbudA-ΔldhA，KpS1-ΔbudA-ΔldhA KpS2-ΔbudA-ΔldhA)利用葡萄糖培养合成α-酮异戊酸和异丁醇能力提高。

实施例5

将实施例1-3中获得的菌株进行5L发酵罐发酵实验。

将出发菌株克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366、SARI 01、SARI 02和实施例1-3中获得的改造的菌株接种分别接种到250ml锥形瓶中，其中装有50mlα-酮异戊酸种子培养基，摇瓶柜转速200转每分钟，恒温30℃进行种子培养。

种子培养基组分为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L。

发酵培养基组成为：甘油100g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L,硫酸铵5g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钾0.4g/L。

种子培养12小时，接种到5L发酵罐中，内装3L发酵培养基，保持发酵过程通风量3L/分钟，搅拌转速300转/分，发酵温度25℃，利用氢氧化钠溶 液使发酵液的pH值稳定在5.5，发酵48小时结束，采用实施例4方法测定发酵液中组分。各菌株发酵结果如表2所示。

表2，5L发酵罐实验中各菌株的发酵数据结果

野生型克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366，SARI 01和SARI 02利用甘油好氧发酵不合成α-酮异戊酸和异丁醇。乙酰乳酸脱羧酶活性消除的菌株(Kp-ΔbudA，KpS1-ΔbudA，KpS2-ΔbudA)利用甘油培养合成α-酮异戊酸和少量异丁醇。乙酰乳酸脱羧酶活性和乳酸脱氢酶活性同时消除的菌株(Kp-ΔbudA-ΔldhA，KpS1-ΔbudA-ΔldhA KpS2-ΔbudA-ΔldhA)利用甘油培养合成α-酮异戊酸和异丁醇能力提高。

实施例6

将实施例1-3中获得的菌株进行5L发酵罐发酵实验。

将出发菌株克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366、SARI 01、SARI 02和实施例1-3中获得的改造的菌株接种分别接种到250ml锥形瓶中，其中装有50mlα-酮异戊酸种子培养基，摇瓶柜转速200转每分钟，恒温35℃进行种子培养。

种子培养基组分为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L。

发酵培养基组成为：葡萄糖200g/L，玉米浆50g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钾0.4g/L。

种子培养12小时，接种到5L发酵罐中，内装3L发酵培养基，保持发酵过程通风量2L/分钟，搅拌转速300转/分，发酵温度45℃，利用氢氧化钾溶液使发酵液的pH值稳定在8.5，发酵72小时结束，采用实施例4方法测定发酵液中组分。各菌株发酵结果如表3所示。

表3，实施例6发酵罐实验中各菌株的发酵数据结果

从表3的数据结果可以看出：野生型克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366，SARI 01和SARI 02利用葡萄糖发酵主要合成2,3-丁二醇，不合成α-酮异戊酸和异丁醇。乙酰乳酸脱羧酶活性消除的菌株(Kp-ΔbudA，KpS1-ΔbudA，KpS2-ΔbudA)利用葡萄糖培养合成α-酮异戊酸和少量异丁醇。乙酰乳酸脱羧酶活性和乳酸脱氢酶活性同时消除的菌株(Kp-ΔbudA-ΔldhA，KpS1-ΔbudA-ΔldhA KpS2-ΔbudA-ΔldhA)利用葡萄糖培养合成α-酮异戊酸和异丁醇能力提高。

实施例7

将实施例1-3中获得的菌株进行5L发酵罐发酵实验。

将出发菌株克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366、SARI 01、SARI 02和实施例1-3中获得的改造的菌株接种分别接种到250ml锥形瓶中，其中装有50mlα-酮异戊酸种子培养基，摇瓶柜转速200转每分钟，恒温35℃进行种子培养。

种子培养基组分为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L。

发酵培养基组成为：葡萄糖100g/L，木糖30g/L玉米浆30g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钾0.6g/L。

种子培养12小时，接种到5L发酵罐中，内装3L发酵培养基，保持发酵过程通风量1L/分钟，搅拌转速200转/分，发酵温度30℃，利用氨水保持发酵液的pH值稳定在6.5，发酵48小时结束，采用实施例4方法测定发酵液中组分。各菌株发酵结果如表4所示。

表4，实施例7发酵罐实验中各菌株的发酵数据结果

从表4的数据结果可以看出：野生型克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366，SARI 01和SARI 02利用葡萄糖和木糖发酵培养主要合成2,3-丁二醇，不合成α-酮异戊酸和异丁醇。乙酰乳酸脱羧酶活性消除的菌株(Kp-ΔbudA，KpS1-ΔbudA，KpS2-ΔbudA)利用葡萄糖和木糖培养合成α-酮异戊酸和少量异丁醇。乙酰乳酸脱羧酶活性和乳酸脱氢酶活性同时消除的菌株 (Kp-ΔbudA-ΔldhA，KpS1-ΔbudA-ΔldhA KpS2-ΔbudA-ΔldhA)利用葡萄糖和木糖培养合成α-酮异戊酸和异丁醇能力提高。

实施例8

将实施例1-3中获得的菌株进行5L发酵罐发酵实验。

将出发菌株克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366、SARI 01、SARI 02和实施例1-3中获得的改造的菌株接种分别接种到250ml锥形瓶中，其中装有50mlα-酮异戊酸种子培养基，摇瓶柜转速200转每分钟，恒温35℃进行种子培养。

种子培养基组分为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L。

发酵培养基组成为：葡萄糖100g/L，玉米浆30g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钾0.6g/L。

种子培养12小时，接种到5L发酵罐中，内装3L发酵培养基，保持发酵过程通风量1L/分钟，搅拌转速200转/分，发酵温度40℃，利用氨水保持使发酵液的pH值稳定在7.5，发酵48小时结束，采用实施例4方法测定发酵液中组分。各菌株发酵结果如表5所示。

表5，实施例8中各菌株的发酵数据结果

从表5的数据结果可以看出：野生型克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366，SARI 01和SARI 02利用葡萄糖好氧发酵主要合成2,3-丁二醇，不合成α-酮异 戊酸和异丁醇。乙酰乳酸脱羧酶活性消除的菌株(Kp-ΔbudA，KpS1-ΔbudA，KpS2-ΔbudA)利用葡萄糖培养合成α-酮异戊酸和少量异丁醇。乙酰乳酸脱羧酶活性和乳酸脱氢酶活性同时消除的菌株(Kp-ΔbudA-ΔldhA，KpS1-ΔbudA-ΔldhA KpS2-ΔbudA-ΔldhA)利用葡萄糖培养合成α-酮异戊酸和异丁醇能力提高。

实施例9

将将实施例1-3中获得的菌株进行流加发酵罐发酵实验。

将实施例1-3中获得的改造的菌株接种分别接种到250ml锥形瓶中，其中装有50mlα-酮异戊酸种子培养基，摇瓶柜转速200转每分钟，恒温35℃进行种子培养。

种子培养基组分为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L。

发酵培养基组成为：葡萄糖100g/L，玉米浆30g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钾0.6g/L。

培养12小时，接种到5L发酵罐中，内装3L发酵培养基，保持发酵过程通风量1L/分钟，搅拌转速200转/分，发酵温度37℃，利用氢氧化钠稳定发酵液pH 7.0，待发酵液中葡萄糖浓度降低到1-20g/L时，补加50％(g/g)的葡萄糖溶液，发酵82小时结束，采用实施例4方法测定发酵液中组分。各菌株发酵结果如表6所示。

表6，实施例9中各菌株的发酵数据结果

从表6的数据可以看出：利用流加发酵，乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶活性失活的菌株可以合成28.1-35.5g/L的α-酮异戊酸，0.76-0.91g/L的异丁醇。

上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可 以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。

<110>中国科学院上海高等研究院

<120>克雷伯氏肺炎杆菌生产α-酮异戊酸和异丁醇

<130>2015

<160>14

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>780

<212>DNA

<213>克雷伯氏肺炎杆菌342

<400>1

ttaactttct acggaacgga tggcggcatc gagattatcg ggatgcagat tggcctgcag 60

gaacgcgctg tcggcgggca ggtcgatcat cagcttgtga atttcgccga aggtcagcac120

cccgtgatcg agctggtaat ccagcaggtg accgccgcct ttgcggtcat cggtaataaa180

gtgctcgtga tacccggcga cattgatccc ctgcatatgc tgcggggtac ggaagccgac240

cagcacccct tcgcgctggt taaagcggaa caccggctga tcgtcgagga cgtcggtcat300

cgcccggtac ggtggcgtct ggcgcggcac ggtgcgggta tgggcatggc ggaaatggcc360

gtcgatgcgc agggcgcaga acaggttgtc agagggaatt tgctggtcaa taacgtcgtg420

cagttgctgg cggctcaccg gatggtcgaa agttttccgg tactgcggct ggaaccaggt480

catcaccgcg aacggcgttt tctgctccgg ctgggctttg cgcgcgctgc cgtcggcgcg540

cagctgatag acctgactgc tgaaggcgat cagctccccg tccagctcat taaaggtgcc600

gaggccgaaa tcgccgtgtt tcagcaggtc cgcgatggtg gtgctgcctt cgtaaacccc660

gctcagcagg gcgctcatta gcgatgtctg atagagcacg ctctcgggat gctgcgcgga720

aaacgcccgt agggtttcgc acagactctc ttcgcaggtg cattcagcag agtgattcat780

<210>2

<211>990

<212>DNA

<213>克雷伯氏肺炎杆菌342

<400>2

atgaaaatcg cggtttacag tacgaagcag tacgataaaa agtacctgca gcacgtgaat 60

gatacctacg gctttgaact ggaattcttc gacttcctgc tgacagcgaa gaccgccaaa120

accgccaacg gttgcgaagc ggtgtgtatc ttcgtcaatg acgacggcag ccgcccggtg180

ctggaagagc taaaggccca cggcgtgaag tatatcgctc tgcgctgcgc cggatttaac240

aacgtcgacc tcgaggcggc aaaggagctt ggcctgcgcg tggtccgcgt cccggcgtac300

tcgccggaag ccgtcgctga gcatgcgatc ggtatgatga tgtcgctcaa ccgtcgcatc360

caccgcgcct atcagcgtac ccgtgatgcc aacttctccc tcgaaggcct caccggtttc420

accatgtacg gtaaaaccgc cggggtgatc ggcaccggga aaattggcgt ggcgatgctg480

cggatcctca aaggtttcgg catgcgcctg ctggcgttcg acccgtaccc aagcgccgcc540

gcgctggagc tgggggtgga atatgtcgac ctcgctacac tgtacaagga gtcggacgtg600

atctccctgc actgcccgct gaccgacgaa aactaccatc tgctcaatcg cgaggcgttt660

gaccagatga aggacggggt gatggtgatt aacaccagcc gcggcgcgct gatcgactcc720

caggcggcca tcgacgccct gaagcaccag aaaattggcg cgctggggct ggatgtttat780

gagaacgaac gcgatctgtt ctttgaagac aaatccaacg atgtgatcca ggacgacgtt840

ttccgccgcc tctccgcctg tcacaacgtg ctgttcaccg gccaccaggc gttcctcacc900

gctgaggcgc tgatcagcat ttcggagacc accctgggca acctgcagca ggtcgccaac960

ggcgaaacct gcccgaacgc catcgtctga 990

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gaagatcaga acatcgccag a21

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ctctgatgga cctgcttcgc cttat 25

<210>5

<211>2132

<212>DNA

<213>克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366

<400>5

gatcagaaca tcgccagaaa gcgtttcacc gtgcgcgagc gctcgaagcg ccgccaggcg 60

atggcgatat cggtcttcag cggtgccccg ctgagcgggt gatagctgac gttcggctgt120

tgaatgcagg tcatcgactg cgggaccagc gcgaagccga acccggcatt gaccatgctc180

agcgatgacg aaatctgcga cgactgccag gcgcgctcca tatcgatgcc ggcgcgcagg240

cagctgttgt acaccagctc atacagcccc ggggccacct cccgcgggaa gaggatcggc300

gccacgtcgc gcagctgctc cagggccagg gtcggctgcg tcgccagcgg gttatcgcgc360

ggcagcgcga taaccatcgg ctcctcatcg ataatccgca gattaaaggc tttactgctc420

tcgcacggca gacggacgaa ggcgatgtcc agctcggcct cgctcagggc ggtcatcaga480

ttggccatat tgtcttccat ctggtgcagg gtcaccccgg ggtgatcgag ctgaaaacgg540

tgcagcagcg tgaagatttg cgggtggaaa gcatcagaac tggtaatgcc tagcgacagg600

ctgccgttca tcccgcgggc aatgcccttg gccttctcca gcgccgcatc gctcatggcg660

aggatctggc gggcatcctc atagaacgac tcaccggcct cggtgagctc caccccgcgg720

gtcaaacgcc gaaacagcgg ggtccccacc tcgcgctcaa gccgctgaat ttgctgactt780

aacggaggct gtgaaatacc cagttccttg gcggcctggg tgaagtgccg cgtcctggcg840

acggcgacaa aatagcgaag ataacgaagt tccatatcga aaacgtctca aaccagcatg900

gtttctatat tggaactgtg agctgaatcg ggtcaacatt tatttaacct ttcttatatt960

tgttgaacga ggaagtggta tatgaatcat tctgctgaat gcacctgcga agagagtctg 1020

tgcgaaaccc tgcgggcgtt ttccgcgcag catcccgaga gcgtgctcta tcagacatcg 1080

ctcatgagcg ccctgctgag cggggtttac gaaggcagca ccaccatcgc ggacctgctg 1140

aagcacggcg atttcggtct cggcaccttt aatgagctgg acggggagct gatcgccttc 1200

agcagtcagg tctatcagct gcgggccgac ggcagcgcgc gcaaagccca gccggatcag 1260

aaaacgccgt tcgcggtgat gacctggttc cagccgcagt accggaaaac cttcgaccat 1320

ccggtgagcc gccagcagct gcacgaggtg atcgaccagc aaatcccctc tgacaacctg 1380

ttctgcgccc tgcgcatcga cggccatttc cgccatgccc atacccgcac cgtgccgcgc 1440

cagacgccgc cgtaccgggc gatgaccgac gtcctcgacg atcagccggt gttccgcttt 1500

aaccagcgcg aaggggtgct ggtcggcttc cgtaccccac agcatatgca ggggatcaac 1560

gtcgccgggt atcacgagca ctttataacc gatgaccgca aaggcggcgg tcacctgctg 1620

gattaccagc tcgaccacgg ggtattgacc ttcggcgaaa ttcacaagct gatgatcgac 1680

ctgcccgccg acagcgcgtt cctgcaggcc aatctgcatc ccgataatct cgatgccgcc 1740

atccgttccg tagaaagtta agggggtcac atggacaaac agtatccggt acgccagtgg 1800

gcgcacggcg ccgatctcgt cgtcagccag ctggaagccc agggggtacg tcaggtgttc 1860

ggcatccctg gcgccaaaat cgacaaggta ttcgactcac tgctggattc ctccattcgc 1920

attattccgg tacgccacga agctaacgcc gcctttatgg ccgccgccgt cgggcgcatt 1980

accggtaaag cgggcgtggc gctggtcacc tccggtccgg gctgttccaa cctgatcacc 2040

ggtatggcca ccgccaacag cgaaggcgac ccggtggtgg ccctgggcgg cgcggtgaaa 2100

cgcgccgata aggccaaaca ggtccaccag ag2132

<210>6

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

gccctgctga gcggggttta cgaaggcagc accaccatca ttccggggat ccgtcgacc59

<210>7

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

ttgcggtcat cggttataaa gtgctcgtga tacccggcga tgtaggctgg agctgcttc59

<210>8

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

tgcctcagtg catggcctgg tag 23

<210>9

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

tggcctccag caagcggcgt agc23

<210>10

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

agagcgcaca ggaccactat cca 23

<210>11

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

tcggcgagct tatagaccag cgt 23

<210>12

<211>2163

<212>DNA

<213>克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366

<400>12

tcggcgagct tatagaccag cgtctggtcg gcggtcgcca gcgtcaactg gttttccgtc 60

agatcgacct gcgcgccctc gcgcagcatc ttaccaatgg tcgcgtcaag ggtattgagc120

tgggcatcgt ggcacagcat ccgggtcatc gccagcgatt taaccttcag ctcgccgtcc180

gacaccttac cttccccgct gaagccgttg cacatattgc ccgaaacata catattgccc240

gtaagagtcg tcttctcgcc gaagctcagc tccagcggcc ggtcgcccgc gttcaccgcc300

tggccgttga cgctggtcaa cacgaaacga tgatgctgta gctgttccgc gccggtggac360

accttactgt tatagacaca gccggacagc agcaaccctg ccgccagtaa tgccgcaaat420

ttgttcattt ttactccaaa acattcacat tactaataaa acaaagccag tgtaacggta480

tcgcagcggg gatctgtggg gattatctga atgtgctccc ccggggagag gagcacaaaa540

gggaaaggaa tcagacgata gcgttcgggc aggtttcacc gttggcgacc tgctgcagat600

tgcccagggt ggtctccgaa atgctgatca gcgcctcggc ggtgaggaac gcctgatggc660

cggtgaacag cacgttgtgg caggcggaga ggcgacggaa gacgtcgtcc tggatcacgt720

cgttagattt gtcttcgaag aacagatcgc gttcgttctc ataaacgtcc agccccagcg780

cgccgatttt ctggtgcttc agggcatcga tggccgcctg ggaatcgatc agcgcgccgc840

ggctggtgtt aatcaccatc accccgtcct tcatctgatc gaaggcctcg cgattgagca900

gatggtagtt ttcgtcggtg agcgggcagt gcagggagat cacgtccgac tccttgtaca960

gcgtggccag gtcaacatat tccaccccca gctccagcgc ggcggcgctt gggtacgggt 1020

caaaagccag cagacgcatg ccgaagcctt taaggatccg tagcatcgcc acgccaattt 1080

tcccggtgcc gatcaccccg gcggttttgc cgtacatggt gaaaccggtg aggccttcga 1140

gggagaaatt ggcatcacgg gtacgctggt aggcgcggtg gatgcggcgg ttaagcgaca 1200

tcatcatgcc gatcgcatgt tcagcgaccg cttccggcga gtaggccggg acgcgcacga 1260

cgcgcaggcc aagcgctttc gccgcctcga ggtcgacgtt gttaaacccg gcgcagcgca 1320

gggcgatata cttcacgccg tgggccttca gctcctccag caccggacgg ctgccgtcgt 1380

cattgacgaa gatgcatacc gcttcgcaac cgtgggcggt tttggcggtt ttctctgtca 1440

gcaggaagtc gaagaattcc agttcaaagc cgtaagtatc attaacgtgc tgcaggtact 1500

ttttatcgta ctgcttcgta ctgtaaaccg cgattttcat aagacttttc tccagtgatt 1560

ataacgtcac ggtagcatat ttaaaataat cgtacaatta ttaaaaaata gtttaaatag 1620

caggtgctta tcctaattct agagcatatc gcggatttgc ggaatctctt tgaaagacaa 1680

agttttttca ccacaaactc aggcttaaag cgccggggga gagcagcaga aacggccaca 1740

gcagaccgga ggtgacgtta gccagctgaa acgaccacag cggcaggccg ctggcgccgc 1800

tgaccagggg cagggtggcg cgcaggggag agaggaagcg actgaaaaag accgcccaca 1860

gcccgcggcg ctgaaaaaag agtcgactgc gggccagccg ctcggcggtc agccagcgca 1920

actgcgtgag gcggtgacga tagcgaacgc ctaaccacca cgagagccag aatccgccga 1980

tggcgccgag gctggcgctg gaccacatta acaggaaatg acccaggctg gcggacgcga 2040

atgtccccag cagcagcagg ccggaggtgc ccgggatcgc cagcgacacc agcgcgcagg 2100

atttagtgaa agtgagcagg aaaaccatca gtaataccaa tggatagtgg ccctgtgcgc 2160

tct 2163

<210>13

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

accgccaaaa ccgcccacgg ttgcgaagcg gtatgcatat tccggggatc cgtcgacc 58

<210>14

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

cagcgcctcg gcggtgagga acgcctgatg gccggtgaac tgtaggctgg agctgcttc59