一种转Bt基因作物外源蛋白环境持留的生物测定方法

摘要

本发明提供一种转Bt基因作物外源蛋白环境持留的生物测定方法，包括如下步骤：采集收割当天的转Bt基因作物秸秆和土壤样品作为阳性对照，之后每隔10天采集一次秸秆样品和土壤样品作为试验处理；抽提秸秆样品和土壤中的总蛋白；透析法除去总蛋白抽提液中的盐离子；冷冻浓缩总蛋白至干粉状；添加总蛋白干粉至二化螟(Chilo suppressalis)人工饲料；不添加总蛋白干粉的人工饲料作为空白对照；在超净工作台中分装人工饲料入二化螟饲养瓶；每瓶接入孵化24h之内的二化螟幼虫15头，瓶口用扎有孔的保鲜膜和黑布封口；接虫后放入28℃、光照16D:8L的人工气候箱中培养；10天后取出养虫瓶，观察鉴别二化螟的死亡和发育情况，计算外源蛋白在环境中的相对持留量和活性衰减动态。

说明书

技术领域

本发明涉及转Bt基因作物环境安全评价技术领域，具体涉及一种转Bt基因作物外源蛋白环境持留的生物测定方法。

背景技术

转基因作物在批准商业种植之前和之后需要经过严格的环境安全评价，以确定风险等级和风险防范措施。转基因抗虫作物与传统作物主要不同在于前者体内持续表达外源基因的蛋白，这些外源蛋白在作物生长过程中和收获之后随根系分泌和秸秆样品进入环境，因此，追踪转基因作物外源蛋白的去向和活性衰减过程是转基因作物环境安全评价的重要部分。目前，酶联免疫吸附技术(ELISA)是检测土壤和植株样品中Bt外源蛋白残留量的首选方法，然而，ELISA技术特别灵敏，已经部分降解、失去生物活性的Bt外源蛋白也可以引起免疫反应，另外，因为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)在土壤中普遍存在，即使在从未种植过Bt作物的田间土壤中也可以用ELISA方法检测到阳性反应，因此，ELISA技术可能高估Bt外源蛋白进入环境的量和在环境中的持留时间。本专利采用水稻二化螟为靶标生物，样品建立了一套Bt外源蛋白在环境中持留期和相对持留量的生物测定方法，可为更真实地评价Bt抗虫作物的环境安全性提供参考。

发明内容

针对ELISA技术在检测环境Bt外源蛋白中过于灵敏的缺陷，本发明的目的是提供一种转Bt基因作物外源蛋白环境持留的生物测定方法。二化螟是Bt蛋白的靶标生物，利用二化螟的人工饲料的成熟培养技术，将环境中残留的外源蛋白提取出来，添加到人工饲料中，测定外源Bt蛋白对二化螟初孵幼虫的毒力反应，达到评价环境中外源蛋白的持留期和持留量的目的。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种转Bt基因作物外源蛋白环境持留的生物测定方法，包括如下步骤：

1)在种植Bt作物的田块采集秸秆样品和土壤样品；

2)对秸秆样品和土壤样品进行预处理；

3)提取秸秆样品和土壤样品中的总蛋白；

4)对总蛋白提取液进行透析纯化和冷冻干燥浓缩；

5)将浓缩后的总蛋白加入二化螟人工饲料；

6)分装二化螟人工饲料入饲养瓶；

7)将孵化24小时之内二化螟幼虫接入饲养瓶；

8)培养10天后检查二化螟的死亡与生长发育情况，计算外源蛋白在环境中的相对持留量和活性衰减动态。

根据以上方案，所述样品的采集方法为：转Bt基因作物收割当日在种植转Bt基因作物的田间采集秸秆样品和10cm深的根围土样品作为阳性对照，之后每隔10天在种植转Bt基因作物的田块采集秸秆样品和10cm深的根围土样品作为试验处理，收割当日的秸秆样品采集量大于5kg、10cm深的根围土集采量大于10kg，之后每次秸秆样品采集量大于500g、10cm深的根围土大于1000g，采集好的样品用大号自封袋装好，贴上标签，-40℃以下保存。

根据以上方案，所述样品的预处理方法为：将收割当日和收割第N天后的秸秆样品和土壤样品进行冷冻干燥，干燥后的秸秆样品加液氮磨至粒径0.2mm以下，干燥后的土壤样品研细后过60目筛，取至少3份重100g秸秆粉末、至少3份重200g土壤粉末备用，经预处理的样品-40℃以下保存。

根据以上方案，所述样品的总蛋白提取方法为：经预处理后的100g秸秆样品和200g土壤样品分别加入2倍体积的PBS缓冲液，常温震荡提取2h，12000r/min离心20min，取上清液，再加2倍体积的PBS缓冲液重复提取一次，合并上清，上清液于4℃保存不超过2天。

根据以上方案，所述总蛋白提取液透析纯化和冷冻干燥浓缩方法为：总蛋白提取液4℃下经过透析袋(8000-14000)透析平衡过夜，透析后冷冻干燥浓缩总蛋白提取液至干粉，总蛋白干粉于-20℃以下保存。

根据以上方案，所述添加总蛋白入二化螟人工饲料的方法为：配制15份各重200g二化螟人工饲料，当人工饲料冷却至45℃时加入100g秸秆样品总蛋白提取物或200g土壤样品的蛋白提取物，并充分搅拌2min，制成5种类型的人工饲料：①添加收割后第N天的秸秆总蛋白干粉的人工饲料(处理1)，②添加收割后第N天的土壤总蛋白干粉的人工饲料(处理2)，③添加收割当日的秸秆总蛋白干粉的人工饲料(阳性对照1)，④添加收割当日土壤总蛋白干粉的人工饲料(阳性对照2)，⑤不加任何提取物的人工饲料(空白对照)，每种类型人工饲料各3份，即3次重复。

根据以上方案，所述二化螟人工饲料分装入饲养瓶的方法为：将配制好的人工饲料在超净工作台内分装入口径5.5cm、高8cm的饲养瓶中，每种类型人工饲料分装1瓶，每瓶30g，并贴好标签，剩下的人工饲料4℃下保存不超过2个月。

根据以上方案，所述接二化螟幼虫入饲养瓶的方法为：每瓶接入15头孵化24小时以内的二化螟幼虫后用保鲜膜和黑布封口，保鲜膜在下层、黑布在上层，并在保鲜膜上用牙签扎孔6个。

根据以上方案，所述二化螟培养和生长发育情况检查与相对持留量计算的方法为：于28℃、光照16D：8L的环境中培养10天后检查二化螟幼虫的死亡和生长发育情况，计算环境中Bt外源蛋白相对持留量：

收割后第N天的持留百分量＝第N天的平均校正死亡率÷阳性对照的平均校正死亡率×100％，或＝第N天的二化螟生物量÷阳性对照的二化螟生物量×100％，连续测定5次以上(第10天、第20天、第30天、第40天、第50天等)，以时间为横坐标，以持留百分量为纵坐标，绘制环境中Bt外源蛋白活性衰减动态图。

本发明的有益效果是：1)本发明以Bt蛋白的靶标生物二化螟为生物测定对象生物，测定转Bt基因作物释放到环境中的外源蛋白的活性衰减过程，通常情况下，测定的结果表明转Bt基因作物收获2个月后秸秆样品和土壤样品中的外源蛋白已无生物活性，相比用ELISA测定的活性残留期缩短4个月，此技术能为转基因作物环境安全评价提供更科学的参考资料。

具体实施方式

实施例1：

本发明提供一种转Bt基因作物外源蛋白环境持留的生物测定方法，包括如下步骤：

1)转Bt基因作物收割后，每隔10天在种植Bt作物的田块采集秸秆样品和田间土壤样品，收割当日的秸秆样品和田间土壤样品作为阳性对照，收割当日的秸秆样品采集量大于5kg、10cm深的根围土集采量大于10kg，以后每次秸秆样品采集量大于500g、10cm深的根围土大于1000g，采集好的样品用大号自封袋装好，帖上标签，-40℃以下条件可长期保存；

2)冷冻干燥收割当日和收割第N天后的秸秆样品和土壤样品，干燥后的秸秆样品加液氮磨至粒径0.2mm以下，干燥后的土壤样品研细后过60目筛，取3份100g秸秆粉末、3份200g土壤粉末备用，经预处理的样品-40℃以下条件可长期保存；

3)经预备处理后的100g秸秆样品和200g土壤样品分别加入2倍体积的PBS缓冲液，常温震荡提取2h，12000r/min离心20min取上清，再加2倍体积的PBS缓冲液重复提取一次，合并上清，上清于4℃保存不超过2天；

4)总蛋白提取液4℃下经过透析袋(8000-14000)平衡过夜，透析后冷冻干燥浓缩总蛋白提取液至干粉，总蛋白干粉于-20℃以下可长期保存；

5)配制15份各重200g二化螟人工饲料，当人工饲料冷却至45℃时加入100g秸秆样品总蛋白提取物或200g土壤样品的蛋白提取物，并充分搅拌2min，制5种类型的人工饲料：①添加收割后第N天的秸秆总蛋白干粉的人工饲料(处理1)，②添加收割后第N天的土壤总蛋白干粉的人工饲料(处理2)，③添加收割当日的秸秆总蛋白干粉的人工饲料(阳性对照1)，④添加收割当日土壤总蛋白干粉的人工饲料(阳性对照2)，⑤不加任何提取物的人工饲料(空白对照)，每种类型人工饲料各3份，即3次重复；

6)配制好的人工饲料在超净工作台内分装入口径5.5cm、高8cm的饲养瓶中，每种类型人工饲料分装1瓶，每瓶30g，并贴好标签，剩下的人工饲料4℃下保存不超过2个月；

7)每瓶接入15头孵化24小时以内的二化螟幼虫后用保鲜膜和黑布封口，保鲜膜在下层、黑布在上层，并在保鲜膜上用牙签扎孔6个；

8)于28℃、光照16D：8L的环境中培养10天后检查二化螟幼虫的死亡和生长发育情况，计算环境中Bt外源蛋白相对持留量，收割后第N天的持留百分量＝第N天的平均校正死亡率÷阳性对照的平均校正死亡率100％，或第N天的二化螟生物量÷阳性对照的二化螟生物量100％，连续测定5次以上(第10天、第20天、第30天、第40天、第50天等)，以时间为横坐标，以持留百分量为纵坐标，绘制环境中Bt外源蛋白活性衰减动态图。

应当申明的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。上述实施步骤只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此领域的专业人员能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，效果相似，都应涵盖在本发明的保护范围之内。