半胱氨酸示踪法水相制备烟用香料前体的方法及其产品和应用

摘要

本发明提供了一种半胱氨酸示踪法水相制备烟用香料前体的方法及其产品和应用，本发明在低温美拉德反应过程中的不同反应时间添加半胱氨酸示踪剂，接着发生高温美拉德反应，比较其在高温美拉德反应中的色泽抑制效果，从而确定Heyns重排产物形成的临界反应时间，在该临界条件下低温水相制备中间体，所得中间体即为所述烟用香料前体。大大降低了生产成本，满足现代工业所提出的绿色发展的设计要求，完全可以应用于卷烟产品或者食品中。

说明书

技术领域

本发明属于食品化学和食品加工领域，具体涉及一种半胱氨酸示踪法水相制备烟用香料前体的方法及其产品和应用。

背景技术

美拉德反应(Maillard Reaction)，又称非酶褐变或羰氨反应，是还原糖(碳水化合物)与氨基酸/蛋白质在常温或加热时发生的一系列复杂的反应，最终生成棕色甚至黑色的高分子类黑精(或称拟黑素)。美拉德反应过程一般可归纳为初始阶段、中间阶段和高级阶段3个阶段。在初始阶段，酮糖可与氨基化合物生成酮糖基胺，而酮糖基胺可以经过海恩氏(Heyns)分子重排异构成2-氨基-2-脱氧葡萄糖，也被称作Heyns重排产物(HRP)。

在醇化后的烟草中已发现多种HRP，其总含量占烤烟干重的2％左右，并且被证实为烟草香气重要的贡献者。烟叶在自然醇化过程中，氨基糖类先增加，约2年时间达到最高，然后开始下降，氨基糖类的变化趋势与烤烟感官品质变化趋势比较吻合，积累水平达到最高时，烟叶品质最好，因而是烟叶自然醇化进程的一个重要指标。大量研究证明HRP是重要的香味中间体，可改善吸味，圆和烟气，增加甜香和烘烤香，极具在卷烟加香中的应用潜能。

HRP不仅具有完全美拉德反应产物(MRPs)在卷烟中的加香效果，而且稳定性较强，使其有望以独特的优势代替部分MRPs添加至卷烟产品中。据现有的报道，由于美拉德反应十分复杂，产物繁多，反应过程不好控制，造成部分产品加香效果不理想。影响美拉德反应的因素有温度、时间、溶剂、pH值、湿度等，也和参与反应的糖和氨基酸等有很大关系。由于烟草加香所用香料正常使用的温度较高，所需香气并非是常温时具有的香气。在卷烟的燃吸过程中烟头最高温度可达700～800℃，在这样的高温下，完全美拉德反应产物MRPs将分解，自身香气已不易被闻到。因此，加香的作用是使其裂解的产物能起到消除烟杂气，增加香烟吸味，从而达到提高烟叶质量的目的。完全美拉德反应产物在卷烟生产和储存过程中极易发生挥发性香气物质的损失，导致加香作用不能达到预期目标。针对性地制备某些HRP中间体，作为外源香味前体补充添加到烟丝中，能够提高烟叶可用性、方便叶组配方、改善卷烟评吸品质。

国内外许多烟草企业和科研机构都积极开展了HRP的合成研究以及在卷烟加香方面的应用研究。在目前已有技术中，HRP主要在有机溶剂中加热回流制备，通常选择甲醇作为有效的反应溶剂。甲醇作为反应溶剂应用于工业化生产具有较高的生产成本且不安全。甲醇易燃易爆且具有较强的毒性，完全不适用于HRP的工业化生产。工业化的美拉德反应过程一般在高温水相体系下进行，该条件下HRP一旦形成迅速发生脱水、降解等重重叠叠的次级反应，根本不可能稳定制备到目标HRP，即使是实验室水平的微量分析都很难捕获到这些反应中间体。因此有待出现一种水相合成HRP的工艺，实现其安全制备。

发明内容

针对上述现有技术的缺点和不足，本发明提供了半胱氨酸示踪法水相制备烟用香料前体的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现：

半胱氨酸示踪法水相制备烟用香料前体的方法，将1～10重量份的氨基酸和10重量份的酮糖溶解于100～500重量份的水中，调整该混合溶液的pH至6.5～8.5，在70～140℃下进行低温美拉德反应，采用冰浴冷却终止反应，经低温浓缩得到所述烟用香料前体；其中，选定条件下最适反应时间的确定采用半胱氨酸示踪法，具体步骤如下：

(1)按选定比例将氨基酸和酮糖溶解于水中，调整该混合溶液的pH，将所得溶液平均分为5～10份，分别倒入美拉德反应瓶中，在相同的选定温度下进行第一阶段低温美拉德反应，在15～130min内反应不同时间后采用冰浴冷却终止反应；

(2)分别在步骤(1)所得到的各份反应液中加入等量的示踪剂半胱氨酸，各份反应液在相同条件下进行第二阶段高温美拉德反应，采用冰浴冷却终止反应，得到变温美拉德反应液；

(3)分别测定步骤(2)所得到的各份变温美拉德反应溶液在波长420nm下的吸光度值，描绘所得吸光度值与步骤(1)中相应反应时间的关系曲线，根据吸光度值最低点对应的反应时间，确定相应条件下的最适反应时间。

本方法基于半胱氨酸作用于Heyns重排产物可以有效阻止其进一步反应形成呈色物质的机理，在低温美拉德反应过程中的不同反应时间添加半胱氨酸示踪剂，接着发生高温美拉德反应，比较其在高温美拉德反应中的色泽抑制效果，从而确定Heyns重排产物形成的临界反应时间，在该临界条件下低温水相制备中间体，所得中间体即为所述烟用香料前体。

所述氨基酸为丙氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸及其盐中的至少一种；所述酮糖为赤藓酮糖、木酮糖、果糖中的至少一种。

步骤(2)中，示踪剂半胱氨酸的投加量为步骤(1)中氨基酸投加量的0.5～10％。投加量过小会导致美拉德反应体系色泽抑制效果不明显，投加量过多会导致剩余半胱氨酸与还原糖反应，降低半胱氨酸的利用率，影响对变温美拉德反应色泽的判断，同时成本上升。

所述第二阶段高温美拉德反应中，各份反应液的pH调节至6.5～8.5；反应的温度为120～160℃，反应时间为60～200min。

本发明还提供了一种由上述方法制备得到的产品，该产品不仅具有完全美拉德反应产物在卷烟中的加香效果，而且稳定性较强。

本发明的另一目的是提供一种由上述方法制备得到的产品在卷烟中的应用。该产品作为外源香味前体补充添加到烟丝中，能够提高烟叶可用性、方便设计叶组配方、改善吸味，圆和烟气，增加甜香和烘烤香，显著改善卷烟的评吸品质。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)现有公开的技术中，HRP主要在无水甲醇中长时间加热合成，这种方法污染严重、毒性较大、而且成本较高，无法满足现代化工业生产的需要。而本发明所述HRP的制备技术是以水作为溶剂、半胱氨酸作为示踪剂，通过低温美拉德反应水相制备HRP，大大降低了生产成本，满足现代工业所提出的绿色发展的设计要求，完全可以应用于卷烟产品或者食品中。

(2)以半胱氨酸为示踪剂、通过测定变温美拉德反应产物的色泽来判断HRP在水溶液中形成的临界条件，是重要的理论创新和技术创新，并且仅采用分光光度计即可完成整个测定工作，无需标准品及其他试剂或设备，操作简单、成本低廉，具有较强的应用价值。

(3)水相低温制备美拉德反应中间体的方法是以现有美拉德反应香精的加工工艺为基础的技术创新，本发明水相低温制备HRP的技术可在低成本条件下直接应用于实际生产，具有较强的实际应用价值。

附图说明

图1为实施例1中变温美拉德反应溶液吸光度值与第一阶段低温美拉德反应时间的关系曲线图；

图2为实施例1制备的烟用香料前体的表征结果图，其中，(a)为总离子流色谱图，(b)为质谱图；

图3为实施例1中变温美拉德反应溶液吸光度值与第一阶段低温美拉德反应时间的关系曲线图；

图4为实施例1制备的烟用香料前体的表征结果图，其中，(a)为总离子流色谱图，(b)为质谱图。

具体实施方式

为更好地理解本发明，结合实施例进一步阐明发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。

实施例1

将5kg丙氨酸和10kg木酮糖溶解于500kg水中，调节混合溶液pH至7.5，在70℃下进行低温美拉德反应，采用以下步骤确定上述条件下的最适反应时间：

(1)按上述比例将丙氨酸和木酮糖溶解于水中，调节混合溶液pH至7.5，将溶液平均分为9份，分别倒入美拉德反应瓶中，在70℃下加热进行第一阶段低温美拉德反应，分别在10、15、20、25、30、35、40、45和50min后采用冰浴冷却终止反应；

(2)分别在步骤(1)所得到的各份反应液中加入0.6kg半胱氨酸，并调节反应液pH至7.5，然后升温至120℃进行第二阶段高温美拉德反应120min，采用冰浴冷却终止反应，得到变温美拉德反应液；

(3)分别测定步骤(2)所得到的各份变温美拉德反应溶液在波长420nm下的吸光度值，描绘所得吸光度值与步骤(1)中相应反应时间的关系曲线，结果如图1所示，由图1可知，变温美拉德反应液吸光度最低点对应的反应时间为35min，即木酮糖-丙氨酸体系的HRP在水相中形成的临界时间35min，即可确定相应条件下制备烟用香料前体的最适时间为35min。

在所选条件及最适时间下制备Heyns重排产物反应液，进一步经低温浓缩即可得到固体烟用香料前体。

将所得固体烟用香料前体溶于水后通过高效液相色谱串联质谱分析技术对其进行分析，得到总离子流色谱图和质谱图如图2所示，其中，图2(a)为得到的总离子流色谱图，图2(b)为得到的质谱图。根据图2(b)质谱图的离子碎片信息可知，离子碎片为分子离子脱水或脱羧基形成，推断其分子离子峰MH⁺为222，该物质的相对分子质量为221，分子式为C₈H₁₅O₆N，确定该物质为木酮糖-丙氨酸体系的中间体HRP。

实施例2

将20kg天冬氨酸和60kg木酮糖溶解于800kg水中，调节混合溶液pH至8.0后，在120℃下加热发生美拉德反应，采用以下步骤确定上述条件下的最适反应时间：

(1)按上述比例将丙氨酸和木酮糖溶解于水中，调节混合溶液pH至8.0，将溶液平均分为5份，分别倒入美拉德反应瓶中，在120℃下加热进行第一阶段低温美拉德反应，分别在20、25、30、35和40min后采用冰浴冷却终止反应；

(2)分别在步骤(1)所得到的各份反应液中加入2.0kg半胱氨酸，并调节反应液pH至8.0，然后升温至150℃进行第二阶段高温美拉德反应200min，采用冰浴冷却终止反应，得到变温美拉德反应液；

(3)分别测定步骤(2)所得到的各份变温美拉德反应溶液在波长420nm下的吸光度值，描绘所得吸光度值与步骤(1)中相应反应时间的关系曲线，结果如图3所示，由图3可知，变温美拉德反应液吸光度最低点对应的反应时间为30min，即木酮糖-天冬氨酸体系的HRP在水相中形成的临界时间30min，即可确定相应条件下制备烟用香料前体的最适时间为30min。

在所选条件及最适时间下制备Heyns重排产物反应液，进一步经低温浓缩即可得到固体烟用香料前体。

将所得固体烟用香料前体溶于水后通过高效液相色谱串联质谱分析技术对其进行分析，得到总离子流色谱图和质谱图如图4所示，其中，图4(a)为得到的总离子流色谱图，图4(b)为得到的质谱图。根据图4(b)质谱图的离子碎片信息可知，离子碎片为分子离子脱水或脱羧基形成，推断其分子离子峰MH⁺为266，该物质的相对分子质量为265，分子式为C₉H₁₅O₈N，确定该物质为木酮糖-天冬氨酸体系的中间体HRP。

实施例中使用的水为蒸馏水，氨基酸和酮糖使用食品级，其余化学试剂均为分析纯，高效液相色谱-质谱分析实验所用化学试剂均为色谱纯。高效液相色谱-质谱检测条件为：用于分析的分离柱是C18反向高效液相色谱柱，使用的流动相是超纯水与乙腈，进样后用流动相进行梯度洗脱，流速为0.3mL/min，柱温是45℃。质谱分析选择的离子方式为ESI+，毛细管电压为3.5kV，锥孔电压为20V，离子源温度为100℃，脱溶剂气温度为400℃，脱溶剂气流速为700L/h，锥孔气流流速为50L/h，碰撞能量是6V，检测器电压是1800V。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的范围之内。