利用雄蜂聚集区评估东方蜜蜂野生种群数量的方法

摘要

本发明提供了利用雄蜂聚集区评估东方蜜蜂野生种群数量的方法，所述方法中，首先对雄蜂引诱确定聚集区，然后在雄蜂聚集区通过粘取获得雄蜂样本，最后对于雄蜂样本进行DNA提取和遗传分析，对雄蜂进行种群归属，再计算得出特定区域范围内蜂群的数量。本发明方法具有操作步骤简便，且能够高效、准确定位东方蜜蜂DCA，这也为现有蜜蜂研究填补了空白；同时，本发明方法也能够实现对于雄蜂的有效诱捕；进一步的，本发明中通过对于东方蜜蜂的多样性位点进行系统分析、选择以及遗传性分析和计算，能够有效确定特定区域范围内的蜂群数量，这不仅填补了现有技术中对于东方蜜蜂多样性位点研究的空白，同时也能够有效的对于区域内蜜蜂种群数量进行有效的测算。

说明书

技术领域

本发明涉及野生蜜蜂种群评估领域，具体而言，涉及利用雄蜂聚集区评估东方蜜蜂野生种群数量的方法。

背景技术

为了评估授粉昆虫多样性的变化情况以及授粉昆虫是否达到特定区域内植物授粉所需的数量，常常需要统计蜂群特别是野生蜂群的密度。但野外蜂群一般较为隐蔽，不太容易发现，无法通过直接统计蜂群数量的方法获得数据。

在蜜蜂的交配季节，来自多个蜂群的大量雄蜂汇集在一起形成雄蜂聚集区(DroneCongregation Areas，简称DCA)，雄蜂在此区域与处女蜂王进行交配。来自周边区域的大量蜂群的雄蜂在DCA聚集，使得DCA中雄蜂数量可达数百到上万只。在DCA收集雄蜂样品，根据蜜蜂的单倍二倍性生殖特点(即雄蜂基因全部来自蜂王)，当使用具有足够变异信息的微卫星位点时，便可以准确地把样品中的雄蜂分配到不同的蜂王，从而可以利用多态性丰富的位点对雄蜂进行多样性分析，即可评估特定区域范围内的蜂群数量。目前，该方案已用于野生西方蜜蜂(Apis mellifera)的蜂群数量评估。

利用DCA准确推测特定区域的蜂群数量需要满足三个条件：首先，可以在野外高效地定位到DCA的分布地点；其次，可以在DCA收集到大量样品；最后，需要使用多态性较好的位点对样品进行基因型数据的收集。

目前，蜜蜂属的9个蜜蜂种中，对西方蜜蜂的研究最为详细。西方蜜蜂雄蜂喜欢聚集在开阔的场地，周围的树木较矮，雄蜂聚集高度在10－30m。东方蜜蜂是饲养数量处于第二位的蜂种，分布范围较广，野生种群数量较多，但对于该蜂种的研究相对较少。

Punchihewa等(Congregation of Apis cerana indica Fabricius 1798dronesin the canopy of trees in Sri Lanka，Apidologie，21，201－208)在斯里兰卡发现东方蜜蜂的雄蜂聚集在靠近大树的地方，在靠近树冠的露天区域飞行，不会跟随囚禁的蜂王飞到树冠顶部或旁边，飞行高度为4－8m。但在日本，Fujiwara等人(Drone congregation ofApis cerana japonica above large trees.Apidologie，25，331－337)发现东方蜜蜂雄蜂聚集在突出的树木上方的露天区域，雄蜂外出飞行高峰时间为13：20－16：00，估计雄蜂聚集的高度在30－70m，在榉树之外的其他树上方未发现雄蜂聚集。

由于关于东方蜜蜂雄蜂聚集区的数据较少，并且不同的报道内容很不一致，目前对于东方蜜蜂DCA的分布特点尚无定论，导致DCA的发现属于随机事件。在找到DCA后进行收集雄蜂样品时，仍按照西方蜜蜂的方法，尚未形成针对东方蜜蜂雄蜂飞行特点的高效取样方法。对收集的样品进行分析时，亦尚未筛选出多态性丰富的多个位点。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种利用雄蜂聚集区评估东方蜜蜂野生种群数量的方法，所述方法中，首先对雄蜂引诱确定DCA，然后在DCA通过粘取获得雄蜂样本，最后对于雄蜂样本进行DNA提取和遗传分析、对雄蜂进行种群归属，然后再计算得出特定区域范围内蜂群的数量。本发明方法具有操作步骤简便，且能够高效、准确定位东方蜜蜂DCA的优点，这也为现有蜜蜂研究填补了空白；同时，本发明方法也能够实现对于雄蜂的有效诱捕；进一步的，本发明中通过对于东方蜜蜂的多样性位点进行系统分析、选择以及遗传性分析和计算，能够有效确定特定区域范围内的蜂群数量，这不仅填补了现有技术中对于东方蜜蜂多样性位点研究的空白，同时也能够有效的对于特定区域内东方蜜蜂种群数量进行有效的测算。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种利用雄蜂聚集区评估东方蜜蜂野生种群数量的方法，所述方法包括如下步骤：

a)在由树木组成的封闭区域内，将下方拴有过滤嘴的充气气球置于所述封闭区域的露天地带或较高的树枝处，其中，所述过滤嘴中装载有蜂王物质；

然后，调整气球高度，根据被吸引的雄蜂数量确定雄蜂集中分布区域，即定位为雄蜂聚集区，并作为取样点；

b)将下方拴有过滤嘴的充气气球置于雄蜂聚集区，其中，拴绳上涂抹有胶水；然后，通过粘取捕获雄蜂，并将采集到的雄蜂样本保存；

c)提取雄蜂样本DNA，并筛选多态性丰富的位点引物进行PCR扩增，然后对PCR产物进行遗传分析，并评估雄蜂样本所属蜂群的数量；最后，根据雄蜂的平均飞行距离，计算出特定区域范围内蜂群的种群数量。

可选的，本发明中，所述蜂王物质为9－ODA稀释液。

可选的，本发明中，所述9－ODA稀释液是由9－ODA溶于异丙醇和超纯去离子水中制备得到的。

可选的，本发明中，所述调整气球高度为在5～15m的高度范围内调整气球的高度。

可选的，本发明中，所述充气气球的下方拴有1～3个过滤嘴；

其中，当过滤嘴的数量大于一个时，多个过滤嘴采用等间距设置。

可选的，本发明中，雄蜂的捕获集中于无风、温暖的晴朗天气进行；和，在12：00～14：00的时间范围内。

可选的，本发明中，采集到的雄蜂样本是放入乙醇溶液中进行保存的。

可选的，本发明中，所述提取雄蜂样本DNA为：取下每只雄蜂的后足，然后进行DNA提取。

可选的，本发明中，所述DNA提取为采用5～10％Chelex进行提取。

可选的，本发明中，所述对PCR产物进行遗传分析为：将扩增后所得PCR产物稀释10～20倍后，再使用遗传分析仪进行遗传分析。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明中，针对于野生东方蜜蜂的种群特性，通过采用特定的方法进行DCA定位、样品诱捕以及多样性位点统计分析，从而能够有效评估特定区域内野生东方蜜蜂的种群数量，不仅方法简便有效，而且还填补了对于野生东方蜜蜂种群的空白，也为对野生蜜蜂的进一步研究提供了新的技术手段与参考。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

虽然对于野生西方蜜蜂蜂群数量的研究方法较为成熟，但由于西方蜜蜂和东方蜜蜂习性有所不同，采用相同的方法无法准确得出野生东方蜜蜂的蜂群数量信息，目前，野生东方蜜蜂种群研究的主要问题在于：

(1)寻找DCA：目前对于东方蜜蜂DCA的描述和研究较少，根据已有资料不能高效确定雄蜂聚集地的环境特点；

(2)捕捉雄蜂：诱捕网挂在气球下进行收集雄蜂不可行，即使蜂王物质置于网内，东方蜜蜂的雄蜂只是在诱捕网周围飞行，并不进入，无法获取雄蜂样品；

(3)样品分析：目前未针对东方蜜蜂多样性位点进行过系统选择。

为了解决上述技术问题，并为特定区域内野生东方蜜蜂种群数量的评估提供确实、有效的计算方法，本发明针对野生东方蜜蜂种群的特性，采用了如下的评估测算方法：

a)DCA定位：

在由树木组成的封闭区域内，将下方拴有过滤嘴的充气气球置于所述封闭区域的露天地带或较高的树枝处，其中，所述过滤嘴中装载有蜂王物质；然后，调整气球高度，并确定雄蜂集中分布区域，即定位为雄蜂聚集区，并作为取样点；

由于通过野外实验发现，雄蜂聚集区通常分布在相对封闭的环境，因而可以选择在由树木形成的半圆形或三角形的封闭空间内进行DCA的筛选和定位；

作为实验工具的充气气球优选的为氢气或氦气气球，由于氦气使用更为安全，故而优选的使用氦气气球进行实验；

优选的，氦气气球以白色尼龙扎绳封口，扎绳上连接透明鱼线作为拴绳使用，用长度约为10－20cm的透明鱼线拴在拴绳上作出枝杈状，其端部拴住装载有蜂王物质(用以引诱雄蜂)的过滤嘴，同时，第一个连接过滤嘴的枝杈状结点与氦气气球的底部保持一定的距离；

优选的，过滤嘴的数量为3个，且在拴绳上等距分布；

优选的，本发明所述蜂王物质为9－ODA稀释液，所述稀释液优选的是由21mg 9－ODA、1ml异丙醇以及1％超纯去离子水混合而成；进一步的，每个过滤嘴中都通过注射装载20μl的蜂王物质；

优选的，本发明中，将充气气球置于筛选好的、由树木形成的半圆形或三角形的封闭空间内，可以置于该封闭空间的露天区域，或者是置于该封闭空间四周较高的树枝处，树枝的高度优选的为8～23m；然后，通过抖动卷线器，将气球的高度在5～15m内不断调整，观测雄蜂集中分布地，并定位DCA及取样地点；

b)将下方拴有过滤嘴的充气气球置于雄蜂聚集区，其中，拴绳上涂抹有胶水；然后，通过上下抖动拴绳、粘取捕获雄蜂，并将采集到的雄蜂样本保存；

由于野生东方蜜蜂无法通过诱捕网进行捕获，因而必须采用新的技术手段解决这一问题，本发明中采用胶水粘取的方法就能够很好的解决问题，由蜂王物质所引诱过来的雄蜂可以较为容易的被胶水粘附于拴绳之上，这就能够快速的进行样本的采集；

优选的，本发明中，所用胶水为粘蝇胶，可以将粘蝇胶直接涂抹于拴绳上，涂抹的区间为气球底部至最下方的过滤嘴处；

由于雄蜂在聚集区出现的时间较短，因而，为了能够在短时间内获取大量样品，因而优选的集中在无风、温暖的晴朗天气，于12：00～14：00，更优选的于12：45～13：30进行样本的捕获与收集，进而提高采样的效率；

优选地，通过诱捕收集到的雄蜂样本置于盛有100％酒精的样品管中进行保存。

c)提取雄蜂样本DNA，并筛选多态性丰富的位点引物进行PCR扩增，然后对PCR产物进行遗传分析，并评估雄蜂样本所属蜂群的数量；然后，根据雄蜂的平均飞行距离，计算出特定区域范围内蜂群的种群数量。

对于雄蜂样本的提取，优选的是取下样本中每只雄蜂的一个后足，以5％Chelex进行DNA的提取，然后筛选出多态性丰富的位点；

优选的，所述遗传性分析是将PCR产物稀释10～20倍后，利用ABI3130xl遗传分析仪进行检测，并收集整理雄蜂基因型数据；标准群体遗传参数可以使用软件分析，并进一步可以使用相关软件统计分析样本雄蜂所属蜂群；进一步的，还可以通过利用雄蜂的平均飞行距离，计算出特定区域范围内的蜂群数量。

实施例1

(1)DCA定位

通过野外的试验发现，雄蜂聚集区通常分布在相对封闭的环境，在有相对明显的树木作为标记物的地方，周围还需要有其他树木与其形成一个半圆形或三角形的封闭空间，应以此为标准筛选DCA分布地；

将气球充满氦气，用白色尼龙扎绳系住充满氦气的气球，把透明渔线系在尼龙扎绳上作为拴绳，在气球下方的拴绳上间隔地系上3个长度为10cm的透明鱼线作出枝杈状，在枝杈状端部系上过滤嘴，在每个过滤嘴上注射20微升的蜂王物质(9－ODA)(把21mg 9－ODA溶于1ml异丙醇和1％超纯去离子水的稀释液)，放到筛选好的DCA分布地的露天区域或高度为8～23m的树枝处，抖动卷线器，在5～15m的高度范围内，不断调整气球高度，可很快看到雄蜂集中分布的地方，以此定位DCA及取样地点；

此外，2015年及2016年在3个DCA的同一个地点均收集到大量雄蜂，说明东方蜜蜂的DCA可在同一地点反复出现；

由此可见，特定的DCA在多个繁殖季节可稳定出现在同一地点；进一步的，这一特性使得我们可以多次利用已找到的DCA进行相关研究。

(2)捕捉雄蜂

雄蜂集中出现在DCA的时间较短，为了能在短时间内获取大量样品，应集中在无风、温暖的晴朗天气于12：45－13：30期间进行收集。收集雄蜂时，应用粘蝇胶直接涂抹渔线，涂抹区间为气球下方至最下面一个过滤嘴处，在雄蜂飞行的集中地点半小时内可以收集300只以上。收集的雄蜂放入盛有100％酒精的样品管中进行保存；

(3)样品分析

取下每只雄蜂的一个后足，使用5％Chelex进行DNA提取。选取来自不同群体的8个蜜蜂个体，利用其DNA进行PCR扩增，PCR产物10～20倍稀释后利用ABI3130xl遗传分析仪进行检测，使用其对应的GeneMapper软件收集整理雄蜂基因型数据。通过这些样品对75个微卫星位点进行筛选，可挑选出22个多态性较好的位点，以确保位点的稳定性和多样性。位点详细信息如下表1所示：

表1 筛选出的多态性位点

对从不同DCA收集的雄蜂样品使用筛选出的多态性丰富的位点进行基因型数据的收集。数据分析时，标准群体遗传参数可使用软件Excel Microsatellite Toolkit以及Fstat进行分析，为估计这些雄蜂来自多少蜂群，可使用Colony软件进行分析，之后，利用雄蜂的平均飞行距离，即可计算出特定区域范围内的蜂群数量。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。