检测ABO血型基因型的方法和ABO血型基因座的等位基因分型标准物的模板

摘要

本发明公开了检测ABO血型基因型的方法和ABO血型基因座的等位基因分型标准物的模板。本发明所提供的方法，包括如下步骤：以待测样本的基因组DNA或总DNA为模板，采用引物组合进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，然后确定含有哪几种等位基因，进一步确定待测样本的ABO血型基因型。引物组合由6条引物组成，核苷酸序列依次为序列表中的序列1至序列6。实验证明，采用本发明提供的方法检测ABO血型基因型，准确率为100％；采用本发明提供的重组质粒组合物作为ABO血型基因座的等位基因分型标准物的模板，可扩增获得ABO血型基因座的等位基因分型标准物，并可在多种商业试剂盒中使用。本发明具有重要的应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及法医学技术领域，具体涉及检测ABO血型基因型的方法和ABO血型基因座的等位基因分型标准物的模板。

背景技术

ABO血型是经典的人类遗传标记，在输血、亲子鉴定、人类学研究、法医物证检验等领域均占据重要地位。针对ABO血型，传统的血清学检验方法是对抗原或抗体进行检验，而在法医物证检验中最为常用的方法是检验抗原物质，但由于ABO血型抗原是糖脂或糖蛋白，因此检验时易受抗原活性、抗体的特异性以及微生物的污染等因素的影响。尤其针对性犯罪中的混合斑检验，传统的血清学检验方法也有着无法克服的局限性，使得无法分离女性受害人和男性嫌疑人的血型物质，只能根据受害人的血型来推测嫌疑人的血型，一旦遇到受害人血型遮蔽的情况，则无法准确推断混合斑中男性物质的血型。1985年，Gill研究组将差异裂解法和DNA指纹图技术应用于法医学检验，成功的分别提取混合斑中精子DNA和女性DNA，解决了困扰法医物证检验多年的难题，这也使DNA技术检验混合斑中精子血型成为可能。1990年，Yamamoto等人报道了ABO血型基因的核苷酸序列，准确检测到各等位基因在DNA序列上不同的SNP位点碱基的差异，这些研究证实利用ABO血型基因上SNP位点的差异进行ABO血型的基因分型将是一种非常有效的方法，特别是对于法医学实践中微量或降解的检材，但是现有的ABO血型基因SNP分型仍有一些不足，例如无法重复；虽可以重复，但在毛细管电泳平台上的峰型易出现分叉、肩峰、不对称等等现象，导致无法准确读取分型。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何检测ABO血型基因型。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了引物组合。

本发明所提供的引物组合，可由引物ABO-F1、引物ABO-F2、引物ABO-F3、引物ABO-R1、引物ABO-R2和引物ABO-R3组成；

所述引物ABO-F1可为如下A1)或A2)：

A1)序列表中的序列1所示的单链DNA分子；

A2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；

所述引物ABO-F2可为如下A3)或A4)：

A3)序列表中的序列2所示的单链DNA分子；

A4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；

所述引物ABO-F3可为如下A5)或A6)：

A5)序列表中的序列3所示的单链DNA分子；

A6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；

所述引物ABO-R1可为如下A7)或A8)：

A7)序列表中的序列4所示的单链DNA分子；

A8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；

所述引物ABO-R2可为如下A9)或A10)：

A9)序列表中的序列5所示的单链DNA分子；

A10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；

所述引物ABO-R3可为如下A11)或A12)：

A11)序列表中的序列6所示的单链DNA分子；

A12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子。

所述引物组合的应用也属于本发明的保护范围。所述引物组合的应用可为(b1)或(b2)：

(b1)制备用于检测ABO血型基因型的试剂盒；

(b2)检测ABO血型基因型。

含有所述引物组合的试剂盒也属于本发明的保护范围。所述试剂盒可用于检测ABO血型基因型。

含有所述引物组合的试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。含有所述引物组合的试剂盒的制备方法，可包括将各条引物单独包装的步骤。

为解决上述技术问题，本发明还提供了检测ABO血型基因型的方法。

本发明所提供的检测ABO血型基因型的方法，具体可为方法一，包括如下步骤：以待测样本的基因组DNA或总DNA为模板，采用所述引物组合进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，然后进行如下判断：

(d1)如果所述PCR扩增产物中含有DNA片段甲和DNA片段丁，且不含有DNA片段乙和DNA片段丙，则待测样本的ABO血型基因型为AA；

(d2)如果PCR扩增产物中含有所述DNA片段甲、所述DNA片段乙和所述DNA片段丁，且不含有所述DNA片段丙，则待测样本的ABO血型基因型为AB；

(d3)如果PCR扩增产物中含有所述DNA片段甲、所述DNA片段丙和所述DNA片段丁，且不含有所述DNA片段乙，则待测样本的ABO血型基因型为AO；

(d4)如果PCR扩增产物中含有所述DNA片段乙和所述DNA片段丁，且不含有所述DNA片段甲和所述DNA片段丙，则待测样本的ABO血型基因型为BB；

(d5)如果PCR扩增产物中含有所述DNA片段甲、所述DNA片段乙、所述DNA片段丙和所述DNA片段丁，则待测样本的ABO血型基因型为BO；

(d6)如果PCR扩增产物中含有所述DNA片段甲和所述DNA片段丙，且不含有所述DNA片段乙和所述DNA片段丁，则待测样本的ABO血型基因型为OO；

所述DNA片段甲的核苷酸序列如序列表中的序列7所示；

所述DNA片段乙的核苷酸序列如序列表中的序列8所示；

所述DNA片段丙的核苷酸序列如序列表中的序列9所示；

所述DNA片段丁的核苷酸序列如序列表中的序列10所示。

上述方法中，所述“进行PCR扩增”的反应体系可由KCl、MgCl₂、牛血清白蛋白、Tween-20、甘油、NaN₃、dNTP、引物混合物、Taq金牌酶、模板和Tris-HCl缓冲液组成；引物混合物即为所述引物组合中的各条引物组成的混合物。反应体系中，KCl的浓度具体可为50mM，MgCl₂的浓度具体可为1.6mM，牛血清白蛋白的浓度具体可为0.8mg/mL，Tween-20的浓度具体可为0.2％(v/v)，甘油的浓度具体可为3.2％(v/v)，NaN₃的浓度具体可为0.02％(v/v)，dATP、dTTP、dGTP和dCTP的浓度具体均可为200μM，所述引物ABO-F1、所述引物ABO-F2、所述引物ABO-F3、所述引物ABO-R1、所述引物ABO-R2和所述引物ABO-R3的浓度具体均可为0.32μM，Taq金牌酶的浓度具体可为0.1U/μL，模板具体可为0.05ng/μL，Tris-HCl缓冲液的浓度具体可为pH8.3、20mM的Tris-HCl。

上述方法中，所述“进行PCR扩增”的反应程序具体可为：95℃预变性11min；94℃变性30s，59℃退火2min，72℃延伸1min，28次循环；60℃延伸60min；4℃保存。

本发明所提供的检测ABO血型基因型的方法，具体可为方法二，包括如下步骤：检测待测样本的基因组DNA或总DNA中是否含有所述DNA片段甲、所述DNA片段乙、所述DNA片段丙或所述DNA片段丁，然后进行如下判断：

(e1)如果待测样本的基因组DNA或总DNA中含有所述DNA片段甲和所述DNA片段丁，且不含有所述DNA片段乙和所述DNA片段丙，则待测样本的ABO血型基因型为AA；

(e2)如果待测样本的基因组DNA或总DNA中含有所述DNA片段甲、所述DNA片段乙和所述DNA片段丁，且不含有所述DNA片段丙，则待测样本的ABO血型基因型为AB；

(e3)如果待测样本的基因组DNA或总DNA中含有所述DNA片段甲、所述DNA片段丙和所述DNA片段丁，且不含有所述DNA片段乙，则待测样本的ABO血型基因型为AO；

(e4)如果待测样本的基因组DNA或总DNA中含有所述DNA片段乙和所述DNA片段丁，且不含有所述DNA片段甲和所述DNA片段丙，则待测样本的ABO血型基因型为BB；

(e5)如果待测样本的基因组DNA或总DNA中含有所述DNA片段甲、所述DNA片段乙、所述DNA片段丙和所述DNA片段丁，则待测样本的ABO血型基因型为BO；

(e6)如果待测样本的基因组DNA或总DNA中含有所述DNA片段甲和所述DNA片段丙，且不含有所述DNA片段乙和所述DNA片段丁，则待测样本的ABO血型基因型为OO。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种作为ABO血型基因座的等位基因分型标准物的模板的DNA组合物，其含有所述DNA片段甲、所述DNA片段乙、所述DNA片段丙和所述DNA片段丁。

所述DNA组合物具体可由所述DNA片段甲、所述DNA片段乙、所述DNA片段丙和所述DNA片段丁组成。

所述DNA组合物中，所述DNA片段甲、所述DNA片段乙、所述DNA片段丙和所述DNA片段丁的质量比可为1：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)。

所述DNA组合物中，所述DNA片段甲、所述DNA片段乙、所述DNA片段丙和所述DNA片段丁的质量比具体可为1：1：1：1。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种作为ABO血型基因座的等位基因分型标准物的模板的重组质粒组合物。所述重组质粒组合物是通过如下方法制备的：将所述DNA片段甲、所述DNA片段乙、所述DNA片段丙和所述DNA片段丁分别插入到4个载体中，得到4个重组载体；将所述4个重组载体混合，得到重组质粒组合物；

所述重组质粒组合物中，所述载体可为克隆载体。所述克隆载体具体可为质粒pMD18-T。

所述DNA组合物或所述重组质粒组合物的应用也属于本发明的保护范围。所述DNA组合物或所述重组质粒组合物的应用为a1)或a2)或a3)：

a1)作为ABO血型基因座的等位基因分型标准物的模板；

a2)制备ABO血型基因座的等位基因分型标准物；

a3)检测ABO血型基因座的等位基因分型。

所述DNA片段甲、所述DNA片段乙、所述DNA片段丙和所述DNA片段丁均可以人的基因组DNA为模板，采用所述引物组合(各个引物均不经过荧光修饰)进行PCR扩增获得。

所述引物ABO-F1、所述引物ABO-F2和所述引物ABO-F3的5’末端均可经过荧光修饰，以便于对PCR扩增产物进行毛细管电泳检测。所述引物ABO-F1、所述引物ABO-F2和所述引物ABO-F3的5’末端具体均可经过TAMRA修饰。

实验证明，采用本发明提供的引物组合检测ABO血型基因型，准确率为100％；采用本发明提供的重组质粒组合物作为ABO血型基因座的等位基因分型标准物的模板，可扩增获得ABO血型基因座的等位基因分型标准物，并可在多种商业试剂盒中使用。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为实施例1步骤二的实验结果。

图2为实施例3步骤3的实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

Typer500内标为公安部物证鉴定中心的产品。去离子甲酰胺为ABI公司的产品，产品目录号为4311320。ABI3130xl遗传分析仪和Nanodrop1000微量分光光度计均为ABI公司的产品。质粒pMD18-T为TaKaRa公司的产品，产品目录号为6011。

实施例1、检测ABO血型基因座的等位基因的基因型

一、引物组合的制备

用于检测ABO血型基因座的等位基因的基因型的引物组合如下：

引物ABO-F1：5’-TAMRA-ACACCCCGGAAGGATGTCCTCGTGGTGA-3’(5’末端进行TAMRA修饰)(序列表中序列1)；

引物ABO-F2：5’-TAMRA-GGAAGGATGTCCTCGTGGTA-3’(5’末端进行TAMRA修饰)(序列表中序列2)；

引物ABO-F3：5’-TAMRA-AGTGGACGTGGACATGGAGTTCC-3’(5’末端进行TAMRA修饰)(序列表中序列3)；

引物ABO-R1：5’-AATGTCCACAGTCACTCGCCACT-3’(序列表中序列4)；

引物ABO-R2：5’-CCCGAAGAACCCCCCCAG-3’(序列表中序列5)；

引物ABO-R3：5’-TTTTTCGAAGAACGCCCCCAT-3’(序列表中序列6)。

人工合成引物ABO-F1、引物ABO-F2、引物ABO-F3、引物ABO-R1、引物ABO-R2和引物ABO-R3。

二、检测ABO血型基因座的等位基因的基因型

待测样本为样本一、样本二、样本三、样本四、样本五或样本六：

样本一：已鉴定血型基因型为AA的人的血液；

样本二：已鉴定血型基因型为AB的人的血液；

样本三：已鉴定血型基因型为AO的人的血液；

样本四：已鉴定血型基因型为BB的人的血液；

样本五：已鉴定血型基因型为BO的人的血液；

样本六：已鉴定血型基因型为OO的人的血液。

1、以待测样本的基因组DNA为模板，采用步骤一制备的引物组合进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

反应体系由KCl、MgCl₂、牛血清白蛋白、Tween-20、甘油、NaN₃、dNTP、引物混合物、Taq金牌酶、模板和Tris-HCl缓冲液组成；引物混合物即为步骤一制备的引物组合中的各条引物组成的混合物。反应体系中，KCl的浓度为50mM，MgCl₂的浓度为1.6mM，牛血清白蛋白的浓度为0.8mg/mL，Tween-20的浓度为0.2％(v/v)，甘油的浓度为3.2％(v/v)，NaN₃的浓度为0.02％(v/v)，dATP、dTTP、dGTP和dCTP的浓度均为200μM，引物ABO-F1、引物ABO-F2、引物ABO-F3、引物ABO-R1、引物ABO-R2和引物ABO-R3的浓度均为0.32μM，Taq金牌酶的浓度为0.1U/μL，模板为0.05ng/μL，Tris-HCl缓冲液的浓度为pH8.3、20mM的Tris-HCl。

反应程序：95℃预变性11min；94℃变性30s，59℃退火2min，72℃延伸1min，28次循环；60℃延伸60min；4℃保存。

2、完成步骤1后，向去离子甲酰胺中加入1μL PCR扩增产物和0.2μL Typer500内标，然后用去离子甲酰胺定容至20μL，得到反应液。

3、完成步骤2后，取反应液，95℃变性5min，迅速转移至-20℃放置5min，然后用ABI3130xl遗传分析仪进行毛细管电泳检测，得到DNA检测图谱。电泳条件为：进样电压1.2kV，进样时间为18s。

实验结果见图1(A为样本一，B为样本二，C为样本三，D为样本四，E为样本五，F为样本六)。结果表明，ABO血型基因座有4个等位基因，分别命名为等位基因1(大小为187bp，核苷酸序列如序列表中序列7所示)、等位基因2(大小为190bp，核苷酸序列如序列表中序列8所示)、等位基因3(大小为192bp，核苷酸序列如序列表中序列9所示)和等位基因4(大小为200bp，核苷酸序列如序列表中序列10所示)。4个等位基因对应6个血型基因型：血型基因型为AA的样本一中含有等位基因1和等位基因4；血型基因型为AB的样本二中含有等位基因1、等位基因2和等位基因4；血型基因型为AO的样本三中含有等位基因1、等位基因3和等位基因4；血型基因型为BB的样本四中含有等位基因2和等位基因4；血型基因型为BO的样本五中含有等位基因1、等位基因2、等位基因3和等位基因4；血型基因型为OO的样本六中含有等位基因1和等位基因3。

实施例2、检测ABO血型基因型的方法

一、检测ABO血型基因型的方法

采用实施例1步骤一制备的引物组合可检测ABO血型基因型。具体步骤为：以待测样本的基因组DNA或总DNA为模板，采用步骤一制备的引物组合进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，然后根据PCR扩增产物的核苷酸序列，确定含有等位基因1、等位基因2、等位基因3和等位基因4中的哪几种，然后进行如下判断：如果含有等位基因1和等位基因4，则待测样本的ABO血型基因型为AA；如果含有等位基因1、等位基因2和等位基因4，则待测样本的ABO血型基因型为AB；如果含有等位基因1、等位基因3和等位基因4，则待测样本的ABO血型基因型为AO；如果含有等位基因2和等位基因4，则待测样本的ABO血型基因型为BB；如果含有等位基因1、等位基因2、等位基因3和等位基因4，则待测样本的ABO血型基因型为BO；如果含有等位基因1和等位基因3，则待测样本的ABO血型基因型为OO。

二、准确性

1、分别以90片待测血卡(圆形，直径均为1.0mm)为模板，采用实施例1步骤一制备的引物ABO-F1、引物ABO-F2、引物ABO-F3、引物ABO-R1、引物ABO-R2和引物ABO-R3进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

反应体系由KCl、MgCl₂、牛血清白蛋白、Tween-20、甘油、NaN₃、dNTP、引物混合物、Taq金牌酶、模板和Tris-HCl缓冲液组成；引物混合物即为上述各条引物组成的混合物。反应体系中，KCl的浓度为50mM，MgCl₂的浓度为1.6mM，牛血清白蛋白的浓度为0.8mg/mL，Tween-20的浓度为0.2％(v/v)，甘油的浓度为3.2％(v/v)，NaN₃的浓度为0.02％(v/v)，dATP、dTTP、dGTP和dCTP的浓度均为200μM，各条引物的的浓度均为0.32μM，Taq金牌酶的浓度为0.1U/μL，模板为1片待测血卡，Tris-HCl缓冲液的浓度为pH8.3、20mM的Tris-HCl。

反应程序：95℃预变性11min；94℃变性30s，59℃退火2min，72℃延伸1min，28次循环；60℃延伸60min；4℃保存。

2、完成步骤1后，向去离子甲酰胺中加入1μL PCR扩增产物和0.2μL Typer500内标，然后用去离子甲酰胺定容至20μL，得到反应液。

3、完成步骤2后，取反应液，95℃变性5min，迅速转移至-20℃放置5min，然后用ABI3130xl遗传分析仪进行毛细管电泳检测，得到DNA检测图谱；然后按照步骤一的结论确定待测血卡的血型基因型。电泳条件为：进样电压1.2kV，进样时间为18s。

采用经典的血清学方法检测90片待测血卡的血型基因型。

实验结果见表1。结果表明，采用步骤一提供的方法检测ABO血型基因型，准确率为100％。

表1

实施例3、ABO血型基因座的等位基因分型标准物的模板的制备和验证

1、重组质粒的获得

(1)人工合成DNA片段甲、DNA片段乙、DNA片段丙和DNA片段丁。DNA片段甲的核苷酸序列如序列表中的序列7所示。DNA片段乙的核苷酸序列如序列表中的序列8所示。DNA片段丙的核苷酸序列如序列表中的序列9所示。DNA片段丁的核苷酸序列如序列表中的序列10所示。

(2)制备表2所示的4个重组质粒，包含实施例1中ABO血型基因座的4个等位基因。根据测序结果，各重组质粒的详细信息如下：

重组质粒甲：将步骤(1)合成的DNA片段甲和质粒pMD18-T连接，得到重组质粒甲；

重组质粒乙：将步骤(1)合成的DNA片段乙和质粒pMD18-T连接，得到重组质粒乙；

重组质粒丙：将步骤(1)合成的DNA片段丙和质粒pMD18-T连接，得到重组质粒丙；

重组质粒丁：将步骤(1)合成的DNA片段丁和质粒pMD18-T连接，得到重组质粒丁。

表2

编号基因座等位基因重组质粒名称1ABO血型基因座1重组质粒甲2ABO血型基因座2重组质粒乙3ABO血型基因座3重组质粒丙4ABO血型基因座4重组质粒丁

2、ABO血型基因座的等位基因分型标准物的模板的制备

(1)利用Nanodrop1000微量分光光度计分别测量并稀释步骤1中获得的重组质粒DNA的浓度至1ng/μL，获得各重组质粒的稀释液。

(2)完成步骤(1)后，取各重组质粒的稀释液1μL进行混合，然后用超纯水定容至1mL，得到ABO血型基因座的等位基因分型标准物的模板。

ABO血型基因座的等位基因分型标准物的模板中，步骤一中各个等位基因的DNA浓度均为1pg/μL。

3、ABO血型基因座的等位基因分型标准物的模板的验证

(1)以ABO血型基因座的等位基因分型标准物的模板作为模板，采用实施例1步骤一制备的引物ABO-F1、引物ABO-F2、引物ABO-F3、引物ABO-R1、引物ABO-R2和引物ABO-R3进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

反应体系和反应程序同实施例1步骤二中1。

(2)完成步骤(1)后，向去离子甲酰胺中加入1μL PCR扩增产物和0.2μL Typer500内标，然后用去离子甲酰胺定容至20μL，得到反应液。

(3)完成步骤(2)后，取反应液，95℃变性5min，迅速转移至-20℃放置5min，然后用ABI3130xl遗传分析仪进行毛细管电泳检测，得到DNA检测图谱。电泳条件为：进样电压1.2kV，进样时间为18s。

实验结果见图2。结果表明，ABO血型基因座的各等位基因分型完整、正确，峰型尖锐清晰，无杂峰，均衡性良好。因此，使用ABO血型基因座的等位基因分型标准物的模板可以制备ABO血型基因座的等位基因分型标准物。

<110> 公安部物证鉴定中心

<120> 检测ABO血型基因型的方法和ABO血型基因座的等位基因分型标准物的模板

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

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acaccccgga aggatgtcct cgtggtga 28

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ggaaggatgt cctcgtggta 20

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<213> 人工序列

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aatgtccaca gtcactcgcc act 23

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<212> DNA

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tttttcgaag aacgccccca t 21

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