一种能促进蛋白可溶性表达及提高表达量的重组表达载体

摘要

本申请属于基因工程技术领域，具体涉及一种能促进蛋白可溶性表达及提高蛋白表达量的重组表达载体。重组表达载体pET21b‑HEMBP（Pyr）为原核表达载体，在pET21b的基础上双酶切后，重组连接有HE‑MBP（Pyr）‑TEV 序列；具体通过构建重组质粒pUC57‑HEMBP（Pyr）‑Nb、酶切、连接、转化、筛选等步骤构建获得。该重组表达载体在蛋白表达中的应用，可用于表达单克隆抗体、抗原、多聚蛋白、c‑di‑GMP和c‑GAMP合成酶等多种蛋白。本申请通过构建改造、构建新的重组表达载体，可以较好地提高蛋白表达量和提高蛋白的可溶度，在基因工程、蛋白工程中具有较好地实用价值和推广应用意义。

说明书

技术领域

本申请属于基因工程技术领域，具体涉及一种能促进蛋白可溶性表达及提高蛋白表达量的重组表达载体。

背景技术

随着基因组学、蛋白组学和生物信息学等领域的科研进展，重组DNA技术已广泛应用于各种靶蛋白的应用研究，如生物化学、结构生物学、生物技术等应用研究。作为重组DNA技术应运而生的产物，融合蛋白已然是一类具有多重功能特性的新型生物分子。DNA重组技术引入实现了靶蛋白在各种宿主生物系统中的鉴定、改造、表达、分离和纯化，目前应用较多的宿主生物系统有：细菌 (大肠杆菌)、酵母、植物、昆虫及哺乳动物细胞系。在这些宿主生物中大肠杆菌以其繁殖速度快、生产成本低、蛋白产量高等优势占据主导地位，在大肠杆菌中表达的蛋白产物也广泛应用于工业生产、疫苗研发及蛋白结构检测功能性分析等。

然而，大肠杆菌由于存在自身局限性，如缺乏对真核生物蛋白的翻译后修饰，外源重组蛋白大部分以包涵体形式表达。有报道显示，人类的相关蛋白有75%可以在大肠杆菌中表达，但只有25%为有活性的可溶性表达（Büssow K,et.al.，Structural genomics ofhuman proteins--target selection and generation of a public catalogue ofexpression clones，Microb Cell Fact.，2005，5：4~21）。蛋白表达过程中无法正确折叠，致使大量中间体积累沉降而形成包涵体，包涵体是重组蛋白生产过程中的瓶颈。目前人们已研究出多种方案来解决大肠杆菌表达外源蛋白的局限性及缺陷，如工程菌的改造、诱导条件的优化 (诱导温度、诱导时间、诱导剂浓度等)、分子伴侣共表达、添加融合标签等。

融合标签一般是在大肠杆菌中稳定可溶性表达的多肽或蛋白质分子，该标签的使用不仅可以促进与其相连的靶蛋白在大肠杆菌中正确折叠提高可溶性表达还便于蛋白纯化，另外表达出来的目的蛋白还可用于鉴定和功能研究。根据融合标签的功能可将其分为两种：一种是促进重组蛋白可溶性表达的可溶性标签，如谷胱甘肽S-转移酶 (GST)、麦芽糖结合蛋白 (MBP)、硫氧还蛋白A (TrxA)、小泛素样修饰蛋白 (SUMO)、类固醇异构酶 (KSI)及Trp LE等；另一种是便于重组蛋白纯化的亲和标签，亲和标签除了目前应用最多的多聚组氨酸标签（His6）外，还有c-myc、HA、FLAG、1D4、多聚精氨酸、链霉亲和素结合标签、钙调蛋白结合多肽等。一般在构建表达载体时会同时加入亲和标签和可溶性标签以便于重组蛋白的可溶性表达后纯化。由于融合标签可能会干扰靶蛋白的正确折叠及功能活性，所以在设计重组表达载体时，需要在融合标签和目的蛋白之间设计一个蛋白酶切割位点，以便通过相应蛋白酶切除融合标签后获取靶蛋白。

烟草蚀纹病毒 (Tobacco etch virus，TEV) 蛋白酶是目前应用较多的蛋白酶之一，该蛋白酶高特异性识别ENLYFQS/G氨基酸序列；对靶蛋白没有非特异性蛋白水解作用；低温、不同pH值缓冲液、高离子强度的条件下TEV蛋白酶仍有活性。另外，TEV蛋白酶酶切是紧邻着识别位点的C端，酶切后保持靶蛋白的N端完整，是一种非常好的内切蛋白酶。

His6标签是目前应用最广的亲和标签之一。His6标签分子量小，不会干扰蛋白的功能和结构，因此His6标签在晶体学研究中广泛应用。另外，His6标签还可以通过固定化金属离子亲和层析来纯化其融合的靶蛋白。虽然His6标签不会干扰蛋白的功能和结构且便于亲和纯化，但是融合His6标签进行原核表达的蛋白有30~50%是包涵体表达（Smyth DR,et.al.， Crystal structures of fusion proteins with large-affinity tags，Protein Sci.，2003，12(7):1313-22）。另外，用His6标签标记的亲合体在用于体内放射性核素分子成像应用中在机体肝脏内出现放射性积累的现象明显高于不用His6标记的亲合体（Tolmachev V, et.al.，HEHEHE-tagged affibody molecule may be purified byIMAC, is conveniently labeled with [⁹⁹(m)Tc(CO)₃](+)，and>

MBP(maltose binding protein)即麦芽糖结合蛋白，是由大肠杆菌malIE基因编码的蛋白，它是细菌麦芽糖转运系统的成员之一。MBP蛋白亲水性强，能够与多种蛋白融合，作为一个分子伴侣可以帮助靶蛋白正确折叠，常用于靶蛋白的可溶性表达。1988年首次将MBP作为融合标签与外源基因连接并在大肠杆菌中大量表达可溶性重组蛋白质，也是目前比较常用的促进异源重组蛋白可溶性表达的辅助蛋白。重组单链抗体（scFvs）是一种在临床上有治疗作用的蛋白。然而在表达该蛋白的过程中易形成包涵体，从而造成蛋白不可溶，没有活性。当在scFvs的C端加入MBP融合标签时，发现该蛋白是高度可溶的并且具有活性，并且该融合蛋白非常稳定。另外，原本有些蛋白是不可溶的，在这些蛋白N端结合上MBP标签也可以增加蛋白的可溶性。

但总体而言，由于蛋白结构差异较大，针对不同蛋白时，需要选择合适的标签蛋白，才能较好提高其表达量和可溶性表达效果，因而尚需寻找、设计新的标签标记蛋白或者重组载体，从而适应不同蛋白表达的需要。

发明内容

针对目前重组蛋白在大肠杆菌中大多数为包涵体存在的缺陷，本发明提供了一种重组表达载体pET21b-HEMBP（Pyr），与传统表达载体相比，可以较好提高蛋白表达量和蛋白的可溶度。

本申请的技术方案详述如下。

一种能促进蛋白可溶性表达及表达量的重组表达载体，该重组表达载体为原核表达载体，命名为pET21b-HEMBP（Pyr），该重组表达载体在pET21b的基础上进行NdeI和BamHI双酶切后，重组连接有HE-MBP（Pyr）-TEV 序列；其中HE为改良型的组氨酸标签，MBP(Maltotriose-binding protein)是源自高嗜热古细菌（Pyrococcus furiosus）的蛋白标签，TEV是烟草蚀刻病毒蛋白酶酶切序列；其具体构建过程为：

（1）构建重组质粒pUC57-HEMBP（Pyr）-Nb

人工合成HEMBP（Pyr）-Nb基因序列，其碱基序列具体如SEQ ID NO.1所示，与pUC57质粒进行连接，构建重组质粒pUC57-HEMBP（Pyr）-Nb；

（2）酶切，连接，具体过程为：

将步骤（1）中的重组质粒pUC57-HEMBP（Pyr）-Nb与质粒pET21b分别采用NdeI和XhoI进行双酶切

对酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，并回收酶切产物；

将酶切产物用T4 DNA连接酶进行连接，16℃连接过夜；

（3）转化、筛选，具体过程为：

将步骤（2）中的连接产物通过化学方法（CaCl₂）转化至大肠杆菌（E.coli）BL21（DE3）中，然后涂布于LB固体培养基（氨苄青霉素，100>

挑取阳性单菌落，接种于含有氨苄青霉素（100 μg/mL）抗性的LB液体培养基中，37℃、220 rpm培养6 h，然后，按照SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒的说明书提取质粒；

对所提取的质粒进行NdeI和BamHI双酶切鉴定；

对鉴定正确的含有重组质粒的大肠杆菌，保存备用。

所述能促进蛋白可溶性表达及表达量的重组表达载体pET21b-HEMBP（Pyr）在蛋白表达中的应用，用于大肠杆菌的原核表达系统，可促进蛋白的可溶性表达及提高蛋白表达量，所述蛋白具体例如：单克隆抗体（Nb、PCV2VHHC3）、抗原（H5HA10、PCV2b（cap）、NLSFMD、HAFnt、FMDV98）、多聚蛋白（Cago60）及c-di-GMP和c-GAMP合成酶（CdiGMP499（Caulobactervibrioides）、CdiGMP026（Phenylobacterium zucineum）、Prop acid OAS）等。

本申请所提供的重组表达载体pET21b-HEMBP（Pyr），同时含有HE亲和标签、MBP（Pyr）可溶性标签和TEV内切位点，相较于现有技术中通常所用标签序列，其技术优势具体体现在如下几个方面：

（1）大肠杆菌作为目前应用最为广泛的一种外源重组蛋白表达的宿主菌，其具有一定的自身局限性，如缺乏对真核生物蛋白的翻译后修饰，外源重组蛋白大部分以包涵体形式表达，因而外源蛋白表达后的可溶性不高；

为克服这一缺陷，本申请中采用了一种新型的MBP（Maltotriose-binding protein,Pyrococcus furiosus）可溶性标签，不同于传统的MBP标签，本申请中的MBP（Pyr）可溶性标签源于激烈火球菌（Pyrococcus furiosus）的一种麦芽三糖结合蛋白（WP_011013078），其在生物体内原始功能是参与麦芽三糖的三磷酸腺苷结合体转运（ABC transport system），属于细菌溶质结合蛋白Ⅰ家族；基于此新型MBP（Pyr）可溶性标签，以促进和提高重组蛋白的可溶度；

（2）His6标签是目前应用最为广泛的亲和层析纯化标签，其具有分子量小、可以在变性条件下纯化蛋白、无免疫原性，不影响免疫学分析等优点，但此标签仍存在一定不足之处，如基于此标签所表达的重组蛋白易形成包涵体、难以溶解等；

为解决His6标签易使表达后重组蛋白形成包涵体的缺陷，本申请在确保重组蛋白仍能较好亲和纯化的前提下，采用了一种新的HE亲和标签（HEHEHEHEHEHEHE）；HE标签是将偶数位的组氨酸替换成一个亲水性更高的谷氨酸（HEHEHE-tag），这种替换，在确保HEHEHE-tag标记的亲合体同样可以通过固定化金属亲和层析纯化蛋白的同时，较好提高了重组蛋白的可溶性表达效果，因而可以替代His6标签用于融合蛋白的亲和纯化；

（3）现有技术中，采用原核表达系统表达融合蛋白时，所采用的原核表达载体通常不含TEV蛋白酶酶切位点，因此不能通过切除融合标签来获得靶蛋白；本发明中通过在重组表达载体中整合TEV蛋白酶酶切位点，可以较为便捷的实现切除融合标签以获得靶蛋白的目的。

总体而言，本申请通过构建改造、构建新的重组表达载体，可以较好地提高蛋白表达量和提高蛋白的可溶度，在基因工程、蛋白工程中具有较好地实用价值和推广应用意义。

附图说明

图1为重组质粒构建示意图，其中A为重组表达载体pET21b-HEMBP（Pyr）的构建流程示意图；

B为重组质粒表达载体pET21b-HEMBP（Pyr）-H5HA10、pET21b-HEMBP（Pyr）-PCV2b、pET21b-HEMBP（Pyr）-NLSFMD、pET21b-HEMBP（Pyr）-HAFnt的构建流程示意图；

图2为续图1，其中C为含有10种目的基因（Nb、PCV2VHHC3、H5HA10、PCV2b、HAFnt、FMDV98、Cago60、CdiGMP499（Caulobacter vibrioides）、CdiGMP026（Phenylobacteriumzucineum）、Prop acid OAS）的重组质粒表达载体的构建流程示意图；

D为重组表达质粒pET21b-His6-MBP（Pyr）-gene的构建流程图（gene表示目的基因PCV2VHHC3、H5HA10、NLSFMD、HAFnt、FMDV98、Cago60、CdiGMP499或Prop acid OAS）；

图3为所构建的重组表达质粒pET21b-HEMBP（Pyr）-Nb的电泳图（左图）及酶切鉴定结果（右图），其中：M: DL5 000 DNA Marker；1: pUC57-HEMBP-Nb（NdeI/XhoI，目的片段长1 635bp）；2: pET21b原质粒；3: pET21b-HEMBP-Nb（NdeI/BamHI，小片段长1 242 bp）；

图4为所构建重组质粒pET21b-HEMBP（Pyr）-gene和pET21b-His6MBP-gene的电泳图（A）及酶切鉴定结果（B1、B2）；

A图中：M: DL5 000 DNA Marker；1: pET21b-His6MBP载体；2: pET21b-HEMBP(Pyr)-Nb（387 bp）；3: 含FMDV98（639 bp）基因的质粒；4: 含PCV2b（705 bp）基因的质粒；5: 含CdiGMP499（714 bp）基因的质粒；6: 含CdiGMP026（648 bp）基因的质粒；7: 含Prop acidOAS（1 035 bp）基因的质粒；8: 含NLSFMD（672 bp）基因的质粒；9: 含HAFnt（951 bp）基因的质粒；10: 含H5HA10（522 bp）基因的质粒；11: 含PCV2VHHC3（414 bp）基因的质粒；12:含Cago60（801 bp）：基因的质粒；

B1图为pET21b-HEMBP（Pyr）-gene重组质粒酶切鉴定结果（NdeI/XhoI），其中M: DL5000 DNA Marker；1: pET21b-HEMBP（Pyr）-Nb（小片段长为1 629 bp）；2: pET21b-HEMBP（Pyr）-FMDV98（小片段长为1 881 bp）；3: pET21b-HEMBP（Pyr）-PCV2b（小片段长为1 947bp）；4: pET21b-HEMBP（Pyr）-CdiGMP026（小片段长为1 890 bp）；5: pET21b-HEMBP（Pyr）-H5HA10（小片段长为1 764 bp）；6: pET21b-HEMBP（Pyr）-NLSFMD（小片段长为1 914 bp）；7:pET21b-HEMBP（Pyr）-Cago60（小片段长为2 043 bp）；8: pET21b-HEMBP（Pyr）-Prop acidOAS（小片段长为2 277 bp）；9: pET21b-HEMBP（Pyr）-CdiGMP499（小片段长为1 956 bp）；10: pET21b-HEMBP（Pyr）-PCV2VHHC3（小片段长为1 656 bp）；11: pET21b-HEMBP（Pyr）-HAFnt（小片段长为2 193 bp）；

B2图为pET21b-His6MBP-gene重组质粒酶切鉴定结果（NdeI/XhoI），其中M: DL5 000DNA Marker；1: pET21b-His6MBP-CdiGMP026（小片段长为1 849 bp）；2: pET21b-His6MBP-Cago60（小片段长为2 002 bp）；3: pET21b-His6MBP-Nb（小片段长为1 588 bp）；4:pET21b-His6MBP-FMDV98（小片段长为1 840 bp）；5: pET21b-His6MBP-PCV2b（小片段长为1906 bp）；6: pET21b-His6MBP-CdiGMP499（小片段长为1 915 bp）；7: pET21b-His6MBP-Prop acid OAS（小片段长为2 236 bp）；8: pET21b-His6MBP- NLSFMD（小片段长为1 873bp）；9: pET21b-His6MBP-HAFnt（小片段长为2 152 bp）；10: pET21b-His6MBP-H5HA10（小片段长为1 723 bp）；11: pET21b-His6MBP-PCV2VHHC3（小片段长为1 615 bp）；

图5为所构建pET21b-His6-MBP（Pyr）-gene重组质粒电泳图（A）及酶切（NdeI/XhoI）鉴定结果（B）；A图中，M: DL 5000 DNA Marker；1: pET21b-HEMBP（Pyr）-Cago60（目的片段长1980 bp）；2:pET21b-HEMBP(Pyr)-PCV2VHHC3（目的片段长为1 593 bp）；3: pET21b-HEMBP(Pyr)-FMDV98（目的片段长1 818 bp）；4: pET21b-HEMBP(Pyr)-H5HA10（目的片段长1 701bp）；5: pET21b-HEMBP(Pyr)-NLSFMD（目的片段长1 851 bp） 6: pET21b-HEMBP(Pyr)-HAFnt（目的片段长2 130 bp）；7: pET21b-HEMBP(Pyr)-Prop acid OAS（目的片段长2 214bp）；8: pET21b-HEMBP（Pyr）-CdiGMP499（目的片段长1 893 bp）；9: pET21b-His6；

B图中，M: DL5 000 DNA Marker；1: pET21b-His6-MBP(Pyr)-FMDV98（小片段长为1839 bp）；2: pET21b-His6-MBP(Pyr)-CdiGMP499（小片段长为1 914 bp）；3: pET21b-His6-MBP(Pyr)-PCV2VHHC3（小片段长为1 614 bp）；4: pET21b-His6-MBP(Pyr)-Prop acid OAS（小片段长为2 235 bp）；5: pET21b-His6-MBP(Pyr)-H5HA10（小片段长为1 722 bp）；6:pET21b-His6-MBP(Pyr)-HAFnt（小片段长为2 151 bp）；7: pET21b-His6-MBP(Pyr)-NLSFMD（小片段长为1 872 bp）；8: pET21b-His6-MBP(Pyr)-Cago60（小片段长为2 001 bp）；

图6为pET21b-HEMBP（Pyr）重组表达载体与其他表达载体对部分蛋白表达结果的差异，其中M: Thermo Scientific PageRuler Prestained Protein Ladder（170 kDa、130 kDa、100 kDa、70 kDa、55 kDa、40 kDa、35 kDa、25 kDa、15 kDa、10 kDa）；1: 未诱导全菌；2: 诱导后全菌；3: 诱导后上清；4: 诱导后沉淀；

图7为pET21b-HEMBP（Pyr）重组表达载体（左）与pET21b-His6MBP表达载体（右）对部分蛋白表达结果对比，其中M: Thermo Scientific PageRuler Prestained Protein Ladder（170 kDa、130 kDa、100 kDa、70 kDa、55 kDa、40 kDa、35 kDa、25 kDa、15 kDa、10 kDa）；1:未诱导全菌；2: 诱导后全菌；3: 诱导后上清；4: 诱导后沉淀；

图8为pET21b-HEMBP（Pyr）重组表达载体（左）与pET21b-His6MBP（Pyr）表达载体（右）对部分蛋白的表达结果对比，其中M: Thermo Scientific PageRuler Prestained ProteinLadder（170 kDa、130 kDa、100 kDa、70 kDa、55 kDa、40 kDa、35 kDa、25 kDa、15 kDa、10kDa）；1: 未诱导全菌；2: 诱导后全菌；3: 诱导后上清；4: 诱导后沉淀；

图9为pET21b-His6-MBP（Pyr）重组表达载体（左）与pET21b-His6MBP重组表达载体（右）对部分蛋白表达结果的对比，其中M: Thermo Scientific PageRuler PrestainedProtein Ladder（170 kDa、130 kDa、100 kDa、70 kDa、55 kDa、40 kDa、35 kDa、25 kDa、15kDa、10 kDa）；1: 未诱导全菌；2: 诱导后全菌；3: 诱导后上清；4: 诱导后沉淀。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的介绍说明，在介绍具体实施例前，对下述实施例中涉及部分物料情况简要介绍如下。

生物材料：

pUC57质粒、pET21b质粒，购自Novagen公司；

His6、His6MBP、H5HA10、LSL150-cherry-PCV2b/NLSFMD/HAFnt等基因序列由金斯瑞生物技术公司合成提供，然后根据现有技术构建pET21b-His6MBP、pET21b-His6、pET21b-His6-cherry-H5HA10、pET21b-LSL150-cherry-PCV2b/NLSFMD/HAFnt等重组质粒即可；

下述实施例中相关基因测序工作亦由金斯瑞生物技术公司完成；

还需解释的是，cherry蛋白是一种红色荧光蛋白，在融合蛋白经诱导可溶性表达后可使菌体在荧光性呈现红色，便于观察；

实验试剂：

BamHI（FD0054）、NdeI（FD0583）、NheI（FD0973）、XhoI（FD0694）、预染蛋白Marker（PageRuler Prestained Protein Ladder）等为Thermo ScientificTM产品；

质粒DNA小量抽提试剂盒、DNA胶回收试剂盒，生工生物工程（上海）有限公司产品；

T4 DNA连接酶（#M0202S），New England Biolabs公司产品；

氨苄青霉素（Amp），北京索莱宝科技有限公司；

DNA分子质量标准DL5 000，购自宝生物工程 (大连) 有限公司；

溶菌酶，Actibity>20000 u/mg， 北京索莱宝科技有限公司；

30%丙烯酰胺(29:1)、2 × SDS PAGE电泳上样缓冲液、异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG），北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司产品；

琼脂糖（Agarose），购自西安国安生物科技有限公司；

LB培养基：Tryptone（胰蛋白胨） 10 g、Yeast Extract （酵母提取物）5 g、NaCl 10 g，溶于800 mL超纯水中，用NaOH调pH至7.0，加水定容至1 L，高压灭菌备用；固体培养基中，另加12 g琼脂粉；

PBS（pH=7.4）：NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na₂HPO4>2PO4>

50 × TAE 电泳缓冲液：称取242g Tris、37.2g Na₂EDTA·2H₂O，加入超纯水充分溶解，加入57.1>

10% 过硫酸铵（APS）：称取1 g APS，用超纯水充分溶解并定容至10 mL，4℃保存备用；

5 × SDS-PAGE 电泳缓冲液：称取15.15 g Tris，5 g 十二烷基苯磺酸钠（SDS），72.05g 甘氨酸，加入超纯水充分溶解，定容至1 L，常温保存备用；

考马斯亮蓝R-250 染色液：称取考马斯亮蓝R-250 1 g，量取250 mL 的异丙醇，加入100 mL 冰醋酸，加入650 mL 的超纯水充分搅拌溶解，用滤纸过滤去除颗粒物，室温保存备用；

考马斯亮蓝脱色液：无水乙醇100 mL、冰醋酸100 mL，超纯水定容至500 mL，室温保存备用；

实验仪器：

电泳仪及电泳槽 (JY600C) ，北京君意东方电泳设备有限公司；

Amersham Imager 600 凝胶成像系统，GE Healthcare Life Sciences产品；

超声波细胞粉碎机，宁波新芝科器研究所；

BioSpectrometer紫外/可见光分光光度计，Eppendorf；

实施例1

能促进蛋白可溶性表达及提高蛋白表达量的重组表达载体pET21b-HEMBP（Pyr），构建流程如图1（A）所示，具体通过如下步骤构建而成。

（1）构建重组质粒pUC57-HEMBP（Pyr）-Nb

人工合成HEMBP（Pyr）-Nb基因序列，具体序列如SEQ ID NO.1所示，与pUC57质粒进行连接，构建重组质粒pUC57-HEMBP（Pyr）-Nb。

（2）酶切，连接，具体过程为：

将质粒pUC57-HEMBP（Pyr）-Nb与质粒pET21b分别采用NdeI和XhoI进行双酶切，30 μL酶切体系设计如下：

NdeI，1>

XhoI，1>

10 × FastDigest Green Buffer，3>

质粒pUC57-HEMBP（Pyr）-Nb（或质粒pET21b），1 μg；

ddH₂O加至30>

37℃酶切1 h；

对酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，并回收酶切产物；

将酶切产物用T4 DNA连接酶进行连接，16℃连接过夜。

（2）转化、筛选，具体过程为：

将步骤（1）中的连接产物通过化学方法（CaCl₂）转化至大肠杆菌（E.coli）BL21（DE3）中，然后涂布于LB固体培养基（Amp、100μg/mL）中，倒置培养过夜；

挑取阳性单菌落，接种于含有氨苄青霉素（100 μg/mL）的抗性LB液体培养基中，37℃、220 rpm培养6 h，然后，按照SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒的说明书提取质粒。

对所提取的质粒进行双酶切鉴定，10μL酶切体系设计如下：

NdeI，0.25μL；

BamHI，0.25μL；

10 × FastDigest Green Buffer，1μL；

所提取质粒，250 ng；

ddH₂O>

37℃酶切1 h；对酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分离鉴定。

鉴定结果如图3所示。图3结果表明pET21b-HEMBP（Pyr）-Nb构建成功。对鉴定正确的含有重组质粒的大肠杆菌，保存备用。

实施例2

在实施例1基础上，为进一步检测判定所构建的重组表达载体pET21b-HEMBP（Pyr）对蛋白表达量和蛋白可溶度的促进提升效果，利用原核表达系统，发明人对不同的外源蛋白进行了表达实验，相关实验过程简要介绍如下。

（一）构建含有目的基因的重组表达载体

目的基因具体有H5HA10、PCV2b、NLSFMD、HAFnt，参考图1（B）的构建流程示意图，含有目的基因的重组质粒表达载体pET21b-HEMBP（Pyr）-H5HA10、pET21b-HEMBP（Pyr）-PCV2b、pET21b-HEMBP（Pyr）-NLSFMD、pET21b-HEMBP（Pyr）-HAFnt，具体构建过程如下：

用BamHI和XhoI酶分别对实施例1所制备的重组表达载体pET21b-HEMBP（Pyr）-Nb和pET21b-His6-cherry-H5HA10、pET21b-LSL150-cherry-PCV2b、pET21b-LSL150-cherry-NLSFMD、pET21b-LSL150-cherry-HAFnt质粒进行BamHI和XhoI双酶切（酶切体系参考实施例1中30 μL酶切体系进行设计）；

对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，并回收酶切产物；

用T4 DNA连接酶将酶切产物进行连接，进而构建重组质粒表达载体pET21b-HEMBP（Pyr）-H5HA10、pET21b-HEMBP（Pyr）-PCV2b、pET21b-HEMBP（Pyr）-NLSFMD、pET21b-HEMBP（Pyr）-HAFnt；

将连接产物转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，并进行筛选（筛选过程参考实施例1），对阳性质粒采用NdeI和XhoI进行双酶切鉴定，酶切鉴定结果如图4所示。

图4结果显示重组质粒构建成功。

对酶切鉴定正确的含有重组质粒的菌株保存备用。

将所构建的含有正确重组质粒的菌株及原始含有pET21b-His6-cherry-H5HA10、pET21b-LSL150-cherry-PCV2b、pET21b-LSL150-cherry- NLSFMD、pET21b-LSL150-cherry-HAFnt质粒的菌株，分别进行诱导表达，并取诱导后菌体对蛋白表达量进行评价。具体过程为：

（1）取活化菌液1 mL，按1:100的体积比，接种于含Amp 100 μg/mL的LB液体培养基中，37℃、220 rpm振荡培养至OD₆₀₀=0.7左右；

（2）加入0.5 mM IPTG，25℃诱导表达过夜。

分别制备未诱导全菌样品和诱导表达后样品，具体如下：

1、未诱导全菌样品

IPTG诱导表达前，取1 mL诱导表达前菌液样品作为未诱导全菌样品，按如下方式进行处理：

将菌液9000 rpm离心1 min，弃上清后，加（OD₆₀₀值×100）μL>

2、诱导表达后全菌样品

用紫外分光光度计测定诱导表达后菌液的OD₆₀₀值，然后参考上述未诱导全菌样品制备方式制备诱导表达后全菌样品。

3、诱导表达后上清样品和诱导表达后沉淀样品

取10 mL诱导后菌液离心，用（OD600值×100/2）μL 的PBS（pH=7.4）重悬菌体，加溶菌酶(1 mol/L) 冰浴30 min后，低温超声波破碎菌体 (超声时间4 s，间歇7 s)；

破碎至澄清4℃ 12000 g 离心30 min；

吸取30 μL的上清并加等量的2× loading buffer，制备诱导后上清样品；

弃剩余上清后，加（OD600值×100/2）μL PBS重悬沉淀，吸取30 μL的重悬液并加等量的2× loading buffer，制备诱导后沉淀样品。

对上述样品中蛋白含量进行检测，具体方法为：

配制12% SDS-PAGE凝胶，分别取10 μL的未诱导全菌、诱导后全菌、诱导后上清和诱导后沉淀样品上样，120 V电泳至样品进入分离胶界面时将电压调至160 V，待染料距离凝胶底部0.5 cm时，电泳结束；

用卸胶板剥离浓缩胶，将卸下的分离胶浸染在染色液中进行考马斯亮蓝染色，室温摇动染色2 h；

回收染色液后将凝胶浸入脱色液，更换脱色液数次至胶中的条带清晰；

用Amersham Imager 600 凝胶成像系统拍照保存并进行灰度分析。

诱导表达结果如图6所示。分析表明：pET21b-HEMBP（Pyr）重组表达载体可以使不表达的NLSFMD蛋白及包涵体表达的HAFnt、PCV2b和H5HA10蛋白可溶性表达。灰度分析结果显示pET21b-HEMBP（Pyr）-HAFnt/NLSFMD/PCV2b/H5HA10重组蛋白的可溶度分别为：75%、60.7%、78%和82.7%；其中可溶度=上清中重组蛋白量/(上清中重组蛋白量+沉淀中重组蛋白量)。

实施例3

以实施例1所构建的重组表达载体为基础，进一步的，发明人对10种不同目的基因分别构建了重组表达载体并进行了原核表达，10种目的基因具体有：Nb、PCV2VHHC3、H5HA10、PCV2b、HAFnt、FMDV98、Cago60、CdiGMP499（Caulobacter vibrioides）、CdiGMP026（Phenylobacterium zucineum）、Prop acid OAS，相关操作参考实施例1、2及现有技术即可，不再赘述。

相关重组表达质粒的构建流程图如图2（C）所示，对所构建的重组表达质粒的酶切鉴定结果如图4所示。结果显示，重组质粒构建成功。

为进一步表明本发明的技术效果，同时以现有的pET21b-His6MBP质粒为基础，参考实施例1、2相关操作及现有技术，对上述9种目的基因进行整合和重组表达，并以此作为对比例。

对不同质粒表达载体的未诱导全菌、诱导后全菌、诱导后上清和诱导后沉淀样品进行12% SDS-PAGE电泳，然后进行考马斯亮蓝染色。不同基因的不同重组质粒表达载体的电泳结果如图7所示，凝胶成像后的灰度分析结果如下表1所示。

表1 两种表达载体促进蛋白可溶性表达差异比较：

表达量 (%)为重组蛋白占大肠杆菌中总蛋白的百分比；

可溶度(%)为重组蛋白上清中的表达量占(上清中的表达量+ 沉淀中的表达量)的百分比。

结合图7及上述表1统计结果，进一步分析可以看出：

HEMBP（Pyr）-Nb重组蛋白的可溶度与His6MBP-Nb相比，提高了49.2%；

HEMBP（Pyr）-PCV2b重组蛋白的可溶度与His6MBP-PCV2b相比，提高了11.5%；

HEMBP（Pyr）-Cago60重组蛋白的可溶度与His6MBP-Cago60相比，提高了28.1%；

HEMBP（Pyr）-PCV2VHHC3重组蛋白的可溶度与pET21b-His6MBP- PCV2VHHC3相比，提高了17.4%；

HEMBP（Pyr）-CdiGMP499重组蛋白的可溶度与His6MBP- CdiGMP499相比，提高了25.9%；

HEMBP（Pyr）-Prop acid OAS重组蛋白的可溶度与His6MBP- Prop acid OAS相比，提高了42.7%；

HEMBP（Pyr）-FMDV98重组蛋白的可溶度与His6MBP- FMDV98相比，提高了42.2%；

HEMBP（Pyr）-H5HA10重组蛋白的可溶度与His6MBP- H5HA10相比，提高了22.4%；

His6MBP-CdiGMP026重组蛋白诱导后无表达，HEMBP（Pyr）-CdiGMP026重组蛋白有表达且35%为可溶性表达。

综合实施例2及上述统计结果，可以看出：针对不同类型的基因，采用新的pET21b-HEMBP（Pyr）重组表达载体后，相较于原有的表达载体，其蛋白可溶度及蛋白表达量均有较好提高，且提升效果明显。

实施例4

在上述实施例基础上，为进一步表明本发明中所提供重组表达载体所携带的标签序列的技术效果，发明人以pET21b-His6载体质粒为基础，参考图2（D）的重组质粒表达载体的构建流程图，用NheI和XhoI将实施例3中以pET21b-HEMBP（Pyr）为基础，整合有目的基因（PCV2VHHC3、H5HA10、NLSFMD、HAFnt、FMDV98、Cago60、CdiGMP499、Prop acid OAS）的重组质粒用NheI和XhoI进行双酶切，同时对pET21b-His6载体质粒进行NheI和XhoI的双酶切；将酶切产物进行连接，并转化、筛选、酶切鉴定，构建获得重组表达质粒pET21b-His6-MBP（Pyr）-gene（gene表示目的基因PCV2VHHC3、H5HA10、NLSFMD、HAFnt、FMDV98、Cago60、CdiGMP499或Prop acid OAS）。

对重组质粒的酶切鉴定结果如图5所示。结果显示重组质粒构建成功。

相关操作参考实施例1、2、3及现有技术，不再赘述。

对所构建的重组质粒表达载体进行诱导表达，分别取未诱导全菌、诱导后全菌、诱导后上清和诱导后沉淀样品进行12% SDS-PAGE电泳，并进行考马斯亮蓝染色，对蛋白表达量进行测定和分析。

其中，部分目的基因在采用HE-MBP（Pyr）标签与His6-MBP（Pyr）标签时，蛋白表达量及可溶性表达的差异结果如图8所示。从图中可以看出：

HE-MBP（Pyr）-PCV2VHHC3/CdiGMP499/H5HA10重组蛋白的表达量显著高于His6-MBP（Pyr）-PCV2VHHC3/CdiGMP499/H5HA10重组蛋白的表达量，可溶度高于后者；

HE-MBP（Pyr）-Cago60/FMDV98/NLSFMD/Prop acid OAS重组蛋白的表达量略高于His6-MBP（Pyr）-Cago60/FMDV98/NLSFMD/Prop acid OAS重组蛋白的表达量，可溶度分别提高了8.9%、19.5%、4.8%和15.2%。

部分目的基因采用His6-MBP（Pyr）标签与His6MBP标签对重组蛋白表达量及可溶性表达的影响差异如图9所示。图9结果显示：

His6-MBP-HAFnt重组蛋白表达量高于HE-MBP（Pyr）-HAFnt重组蛋白表达量，但只有59.4%的可溶度，而HE-MBP（Pyr）-HAFnt重组蛋白全部可溶性表达；

His6-MBP-Prop acid OAS/H5HA10重组蛋白表达量也高于HE-MBP（Pyr）-Prop acidOAS/H5HA10重组蛋白表达量，但可溶度分别为32%和57.1%，低于HE-MBP（Pyr）-Prop acidOAS/H5HA10重组蛋白的可溶度，分别为59.5%和71.7%；

HE-MBP（Pyr）-FMDV98/Cago60重组蛋白表达量与His6-MBP- FMDV98/Cago60比较无明显差异，但可溶度均高于后者。

对蛋白表达后的灰度分析结果具体如下表2、表3所示。

表2： pET21b-HE-MBP（Pyr）与pET21b-His6-MBP（Pyr）表达载体促进蛋白可溶性表达差异比较：

表达量 (%)为重组蛋白占大肠杆菌中总蛋白的百分比；

可溶度(%)为重组蛋白上清中的表达量占(上清中的表达量+ 沉淀中的表达量)的百分比。

表3： pET21b-His6-MBP（Pyr）和pET21b-His6MBP表达载体促进蛋白可溶性表达差异比较：

表达量 (%)为重组蛋白占大肠杆菌中总蛋白的百分比；

可溶度(%)为重组蛋白上清中的表达量占(上清中的表达量+ 沉淀中的表达量)的百分比。

SEQUENCE LISTING

<110>河南农业大学

<120>一种能促进蛋白可溶性表达及提高表达量的重组表达载体

<130>none

<160>1

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1242

<212>DNA

<213>人工设计

<400>1

catatgaaat attataaaca cgagcacgag catgagcacg aacacgagca cgaacacgag60

ggtgctagcg gcatgaagat cgaggaaggt aaggttgtta tttggcacgc gatgcagccg 120

aacgaactgg aagtgtttca aagcctggcg gaggaataca tggcgctgtg cccggaagtg 180

gagatcgttt tcgagcagaa gccgaacctg gaagacgcgc tgaaagcggc gattccgacc 240

ggtcagggtc cggacctgtt tatctgggcg cacgattgga ttggtaaatt cgcggaggcg 300

ggtctgctgg aaccgatcga cgagtacgtt accgaagatc tgctgaacga atttgcgccg 360

atggcgcagg atgcgatgca atacaagggt cactactatg cgctgccgtt cgcggcggag 420

accgtggcga tcatttataa caaggagatg gttagcgaac cgccgaaaac ctttgacgag 480

atgaaggcga ttatggaaaa atactatgat ccggcgaacg aaaaatacgg catcgcgtgg 540

ccgattaacg cgtatttcat cagcgcgatt gcgcaggcgt ttggtggcta ctatttcgac 600

gataagaccg agcaaccggg tctggacaaa ccggaaacca tcgagggctt taagttcttt 660

ttcaccgaaa tttggccgta catggcgccg accggtgatt ataacaccca gcaaagcatc 720

ttcctggagg gtcgtgcgcc gatgatggtg aacggcccgt ggagcatcaa cgacgttaag 780

aaagcgggta ttaacttcgg cgtggttccg ctgccgccga tcattaagga tggtaaagaa 840

tactggccgc gtccgtatgg tggcgtgaaa ctgatctact ttgcggcggg cattaagaac 900

aaagacgcgg cgtggaagtt cgcgaaatgg ctgaccacca gcgaggaaag catcaagacc 960

ctggcgctgg agctgggtta tattccggtg ctgaccaaag ttctggacga tccggaaatc1020

aagaacgacc cggtgattta cggttttggc caggcggttc aacacgcgta tctgatgccg1080

aagagcccga aaatgagcgc ggtgtggggt ggcgttgatg gtgcgatcaa cgagattctg1140

caggacccgc aaaacgcgga tatcgagggc attctgaaga aataccagca agaaatcctg1200

aacaacatgc aggaggaaaa cctgtacttc caatccggat cc 1242