A型流感病毒温度敏感性的关键磷酸化位点及其应用

摘要

本发明公开了一种A型流感病毒温度敏感性的关键磷酸化位点及其应用。本发明首先保护一种重组病毒，命名为病毒WSN‑Y385F，是将A型流感病毒基因组中编码NP蛋白的第385位酪氨酸残基的密码子突变为苯丙氨酸残基的密码子得到的重组病毒。病毒WSN‑Y385F为温度敏感型病毒，在37℃可以正常复制并存活，在33℃不能正常复制并且不能存活。本发明还保护一种抑制A型流感病毒的NP蛋白发生磷酸化的方法，是将A型流感病毒的NP蛋白自N末端第385位氨基酸残基由酪氨酸突变为苯丙氨酸。本发明对于流感病毒侵染的机理分析，流感病毒的防治等具有重大价值。

说明书

技术领域

本发明涉及一种A型流感病毒温度敏感性的关键磷酸化位点及其应用。

背景技术

A型流感病毒包含8个分节段的RNA片段，利用这些RNA片段，共能编码14种病毒蛋白。而病毒基因组的复制和转录需要由RNP复合物这一功能单元来完成。病毒感染宿主细胞面临着2层屏障，4次穿梭。

第一个屏障是病毒进入细胞需要穿过细胞质膜，这时病毒利用血凝素蛋白HA和细胞表面的唾液酸受体结合，进行发生内吞作用入侵到宿主细胞内部。

之后基质蛋白M1会释放vRNP复合物到细胞质中，而由于基因组复制和转录需要在细胞核内进行，此时的vRNP复合物面临的第二道屏障，即细胞核膜。vRNP会利用NP蛋白N端的非典型双向NLS同细胞核运输受体蛋白importin-α结合，从而得以穿过核孔复合物，进入到细胞核内部开始复制和转录。

转录产生的mRNA在细胞质得到翻译，新合成的病毒聚合酶组分又会分别利用自身的NLS进入到细胞核重新组装成RNP复合物。

待病毒基因组复制完毕后，RNP复合物会利用NP蛋白同M1蛋白和NEP蛋白形成一个大的复合物，再利用细胞质运输蛋白CRM1蛋白将之运输到细胞质中，完成再一次的穿梭屏障，然后组装成完整的病毒粒子。

NP蛋白在两次穿梭核膜的过程中，发挥着重要的作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种A型流感病毒温度敏感性的关键磷酸化位点及其应用。

本发明首先保护一种重组病毒，命名为病毒WSN-Y385F，是将A型流感病毒基因组中编码NP蛋白的第385位酪氨酸残基的密码子突变为苯丙氨酸残基的密码子得到的重组病毒。病毒WSN-Y385F为温度敏感型病毒，在37℃可以正常复制并存活，在33℃不能正常复制并且不能存活。

所述A型流感病毒具体可为WSN病毒A/WSN/1933(H1N1)毒株。

所述NP蛋白如序列表的序列1所示。

本发明还保护一种蛋白质，命名为蛋白质NP-Y385F，是NP蛋白的第385位酪氨酸残基突变为苯丙氨酸残基得到的蛋白质。

所述NP蛋白如序列表的序列1所示。

编码蛋白质NP-Y385F的基因也属于本发明的保护范围。编码蛋白质NP-Y385F的基因命名为基因NP-Y385F。

基因NP-Y385F具体可为如下(a)或(b)：

(a)编码区如序列表的序列10自5’末端第26-1522位核苷酸所示的DNA分子；

(b)序列表的序列10所示的DNA分子。

含有基因NP-Y385F的重组质粒也属于本发明的保护范围。

含有基因NP-Y385F的重组质粒具体可为重组质粒pHH21-NP-Y385F。重组质粒pHH21-NP-Y385F为：在载体pHH21的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)插入基因NP-Y385F得到的重组质粒。

含有基因NP-Y385F的重组质粒具体可为重组质粒pcDNA3.0-NP-Y385F。重组质粒pcDNA3.0-NP-Y385F为：在载体pcDNA3.0的多克隆位点(例如KpnI和XhoI酶切位点之间)插入基因NP-Y385F得到的重组质粒。

本发明还保护一种温度敏感型重组病毒，其制备方法包括如下步骤：

将质粒pHH21-PA、质粒pHH21-PB1、质粒pHH21-PB2、质粒pHH21-HA、质粒pHH21-NA、质粒pHH21-M、质粒pHH21-NS、质粒pcDNA3.0-PA、质粒pcDNA3.0-PB1、质粒pcDNA3.0-PB2、重组质粒pHH21-NP-Y385F和重组质粒pcDNA3.0-NP-Y385F共转染离体哺乳动物细胞后进行培养得到的重组病毒；

所述质粒pHH21-PA为在载体pHH21的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)插入序列表的序列3所示的双链DNA分子得到的质粒；所述质粒pHH21-PB1为在载体pHH21的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)插入序列表的序列4所示的双链DNA分子得到的质粒；所述质粒pHH21-PB2具体可为在载体pHH21的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)插入序列表的序列5所示的双链DNA分子得到的质粒；所述质粒pHH21-HA为在载体pHH21的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)插入序列表的序列6所示的双链DNA分子得到的质粒；所述质粒pHH21-NA为在载体pHH21的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)插入序列表的序列8所示的双链DNA分子得到的质粒；所述质粒pHH21-M为在载体pHH21的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)插入序列表的序列2所示的双链DNA分子得到的质粒；所述质粒pHH21-NS为在载体pHH21的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)插入序列表的序列9所示的双链DNA分子得到的质粒；所述质粒pcDNA3.0-PA为在载体pcDNA3.0的多克隆位点(例如KpnI和XhoI酶切位点之间)插入序列表的序列3所示的双链DNA分子得到的质粒；所述质粒pcDNA3.0-PB1为在载体pcDNA3.0的多克隆位点(例如KpnI和XhoI酶切位点之间)插入序列表的序列4所示的双链DNA分子得到的质粒；所述质粒pcDNA3.0-PB2为在载体pcDNA3.0的多克隆位点(例如KpnI和XhoI酶切位点之间)插入序列表的序列5所示的双链DNA分子得到的质粒；所述重组质粒pHH21-NP-Y385F为在载体pHH21的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)插入基因NP-Y385F得到的质粒；所述重组质粒pcDNA3.0-NP-Y385F为在载体pcDNA3.0的多克隆位点(例如KpnI和XhoI酶切位点之间)插入基因NP-Y385F得到的质粒。

所述哺乳动物细胞具体可为HEK 293T/17细胞。

所述培养的条件具体可为37℃培养6-78小时。

本发明还保护一种抑制A型流感病毒的NP蛋白发生磷酸化的方法，是将A型流感病毒的NP蛋白自N末端第385位氨基酸残基由酪氨酸突变为苯丙氨酸。

本发明还保护一种降低A型流感病毒的NP蛋白磷酸化水平的方法，是将A型流感病毒的NP蛋白自N末端第385位氨基酸残基由酪氨酸突变为苯丙氨酸。

本发明还保护一种抑制A型流感病毒的NP蛋白发生磷酸化的方法，是将A型流感病毒基因组中编码NP蛋白自N末端第385位氨基酸残基的密码子由酪氨酸密码子突变为苯丙氨酸密码子。

本发明还保护一种降低A型流感病毒的NP蛋白磷酸化水平的方法，是将A型流感病毒基因组中编码NP蛋白自N末端第385位氨基酸残基的密码子由酪氨酸密码子突变为苯丙氨酸密码子。

所述NP蛋白如序列表的序列1所示。

所述A型流感病毒具体可为WSN病毒A/WSN/1933(H1N1)毒株。

本发明还保护以上任一所述重组病毒在制备A型流感病毒疫苗中的应用。本发明还保护一种A型流感病毒疫苗，其活性成分为以上任一所述重组病毒。

本发明对于流感病毒侵染的机理分析，流感病毒的防治等具有重大价值。

附图说明

图1为实施例1的步骤一的结果。

图2为实施例1的步骤二的结果。

图3为实施例2的结果。

图4为实施例3的结果。

图5为实施例4的结果。

图6为实施例5的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

WSN病毒A/WSN/1933(H1N1)毒株：Neumann,G.et al.,Generation of influenzaA viruses entirely from cloned cDNAs.P Natl Acad Sci Usa 96(16),9345(1999)。WSN病毒即流感病毒。实施例中，采用病毒感染液调整病毒浓度从而实现不同剂量的感染。

载体pHH21：Neumann,G.et al.,Generation of influenza A viruses entirelyfrom cloned cDNAs.P Natl Acad Sci Usa 96(16),9345(1999)。

HEK 293T/17细胞(简称293T细胞衍生系，人胚肾细胞)：ATCC,CRL-11268。载体pcDNA3.0：上海希匹吉生物技术有限公司,产品目录号CPC030。大肠杆菌DH5α：上海北诺生物科技有限公司。A549细胞(人肺腺癌细胞)：上海拜力生物科技有限公司。BALB/c小鼠：北京维通利华实验动物技术有限公司。MDCK细胞：ATCC,CCL-34。

细胞裂解液(pH7.4)：含150mM氯化钠、20mM HEPES、10％(体积比)甘油、1mM EDTA、1g/100mL NP40、蛋白酶抑制剂(cocktail)，其余为水。

洗脱缓冲液：氯化钠的浓度为300mM，其它同细胞裂解液。

病毒感染液：含2μg/ml TPCK处理的胰酶(胰酶是以胰酶母液的方式加入的，胰酶母液为用PBS缓冲液配制的胰酶浓度为0.25g/100mL的溶液)、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的无血清DMEM培养基。

碱性磷酸酶：Takara，货号D2250。蛋白酶抑制剂(cocktail)购自Roche公司。SDM酶：北京赛百盛基因技术有限公司，货号:SDM-15。phos-tag SDS-PAGE中所用的凝胶为Phos-tag Acrylamide，购自Wako(日本)。抗磷酸化酪氨酸抗体(鼠单克隆抗体，sc-508)购自Santa Cruz。具有已知分子量的预先染色的蛋白标准品购自Thermo。氯化钠、N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-2-乙烷磺酸(简称HEPES)、甘油、乙二胺四乙酸(简称EDTA)、Nonidet P-40(简称NP40)和TPCK处理的胰酶均购自Sigma。牛血清白蛋白(BSA)购自江晨生物。青霉素、链霉素购自碧云天公司。十二烷基硫酸钠(简称SDS)、低熔点琼脂糖购自Amersco公司。

抗NP蛋白的单抗(即抗A型流感病毒NP蛋白的鼠源单克隆抗体)：M-R Yu#,X-LLiu#,Sh Cao,Zh-D Zhao,K Zhang,Q Xie,C-W Chen,Sh-Y Gao,Y-H Bi,L Sun,X Ye,George F.Gao,W-J Liu*.2012.Identification and Characterization of three novelnuclear export signals in influenza A virus nucleoprotein.Journal ofVirology,86(9):4970-80。

将质粒pHH21-PA、质粒pHH21-PB1、质粒pHH21-PB2、质粒pHH21-HA、质粒pHH21-NP、质粒pHH21-NA、质粒pHH21-M、质粒pHH21-NS、质粒pcDNA3.0-PA、质粒pcDNA3.0-PB1、质粒pcDNA3.0-PB2和质粒pcDNA3.0-NP共转染HEK 293T/17细胞，培养后得到WSN病毒A/WSN/1933(H1N1)毒株。WSN病毒A/WSN/1933(H1N1)毒株又称WSN病毒野生型。

实施例1、磷酸化NP蛋白的获得以及磷酸化位点的鉴定

一、磷酸化NP蛋白的获得

1、将A/WSN/1933(H1N1)毒株以MOI＝0.1的剂量感染HEK 293T/17细胞，37℃培养12-16小时后收获细胞。

2、将步骤1收获的细胞用细胞裂解液4℃处理30分钟，12000rpm离心15min，收集上清液。

3、在步骤2得到的上清液中加入抗NP蛋白的单抗，4℃孵育1小时，然后加入protein G beads 4℃孵育3小时，吸弃上清，将珠子(beads)用洗脱缓冲液在4℃下洗3次(每次10分钟)，与珠子(beads)结合的即为NP蛋白。

4、将步骤3获得的结合有NP蛋白的珠子用碱性磷酸酶37℃处理2小时(碱性磷酸酶的作用为：使磷酸化蛋白去磷酸化)。

5、将碱性磷酸酶处理前的NP蛋白(步骤3得到的)和碱性磷酸酶处理后的NP蛋白(步骤4得到的)分别进行磷酸化蛋白电泳(phos-tag SDS-PAGE)并银染显色。

结果见图1。图1中，泳道1为碱性磷酸酶处理后的NP蛋白，泳道2为碱性磷酸酶处理前的NP蛋白。将碱性磷酸酶处理后的NP蛋白作为标准NP蛋白，碱性磷酸酶处理前的NP蛋白在胶上出现比标准NP蛋白迁移速率慢且对碱性磷酸酶敏感的条带,即为磷酸化NP条带。结果表明，步骤3获得的NP蛋白为磷酸化蛋白，碱性磷酸酶可以使其发生去磷酸化反应。

二、质谱鉴定磷酸化位点

将磷酸化的NP条带从胶上切下，送样至中国科学院动物研究所大型仪器平台进行样品处理及质谱鉴定(Nano-LC MS/MS,LCQ DECA XP^PLUS>

结果见图2。B2与b3的核质比差值显示Y385被磷酸化修饰。鉴定结果显示，该条带为A型流感病毒的NP蛋白，且在385位酪氨酸残基处具有磷酸化修饰。

实施例2、突变蛋白的制备和磷酸化鉴定

一、构建重组质粒

1、构建质粒pHH21-PA

在载体pHH21的BsmBI酶切位点插入序列表的序列3所示的双链DNA分子，得到质粒pHH21-PA。

2、构建质粒pHH21-PB1

在载体pHH21的BsmBI酶切位点插入序列表的序列4所示的双链DNA分子，得到质粒pHH21-PB1。

3、构建质粒pHH21-PB2

在载体pHH21的BsmBI酶切位点插入序列表的序列5所示的双链DNA分子，得到质粒pHH21-PB2。

4、构建质粒pHH21-HA

在载体pHH21的BsmBI酶切位点插入序列表的序列6所示的双链DNA分子，得到质粒pHH21-HA。

5、构建质粒pHH21-NP

在载体pHH21的BsmBI酶切位点插入序列表的序列7所示的双链DNA分子，得到质粒pHH21-NP。

6、构建质粒pHH21-NA

在载体pHH21的BsmBI酶切位点插入序列表的序列8所示的双链DNA分子，得到质粒pHH21-NA。

7、构建质粒pHH21-M

在载体pHH21的BsmBI酶切位点插入序列表的序列2所示的双链DNA分子，得到质粒pHH21-M。

8、构建质粒pHH21-NS

在载体pHH21的BsmBI酶切位点插入序列表的序列9所示的双链DNA分子，得到质粒pHH21-NS。

9、构建质粒pcDNA3.0-PA

在载体pcDNA3.0的KpnI和XhoI酶切位点之间插入序列表的序列3所示的双链DNA分子，得到质粒pcDNA3.0-PA。

10、构建质粒pcDNA3.0-PB1

在载体pcDNA3.0的KpnI和XhoI酶切位点之间插入序列表的序列4所示的双链DNA分子，得到质粒pcDNA3.0-PB1。

11、构建质粒pcDNA3.0-PB2

在载体pcDNA3.0的KpnI和XhoI酶切位点之间插入序列表的序列5所示的双链DNA分子，得到质粒pcDNA3.0-PB2。

12、构建质粒pcDNA3.0-NP

在载体pcDNA3.0的KpnI和XhoI酶切位点之间插入序列表的序列7所示的双链DNA分子，得到质粒pcDNA3.0-NP。

13、构建重组质粒

NP-Y385A-F:5’-ctgagaagcagaGCGtgggccataaggaccagaagtggag-3’；

NP-Y385A-R:5’-ccttatggcccaCGCtctgcttctcagttcaagggtacttg-3’。

NP-Y385F-F:5’-ctgagaagcagaTTCtgggccataaggaccagaagtggag-3’；

NP-Y385F-R:5’-ccttatggcccaGAAtctgcttctcagttcaagggtacttg-3’。

NP-Y385E-F:5’-ctgagaagcagaGAGtgggccataaggaccagaagtggag-3’；

NP-Y385E-R:5’-ccttatggcccaCTCtctgcttctcagttcaagggtacttg-3’。

使用Newpep点突变试剂盒(Cat.No.80111-01,北京诺派生物科技有限公司)按试剂盒说明书构建各种重组质粒。

(1)以质粒pHH21-NP为模板，用NP-Y385A-F和NP-Y385A-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(突变质粒)。

(2)用SDM酶在37℃酶切步骤(1)的PCR扩增产物2小时(消化模板质粒)。

(3)将步骤(2)的产物转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞，得到重组菌Y385A-Ⅰ(即含有重组质粒pHH21-NP-Y385A的大肠杆菌)。根据测序结果，对重组质粒pHH21-NP-Y385A进行结构描述如下：将质粒pHH21-NP中的编码NP蛋白自N末端第385位酪氨酸的密码子“tac”突变为了丙氨酸的密码子“GCG”。

(4)以pcDNA3.0-NP为模板，用NP-Y385A-F和NP-Y385A-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(突变质粒)。

(5)用SDM酶在37℃酶切步骤(4)的PCR扩增产物2小时(消化模板质粒)。

(6)将步骤(5)的产物转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞，得到重组菌Y385A-Ⅱ(即含有重组质粒pcDNA3.0-NP-Y385A的大肠杆菌)。根据测序结果，对重组质粒pcDNA3.0-NP-Y385A进行结构描述如下：将质粒pcDNA3.0-NP中的编码NP蛋白自N末端第385位酪氨酸的密码子“tac”突变为了丙氨酸的密码子“GCG”。

(7)以质粒pHH21-NP为模板，用NP-Y385F-F和NP-Y385F-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(突变质粒)。

(8)用SDM酶在37℃酶切步骤(7)的PCR扩增产物2小时(消化模板质粒)。

(9)将步骤(8)的产物转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞，得到重组菌Y385F-Ⅰ(即含有重组质粒pHH21-NP-Y385F的大肠杆菌)。根据测序结果，对重组质粒pHH21-NP-Y385F进行结构描述如下：将质粒pHH21-NP中的编码NP蛋白自N末端第385位酪氨酸的密码子“tac”突变为了苯丙氨酸的密码子“TTC”；也就是说，在载体pHH21的BsmBI酶切位点插入序列表的序列10所示的双链DNA分子。

(10)以质粒pcDNA3.0-NP为模板，用NP-Y385F-F和NP-Y385F-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(突变质粒)。

(11)用SDM酶在37℃酶切步骤(10)的PCR扩增产物2小时(消化模板质粒)。

(12)将步骤(11)的产物转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞，得到重组菌Y385F-Ⅱ(即含有重组质粒pcDNA3.0-NP-Y385F的大肠杆菌)。根据测序结果，对重组质粒pcDNA3.0-NP-Y385F进行结构描述如下：将质粒pcDNA3.0-NP中的编码NP蛋白自N末端第385位酪氨酸的密码子“tac”突变为了苯丙氨酸的密码子“TTC”；也就是说，在载体pcDNA3.0的KpnI和XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列10所示的双链DNA分子。

(13)以质粒pHH21-NP为模板，用NP-Y385E-F和NP-Y385E-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(突变质粒)。

(14)用SDM酶在37℃酶切步骤(13)的PCR扩增产物2小时(消化模板质粒)。

(15)将步骤(14)的产物转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞，得到重组菌Y385E-Ⅰ(即含有重组质粒pHH21-NP-Y385E的大肠杆菌)。根据测序结果，对重组质粒pHH21-NP-Y385E进行结构描述如下：将质粒pHH21-NP中的编码NP蛋白自N末端第385位酪氨酸的密码子“tac”突变为了谷氨酸的密码子“GAG”。

(16)以质粒pcDNA3.0-NP为模板，用NP-Y385E-F和NP-Y385E-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(突变质粒)。

(17)用SDM酶在37℃酶切步骤(16)的PCR扩增产物2小时(消化模板质粒)。

(18)将步骤(17)的产物转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞，得到重组菌Y385E-Ⅱ(即含有重组质粒pcDNA3.0-NP-Y385E的大肠杆菌)。根据测序结果，对重组质粒pcDNA3.0-NP-Y385E进行结构描述如下：将质粒pcDNA3.0-NP中的编码NP蛋白自N末端第385位酪氨酸的密码子“tac”突变为了谷氨酸的密码子“GAG”。

二、突变蛋白的制备

1、Y385F突变蛋白的制备

(1)将质粒pHH21-PA、质粒pHH21-PB1、质粒pHH21-PB2、质粒pHH21-HA、重组质粒pHH21-NP-Y385F、质粒pHH21-NA、质粒pHH21-M、质粒pHH21-NS、质粒pcDNA3.0-PA、质粒pcDNA3.0-PB1、质粒pcDNA3.0-PB2和重组质粒pcDNA3.0-NP-Y385F以等质量的配比通过脂质体Lipofectamine2000(Invitrogen)共转染HEK 293T/17细胞，37℃培养6小时。

(2)更换步骤(1)的细胞的培养基为病毒感染液，37℃培养72小时后收获细胞。

(3)将步骤(2)收获的细胞用细胞裂解液4℃处理30分钟，12000rpm离心15min，收集上清液。

(4)在步骤(3)得到的上清液中加入抗NP蛋白的单抗，4℃孵育1小时，然后加入protein G beads 4℃孵育3小时，吸弃上清，将珠子(beads)用洗脱缓冲液在4℃下洗3次(每次10分钟)，与珠子(beads)结合的即为Y385F突变蛋白。

2、NP蛋白的制备

用质粒pHH21-NP代替重组质粒pHH21-NP-Y385F并且用质粒pcDNA3.0-NP代替重组质粒pcDNA3.0-NP-Y385F，其它同步骤1，与珠子(beads)结合的即为NP蛋白。

3、Western Blot检测

将步骤1和步骤2得到的蛋白分别进行western blot，采用的一抗为抗磷酸化酪氨酸抗体，采用的二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG。

结果见图3。结果表明，与NP蛋白相比Y385F突变蛋白的磷酸化水平显著下降，即NP蛋白第385位的酪氨酸残基为主要的磷酸化位点。

实施例3、病毒拯救

1、将HEK 293T/17细胞接种于60mm平皿，每皿1×10⁶个细胞，培养12小时。

2、完成步骤1后，对HEK 293T/17细胞进行分组处理如下：

第一组：将质粒pHH21-PA、质粒pHH21-PB1、质粒pHH21-PB2、质粒pHH21-HA、重组质粒pHH21-NP-Y385A、质粒pHH21-NA、质粒pHH21-M、质粒pHH21-NS、质粒pcDNA3.0-PA、质粒pcDNA3.0-PB1、质粒pcDNA3.0-PB2和重组质粒pcDNA3.0-NP-Y385A各0.5μg通过脂质体Lipofectamine2000(Invitrogen)共转染HEK 293T/17细胞，37℃培养6小时后更换培养基为病毒感染液，继续培养72小时后收获细胞。

第二组：与第一组的差异仅在于用重组质粒pHH21-NP-Y385F代替重组质粒pHH21-NP-Y385A并且用重组质粒pcDNA3.0-NP-Y385F代替重组质粒pcDNA3.0-NP-Y385A。

第三组：与第一组的差异仅在于用重组质粒pHH21-NP-Y385E代替重组质粒pHH21-NP-Y385A并且用重组质粒pcDNA3.0-NP-Y385E代替重组质粒pcDNA3.0-NP-Y385A。

第四组：与第一组的差异仅在于用质粒pHH21-NP代替重组质粒pHH21-NP-Y385A并且用质粒pcDNA3.0-NP代替重组质粒pcDNA3.0-NP-Y385A。

3、完成步骤2后，各组分别收获培养上清。

第四组得到的培养上清中含WSN病毒野生型，因此该将培养上清命名为WSN-WT病毒液。

第一组得到的培养上清中含有WSN病毒突变型(突变病毒基因组中编码NP蛋白自N末端第385位酪氨酸的密码子突变为了丙氨酸的密码子，将该突变病毒命名为WSN-Y385A病毒)，因此该将培养上清命名为WSN-Y385A病毒液。

第二组得到的培养上清中含有WSN病毒突变型(突变病毒基因组中编码NP蛋白自N末端第385位酪氨酸的密码子突变为了苯丙氨酸的密码子，将该突变病毒命名为WSN-Y385F病毒)，因此该将培养上清命名为WSN-Y385F病毒液。

第三组得到的培养上清中含有WSN病毒突变型(突变病毒基因组中编码NP蛋白自N末端第385位酪氨酸的密码子突变为了谷氨酸的密码子，将该突变病毒命名为WSN-Y385E病毒)，因此该将培养上清命名为WSN-Y385E病毒液。

4、取步骤3得到的各个病毒液，通过噬斑鉴定检测病毒滴度。

噬斑鉴定的方法：(1)将MDCK细胞接种于12孔板中，每孔约1×10⁵个细胞，37℃、5％CO₂培养箱中培养过夜；(2)用PBS缓冲液洗去细胞表面的培养基，将待测的病毒液用病毒感染液梯度稀释后分别加入各孔中，每个稀释度设置三个重复孔，37℃孵育1小时；(3)吸弃上清并用PBS缓冲液清洗细胞，每孔加入1毫升混合溶液(混合溶液的制备方法：将1体积份融化后降温至37℃左右的3％低熔点琼脂糖与1体积份预热到37℃的无酚红DMEM培养基等体积混合，且混合物中加入TPCK处理的胰酶、青霉素和链霉素，使得胰酶浓度为2μg/ml，青霉素和链霉素的浓度均为100U/ml)；(4)将12孔板4℃放置15分钟以上，待琼脂凝固后，将孔板翻转过来倒置在37℃培养箱中培养，在显微镜下观察细胞病变情况，培养3天(实际应用中，2-4天均可)后，将12孔板从培养箱中取出，计数空斑数。

WSN-WT病毒液的滴度为6.512log₁₀PFU/ml。WSN-Y385F病毒液的滴度为7.179log₁₀PFU/ml。WSN-Y385A病毒液的滴度为0，即不能使MDCK产生噬斑。WSN-Y385E病毒液的滴度为0，即不能使MDCK产生噬斑。

5、完成步骤2后，各组分别收获细胞，将细胞破碎后进行western blot(检测各主要病毒蛋白的表达)。

Western Blot中：用于检测NP蛋白的一抗购自Thermo Scientific公司，产品目录号：PA5-32242；用于检测M1蛋白的一抗为抗M1蛋白的单抗。

结果见图4。各组重组系统中流感病毒的两种重要蛋白(NP蛋白、M1蛋白)均能够正常表达。

实施例4、细胞水平下不同温度下病毒生长曲线的差异

1、将A549细胞接种于10cm平皿，每皿1×10⁸个细胞，培养12小时。

2、完成步骤1后，对A549细胞进行分组处理如下：

第一组：将实施例3制备的WSN-WT病毒液(病毒剂量为10⁶PFU)接种A549细胞，接种后1小时换液为病毒感染液；37℃培养，分别于接种12、24、36、48、60、72小时后收取上清液，通过噬斑鉴定检测病毒滴度。

第二组：将实施例3制备的WSN-Y385F病毒液(病毒剂量为10⁶PFU)接种A549细胞，接种后1小时换液为病毒感染液；37℃培养，分别于接种12、24、36、48、60、72小时后收取上清液，通过噬斑鉴定检测病毒滴度。

第三组：与第一组的差异仅在于培养温度由37℃改为33℃。

第四组：与第二组的差异仅在于培养温度由37℃改为33℃。

噬斑鉴定的方法同实施例3。

每组设置10个重复处理，结果取平均值。

结果见图5。图5中，A为第三组和第四组的结果，B为第一组和第二组的结果。

33℃培养过程中，WSN-WT病毒均能正常复制，病毒滴度保持相对稳定、缓慢上升的趋势。33℃培养24小时后，WSN-Y385F病毒滴度为0，即WSN-Y385F病毒在33℃不能复制。37℃培养过程中，WSN-WT病毒和WSN-Y385F病毒均能正常复制，病毒滴度均保持相对稳定、缓慢上升的趋势。结果表明，WSN-Y385F病毒为温度敏感性病毒。

实施例5、动物水平下不同温度下病毒生长曲线的差异

36只体重约17g的6-8周龄BALB/c小鼠经过乙醚麻醉后随机分为三组，每组12只，分别进行如下处理：

第一组：利用鼻吸法吸入50μl实施例3制备的WSN-WT病毒液(病毒滴度为10⁴PFU/ml)；

第二组：利用鼻吸法吸入50μl实施例3制备的WSN-Y385F病毒液(病毒滴度为10⁴PFU/ml)；

第三组：利用鼻吸法吸入50μl灭菌后的PBS缓冲液。

完成上述处理后开始计时，分别于第1天、第3天、第5天、第7天时解剖小鼠(每个时间点每组取3只小鼠)，获得小鼠肺脏和鼻甲骨(鼻甲骨和肺的温度不同，鼻甲骨温度较低、约为33℃，肺部温度较高、约为37℃)。

取0.1g鲜重的肺脏或鼻甲骨，加入1ml冰浴的pH7.2的PBS缓冲液，采用QIAGENTissueLyser II进行组织匀浆(匀浆参数：30循环/s,共计4min)，然后5000g离心10min，收集上清液。

通过噬斑鉴定检测上清液中的病毒滴度(噬斑鉴定方法同实施例3)。

结果见图6。图6中，A为肺脏结果，B为鼻甲骨的结果。

鼻甲骨中，WSN-WT病毒均能正常复制，病毒滴度保持相对稳定、缓慢下降的趋势。鼻甲骨中，WSN-Y385F病毒滴度为0，即WSN-Y385F病毒在33℃不能复制。肺脏中，WSN-WT病毒和WSN-Y385F病毒均能正常复制，病毒滴度均保持相对稳定、缓慢下降的趋势。结果表明，WSN-Y385F病毒为温度敏感性病毒。

序列表

<110> A型流感病毒温度敏感性的关键磷酸化位点及其应用

<120> 中国科学院微生物研究所

<130> GNCYX170081

<160> 10

<210> 1

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ala Thr Lys Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr Asp

1 5 1015

Gly Glu Arg Gln Asn Ala Thr Glu Ile Arg Ala Ser Val Gly Lys Met

202530

Ile Asp Gly Ile Gly Arg Phe Tyr Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu Lys

354045

Leu Ser Asp Tyr Glu Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser Leu Thr Ile Glu

505560

Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg Arg Asn Lys Tyr Leu Glu

65707580

Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Ile

859095

Tyr Arg Arg Val Asp Gly Lys Trp Arg Arg Glu Leu Ile Leu Tyr Asp

100 105 110

Lys Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Gln Ala Asn Asn Gly Asp Asp

115 120 125

Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Met Met Ile Trp His Ser Asn Leu Asn

130 135 140

Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp

145 150 155 160

Pro Arg Met Cys Ser Leu Met Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser

165 170 175

Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Val Gly Thr Met Val Met Glu

180 185 190

Leu Ile Arg Met Ile Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg

195 200 205

Gly Glu Asn Gly Arg Arg Thr Arg Ile Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn

210 215 220

Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Ala Gln Arg Thr Met Val Asp

225 230 235 240

Gln Val Arg Glu Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala Glu Phe Glu Asp Leu

245 250 255

Ile Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His

260 265 270

Lys Ser Cys Leu Pro Ala Cys Val Tyr Gly Ser Ala Val Ala Ser Gly

275 280 285

Tyr Asp Phe Glu Arg Glu Gly Tyr Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe

290 295 300

Arg Leu Leu Gln Asn Ser Gln Val Tyr Ser Leu Ile Arg Pro Asn Glu

305 310 315 320

Asn Pro Ala His Lys Ser Gln Leu Val Trp Met Ala Cys His Ser Ala

325 330 335

Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Ser Ser Phe Ile Arg Gly Thr Lys Val

340 345 350

Val Pro Arg Gly Lys Leu Ser Thr Arg Gly Val Gln Ile Ala Ser Asn

355 360 365

Glu Asn Met Glu Thr Met Glu Ser Ser Thr Leu Glu Leu Arg Ser Arg

370 375 380

Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly Gly Asn Thr Asn Gln Gln Arg

385 390 395 400

Ala Ser Ser Gly Gln Ile Ser Ile Gln Pro Thr Phe Ser Val Gln Arg

405 410 415

Asn Leu Pro Phe Asp Arg Pro Thr Ile Met Ala Ala Phe Thr Gly Asn

420 425 430

Thr Glu Gly Arg Thr Ser Asp Met Arg Thr Glu Ile Ile Arg Leu Met

435 440 445

Glu Ser Ala Arg Pro Glu Asp Val Ser Phe Gln Gly Arg Gly Val Phe

450 455 460

Glu Leu Ser Asp Glu Lys Ala Thr Ser Pro Ile Val Pro Ser Phe Asp

465 470 475 480

Met Ser Asn Glu Gly Ser Tyr Phe Phe Gly Asp Asn Ala Glu Glu Tyr

485 490 495

Asp Asn

<210> 2

<211> 984

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gttctctcta tcgtcccgtc aggccccctc 60

aaagccgaga tcgcacagag acttgaagat gtctttgcag ggaagaacac cgatcttgag 120

gttctcatgg aatggctaaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa ggggatttta 180

ggatttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcggggac tgcagcgtag acgctttgtc 240

caaaatgctc ttaatgggaa cggagatcca aataacatgg acaaagcagt taaactgtat 300

aggaagctta agagggagat aacattccat ggggccaaag aaatagcact cagttattct 360

gctggtgcac ttgccagttg tatgggcctc atatacaaca ggatgggggc tgtgaccact 420

gaagtggcat ttggcctggt atgcgcaacc tgtgaacaga ttgctgactc ccagcatcgg 480

tctcataggc aaatggtgac aacaaccaat ccactaatca gacatgagaa cagaatggtt 540

ctagccagca ctacagctaa ggctatggag caaatggctg gatcgagtga gcaagcagca 600

gaggccatgg atattgctag tcaggccagg caaatggtgc aggcgatgag aaccgttggg 660

actcatccta gctccagtgc tggtctaaaa gatgatcttc ttgaaaattt gcaggcctat 720

cagaaacgaa tgggggtgca gatgcaacga ttcaagtgat cctctcgtca ttgcagcaaa 780

tatcattgga atcttgcact tgatattgtg gattcttgat cgtctttttt tcaaatgcat 840

ttatcgtcgc tttaaatacg gtttgaaaag agggccttct acggaaggag tgccagagtc 900

tatgagggaa gaatatcgaa aggaacagca gaatgctgtg gatgttgacg atggtcattt 960

tgtcaacata gagctggagt aaaa 984

<210> 3

<211> 2202

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctgattcaaa atggaagatt ttgtgcgaca atgcttcaat ccgatgattg tcgagcttgc 60

ggaaaaggca atgaaagagt atggagagga cctgaaaatc gaaacaaaca aatttgcagc 120

aatatgcact cacttggaag tgtgcttcat gtattcagat tttcacttca tcgatgagca 180

aggcgagtca atagtcgtag aacttggcga tccaaatgca cttttgaagc acagatttga 240

aataatcgag ggaagagatc gcacaatagc ctggacagta ataaacagta tttgcaacac 300

tacaggggct gagaaaccaa agtttctacc agatttgtat gattacaaga agaatagatt 360

catcgaaatt ggagtaacaa ggagagaagt tcacatatac tatctggaaa aggccaataa 420

aattaaatct gagaagacac acatccacat tttctcattc actggggagg aaatggccac 480

aaaggccgac tacactctcg atgaagaaag cagggctagg atcaaaacca ggctattcac 540

cataagacaa gaaatggcta gcagaggcct ctgggattcc tttcgtcagt ccgagagagg 600

cgaagagaca attgaagaaa gatttgaaat cacaggaaca atgcgcaagc ttgccgacca 660

aagtctcccg ccaaacttct ccagccttga aaattttaga gcctatgtgg atggattcga 720

accgaacggc tacattgagg gcaagctttc tcaaatgtcc aaagaagtaa atgctagaat 780

tgaacctttt ttgaaatcaa caccacgacc acttagactt ccggatgggc ctccctgttc 840

tcagcggtcc aaattcctgc tgatggatgc cttaaaatta agcattgagg acccaagtca 900

tgagggagag gggataccgc tatatgatgc aatcaaatgc atgagaacat tctttggatg 960

gaaggaaccc aatgttgtta aaccacacga aaagggaata aatccaaatt atcttctgtc 1020

atggaagcaa gtactggcag aactgcagga cattgagaat gaggagaaaa ttccaaggac 1080

taaaaatatg aagaaaacga gtcagttaaa gtgggcactt ggtgagaaca tggcaccaga 1140

aaaggtagac tttgacgatt gtaaagatgt aggcgatttg aagcaatatg atagtgatga 1200

accagaattg aggtcgcttg caagttggat tcagaatgag ttcaacaagg catgtgaact 1260

gaccgattca agctggatag agctcgatga gattggagaa gatgcggctc caattgaaca 1320

cattgcaagc atgagaagga attatttcac agcagaggtg tctcattgca gagccacaga 1380

atacataatg aagggggtgt acatcaatac tgccttgctt aatgcatcct gtgcagcaat 1440

ggatgatttc caattgattc caatgataag caagtgtaga actaaggagg gaaggcgaaa 1500

gaccaatttg tacggtttca tcataaaagg aagatcccac ttaaggaatg acaccgatgt 1560

ggtaaacttt gtgagcatgg agttttccct cactgaccca agacttgaac cacacaaatg 1620

ggagaagtac tgtgttcttg aggtaggaga tatgcttcta agaagtgcca taggccatgt 1680

gtcaaggcct atgttcttgt atgtgaggac aaatggaacc tcaaaaatta aaatgaaatg 1740

ggggatggaa atgaggcgtt gcctccttca gtcacttcaa caaatcgaga gtatgattga 1800

agctgagtcc tctgtcaagg agaaagacat gaccaaagag ttctttgaaa acaaatcaga 1860

aacatggccc gttggagagt cccccaaagg agtggaggaa ggttccattg ggaaggtctg 1920

cagaacttta ttggcaaagt cggtattcaa cagcttgtat gcatctccac aactggaagg 1980

attttcagct gaatcaagaa aactgcttct tatcgttcag gctcttaggg acaacctgga 2040

acctgggacc tttgatcttg gggggctata tgaagcaatt gaggagtgcc tgattaatga 2100

tccctgggtt ttgcttaatg cttcttggtt caactccttc ctcacacatg cattgagata 2160

gttgtggcaa tgctactatt tgctatccat actgtccaaa aa 2202

<210> 4

<211> 2303

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atttgaatgg atgtcaatcc gactttactt ttcttaaaag tgccagcaca aaatgctata 60

agcacaactt tcccttatac tggagaccct ccttacagcc atgggacagg aacaggatac 120

accatggata ctgtcaacag gacacatcag tactcagaaa ggggaagatg gacaacaaac 180

accgaaactg gagcaccgca actcaacccg attgatgggc cactgccaga agacaatgaa 240

ccaagtggtt atgcccaaac agattgtgta ttggaagcaa tggccttcct tgaggaatcc 300

catcctggta tctttgagac ctcgtgtctt gaaacgatgg aggttgttca gcaaacacga 360

gtggacaagc tgacacaagg ccgacagacc tatgactgga ctctaaatag gaaccagcct 420

gctgcaacag cattggccaa cacaatagaa gtgttcagat caaatggcct cacggccaat 480

gaatctggaa ggctcataga cttccttaag gatgtaatgg agtcaatgaa caaagaagaa 540

atggagatca caactcattt tcagagaaag agacgagtga gagacaatat gactaagaaa 600

atggtgacac agagaacaat aggtaaaagg aagcagagat tgaacaaaag gagttatcta 660

attagggcat taaccctgaa cacaatgacc aaagatgctg agagagggaa gctaaaacgg 720

agagcaattg caaccccagg gatgcaaata agggggtttg tatactttgt tgagacacta 780

gcaaggagta tatgtgagaa acttgaacaa tcaggattgc cagttggagg caatgagaag 840

aaagcaaagt tggcaaatgt tgtaaggaag atgatgacca attctcagga cactgaaatt 900

tctttcacca tcactggaga taacaccaaa tggaacgaaa atcagaaccc tcggatgttt 960

ttggccatga tcacatatat aaccagaaat cagcccgaat ggttcagaaa tgttctaagt 1020

attgctccaa taatgttctc aaacaaaatg gcgagactgg gaaaggggta catgtttgag 1080

agcaagagta tgaaacttag aactcaaata cctgcagaaa tgctagcaag catcgatttg 1140

aaatacttca atgattcaac tagaaagaag attgaaaaaa tccggccgct cttaatagat 1200

gggactgcat cattgagccc tggaatgatg atgggcatgt tcaatatgtt aagtactgta 1260

ttaggcgtct ccatcctgaa tcttggacaa aagagacaca ccaagactac ttactggtgg 1320

gatggtcttc aatcttctga tgattttgct ctgattgtga atgcacccaa tcatgaaggg 1380

attcaagccg gagtcaacag gttttatcga acctgtaagc tacttggaat taatatgagc 1440

aagaaaaagt cttacataaa cagaacaggt acatttgaat tcacaagttt tttctatcgt 1500

tatgggtttg ttgccaattt cagcatggag cttcccagct ttggggtgtc tgggatcaac 1560

gagtctgcgg acatgagtat tggagttact gtcatcaaaa acaatatgat aaacaatgat 1620

cttggtccag caaccgctca aatggccctt cagctgttca tcaaagatta caggtacacg 1680

taccggtgcc atagaggtga cacacaaata caaacccgaa gatcatttga aataaagaaa 1740

ctgtgggagc aaacccattc caaagctgga ctgctggtct ccgacggagg cccaaattta 1800

tacaacatta gaaatctcca cattcctgaa gtctgcttga aatgggaatt aatggatgag 1860

gattaccagg ggcgtttatg caacccactg aacccatttg tcaaccataa agacattgaa 1920

tcagtgaaca atgcagtgat aatgccagca catggtccag ccaaaaacat ggagtatgat 1980

gctgttgcaa caacacactc ctggatcccc aaaagaaatc gatccatctt gaatacaagc 2040

caaagaggaa tacttgaaga tgaacaaatg taccaaaagt gctgcaactt atttgaaaaa 2100

ttcttcccca gcagttcata cagaagacca gtcgggatat ccagtatggt ggaggctatg 2160

gtttccagag cccgaattga tgcacgaatt gatttcgaat ctggaaggat aaagaaagag 2220

gagttcactg agatcatgaa gatctgttcc accattgaag agctcagacg gcaaaaatag 2280

tgaatttagc ttgtccttca tga 2303

<210> 5

<211> 2290

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atggaaagaa taaaagaact aaggaatcta atgtcgcagt ctcgcactcg cgagatactc 60

acaaaaacca ccgtggacca tatggccata atcaagaagt acacatcagg aagacaggag 120

aagaacccag cacttaggat gaaatggatg atggcaatga aatatccaat tacagcagac 180

aagaggataa cggaaatgat tcctgagaga aatgagcagg gacaaacttt atggagtaaa 240

atgaatgacg ccggatcaga ccgagtgatg gtatcacctc tggctgtgac atggtggaat 300

aggaatggac cagtgacaag tacagttcat tatccaaaaa tctacaaaac ttattttgaa 360

aaagtcgaaa ggttaaaaca tggaaccttt ggccctgtcc attttagaaa ccaagtcaaa 420

atacgtcgaa gagttgacat aaatcctggt catgcagatc tcagtgccaa agaggcacag 480

gatgtaatca tggaagttgt tttccctaac gaagtgggag ccaggatact aacatcggaa 540

tcgcaactaa cgacaaccaa agagaagaaa gaagaactcc agggttgcaa aatttctcct 600

ctgatggtgg catacatgtt ggagagagaa ctggtccgca aaacgagatt cctcccagtg 660

gctggtggaa caagcagtgt gtacattgaa gtgttgcatt tgacccaagg aacatgctgg 720

gaacagatgt acactccagg aggggaggcg aggaatgatg atgttgatca aagcttaatt 780

attgctgcta gaaacatagt aagaagagcc acagtatcag cagatccact agcatcttta 840

ttggagatgt gccacagcac gcagattggt ggagtaagga tggtaaacat ccttaggcag 900

aacccaacag aagagcaagc cgtggatatt tgcaaggctg caatgggact gagaattagc 960

tcatccttca gttttggtgg attcacattt aagagaacaa gcggatcatc agtcaagaga 1020

gaggaagagg tgcttacggg caatcttcag acattgaaga taagagtgca tgagggatat 1080

gaagagttca caatggttgg gagaagagca acagctatac tcagaaaagc aaccaggaga 1140

ttgattcagc tgatagtgag tgggagagac gaacagtcga ttgccgaagc aataattgtg 1200

gccatggtat tttcacaaga ggattgtatg ataaaagcag ttagaggtga cctgaatttc 1260

gtcaataggg cgaatcagcg attgaatccc atgcaccaac ttttgagaca ttttcagaag 1320

gatgcaaagg tgctctttca aaattgggga attgaatcca tcgacaatgt gatgggaatg 1380

atcgggatat tgcccgacat gactccaagc accgagatgt caatgagagg agtgagaatc 1440

agcaaaatgg gggtagatga gtattccagc gcggagaaga tagtggtgag cattgaccgt 1500

tttttgagag ttagggacca acgtgggaat gtactactgt ctcccgagga ggtcagtgaa 1560

acacagggaa cagagaaact gacaataact tactcatcgt caatgatgtg ggagattaat 1620

ggtcctgaat cagtgttggt caatacctat cagtggatca tcagaaactg ggaaactgtt 1680

aaaattcagt ggtcccagaa tcctacaatg ctgtacaata aaatggaatt tgagccattt 1740

cagtctttag ttccaaaggc cgttagaggc caatacagtg ggtttgtgag aactctgttc 1800

caacaaatga gggatgtgct tgggacattt gataccgctc agataataaa acttcttccc 1860

ttcgcagccg ctccaccaaa gcaaagtgga atgcagttct cctcattgac tataaatgtg 1920

aggggatcag gaatgagaat acttgtaagg ggcaattctc cagtattcaa ctacaacaag 1980

accactaaaa gactcacagt tctcggaaag gatgctggcc ctttaactga agacccagat 2040

gaaggcacag ctggagttga gtccgcagtt ctgagaggat tcctcattct gggcaaagaa 2100

gacaggagat atggaccagc attaagcata aatgaactga gcaaccttgc gaaaggagag 2160

aaggctaatg tgctaattgg gcaaggagac gtggtgttgg taatgaaacg gaaacggaac 2220

tctagcatac ttactgacag ccagacagcg accaaaagaa ttcggatggc catcaattag 2280

tgtcgaatag 2290

<210> 6

<211> 1725

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccaaaatgaa ggcaaaacta ctggtcctgt tatatgcatt tgtagctaca gatgcagaca 60

caatatgtat aggctaccat gcgaacaact caaccgacac tgttgacaca atattcgaga 120

agaatgtggc agtgacacat tctgttaacc tgctcgaaga cagacacaac gggaaactat 180

gtaaattaaa aggaatagcc ccactacaat tggggaaatg taacatcatc ggatggctct 240

tgggaaatcc agaatgcgac tcactgcttc cagcgagatc atggtcctac attgtagaaa 300

caccaaactc tgagaatgga gcatgttatc caggagattt catcgactat gaggaactga 360

gggagcaatt gagctcagta tcatcattag aaagattcga aatatttccc aaggaaagtt 420

catggcccaa ccacacattc aacggagtaa cagcatcatg ctcccatagg ggaaaaagca 480

gtttttacag aaatttgcta tggctgacga agaaggggga ttcataccca aagctgacca 540

attcctatgt gaacaataaa gggaaagaag tccttgtact atggggtgtt catcacccgt 600

ctagcagtga tgagcaacag agtctctata gtaatggaaa tgcttatgtc tctgtagcgt 660

cttcaaatta taacaggaga ttcaccccgg aaatagctgc aaggcccaaa gtaaaagatc 720

aacatgggag gatgaactat tactggacct tgctagaacc cggagacaca ataatatttg 780

aggcaactgg taatctaata gcaccatggt atgctttcgc actgagtaga gggtttgagt 840

ccggcatcat cacctcaaac gcgtcaatgc atgagtgtaa cacgaagtgt caaacacccc 900

agggatctat aaacagcaat ctccctttcc agaatataca cccagtcaca ataggagagt 960

gcccaaaata tgtcaggagt accaaattga ggatggttac aggactaaga aacatcccat 1020

ccattcaata cagaggtcta tttggagcca ttgctggttt tattgagggg ggatggactg 1080

gaatgataga tggatggtat ggttatcatc atcagaatga acagggatca ggctatgcag 1140

cggatcaaaa aagcacacag aatgccatta acgggattac aaacaaggtg aactctatta 1200

tcgagaaaat gaacactcaa ttcacagctg tgggtaaaga attcaacaac ttagaaaaaa 1260

ggatggaaaa tttaaataaa aaagttgatg atgggtttct ggacatttgg acatataatg 1320

cagaattgtt agttctactg gaaaatggaa gaactttgga tttccatgac ttaaatgtga 1380

agaatctgta cgagaaagta aaaagccaat taaagaataa tgccaaagaa atcggaaatg 1440

ggtgttttga gttctaccac aagtgtgaca atgaatgcat ggaaagtgta agaaatggga 1500

cttatgatta tccaaaatat tcagaagaat caaagttgaa cagggaaaag atagatggag 1560

tgaaattgga atcaatgggg gtgtatcaga ttctggcgat ctactcaact gtcgccagtt 1620

cactggtgct tttggtctcc ctgggggcaa tcagtttctg gatgtgttct aatgggtctt 1680

tgcagtgcag aatatgcatc tgagattagg atttcagaaa tataa 1725

<210> 7

<211> 1526

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tcactcacag agtgacatcg aaatcatggc gaccaaaggc accaaacgat cttacgaaca 60

gatggagact gatggagaac gccagaatgc cactgaaatc agagcatctg tcggaaaaat 120

gattgatgga attggacgat tctacatcca aatgtgcacc gaacttaaac tcagtgatta 180

tgagggacgg ctgattcaga acagcttaac aatagagaga atggtgctct ctgcttttga 240

cgagaggagg aataaatatc tagaagaaca tcccagtgcg gggaaagatc ctaagaaaac 300

tggaggacct atatacagga gagtagatgg aaagtggagg agagaactca tcctttatga 360

caaagaagaa ataagacgaa tctggcgcca agctaataat ggtgacgatg caacggctgg 420

tctgactcac atgatgatct ggcactccaa tttgaatgat gcaacttacc agaggacaag 480

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agctgcacaa agaacaatgg tggatcaagt gagagagagc cggaatccag gaaatgctga 780

gttcgaagat ctcatctttt tagcacggtc tgcactcata ttgagagggt cagttgctca 840

caagtcctgc ctgcctgcct gtgtgtatgg atctgccgta gccagtggat acgactttga 900

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gactatggaa tcaagtaccc ttgaactgag aagcagatac tgggccataa ggaccagaag 1200

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<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

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caaagaagaa ataagacgaa tctggcgcca agctaataat ggtgacgatg caacggctgg 420

tctgactcac atgatgatct ggcactccaa tttgaatgat gcaacttacc agaggacaag 480

agctcttgtt cgcacaggaa tggatcccag gatgtgctca ctgatgcagg gttcaaccct 540

ccctaggagg tctggggccg caggtgctgc agtcaaagga gttggaacaa tggtgatgga 600

attgatcaga atgatcaaac gtgggatcaa tgatcggaac ttctggaggg gtgagaatgg 660

acggagaaca aggattgctt atgaaagaat gtgcaacatt ctcaaaggga aatttcaaac 720

agctgcacaa agaacaatgg tggatcaagt gagagagagc cggaatccag gaaatgctga 780

gttcgaagat ctcatctttt tagcacggtc tgcactcata ttgagagggt cagttgctca 840

caagtcctgc ctgcctgcct gtgtgtatgg atctgccgta gccagtggat acgactttga 900

aagagaggga tactctctag tcggaataga ccctttcaga ctgcttcaaa acagccaagt 960

atacagccta atcagaccaa atgagaatcc agcacacaag agtcaactgg tgtggatggc 1020

atgccattct gctgcatttg aagatctaag agtatcaagc ttcatcagag ggacgaaagt 1080

ggtcccaaga gggaagcttt ccactagagg agttcaaatt gcttccaatg aaaacatgga 1140

gactatggaa tcaagtaccc ttgaactgag aagcagattc tgggccataa ggaccagaag 1200

tggagggaac accaatcaac agagggcttc ctcgggccaa atcagcatac aacctacgtt 1260

ctcagtacag agaaatctcc cttttgacag accaaccatt atggcagcat tcactgggaa 1320

tacagagggg agaacatctg acatgagaac cgaaatcata aggctgatgg aaagtgcaag 1380

accagaagat gtgtctttcc aggggcgggg agtcttcgag ctctcggacg aaaaggcaac 1440

gagcccgatc gtgccctcct ttgacatgag taatgaagga tcttatttct tcggagacaa 1500

tgcagaggag tacgacaatt aaagaa 1526