一种诱导葡萄痂囊腔菌产孢的方法

摘要

本发明中公开了一种诱导葡萄痂囊腔菌产孢的方法，该方法取生长在装有PDA培养基的培养皿生长15天的葡萄黑痘病病原真菌菌落的外圈菌丝体接种于新的无菌装有PDA培养基的培养瓶中；25℃下黑暗培养25天后，将培养瓶在21℃下，黑暗放置24小时；用无菌手术刀刮取菌落表面组织，挤压成粉末状，然后放入无菌水中，震荡30秒，取上清液用血球计数板进行孢子计数。该方法操作简单，能够稳定获得较多的分生孢子，以便用于筛选抗黑痘病的葡萄种质，为抗病育种和葡萄病理研究提供保障。

说明书

技术领域

本发明属于果树病理学技术领域，具体涉及一种用于诱导葡萄痂囊腔菌产孢的方法。

背景技术

葡萄病害种类多，危害严重，其中葡萄黑痘病分布广泛，在我国南北多雨地区大量发生，发病严重时最高可造成果实损失50％，严重影响了葡萄的产量和品质，已经成为制约葡萄产业健康发展的主要因素之一。葡萄黑痘病是由葡萄痂囊腔菌(Elsinoe ampelina)引起的一种真菌性病害，危害葡萄的新梢、蔓、叶柄、叶脉、果柄及果实等部位。

葡萄痂囊腔菌的无性阶段为半知菌亚门痂圆孢菌属，有性阶段为子囊菌亚门痂囊腔菌属，在人工培养基上生长缓慢。据报道，葡萄痂囊腔菌在谷类琼脂培养基上生长较好，但培养8周才能达到8cm²左右。该病原菌极难产孢，目前主要通过紫外辐射处理和加水培养获得孢子，但产孢不稳定，操作不便，尤其是产孢量小。

发明内容

针对葡萄痂囊腔菌是葡萄黑痘病的病原菌，该菌生长缓慢，且产孢困难的技术难题，本发明的目的在于，提供一种诱导葡萄痂囊腔菌产孢的方法。

为了实现上述任务，本发明采用如下的技术解决方案：

一种诱导葡萄痂囊腔菌产孢的方法，其特征在于，按以下步骤进行：

(1)取生长在装有PDA培养基的培养皿生长15天的葡萄黑痘病病原真菌菌落的外圈菌丝体接种于新的无菌装有PDA培养基的培养瓶中；

(2)25℃下黑暗培养25天后，将培养瓶在21℃下，黑暗放置24小时；

(3)用无菌手术刀刮取菌落表面组织，挤压成粉末状，然后放入无菌水中，震荡30秒，取上清液用血球计数板进行葡萄痂囊腔菌孢子计数，得到葡萄痂囊腔菌孢子。

根据本发明，所述的PDA培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基配方为：1000毫升纯水、200克马铃薯、20克葡萄糖、15克琼脂。

进一步的，所述的培养瓶为玻璃材质，塑料瓶盖上有0.22微米的微孔，能过滤微生物的透气膜，其规格为250毫升，口径、胸径和瓶高的尺寸分别为5.6厘米、6.9厘米和9.1厘米。

根据本发明，所述的葡萄痂囊腔菌的DNA序列是：

TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGAGGTAGGGTTCTCCTCCGGGAAGCCCGAACTCCCCACCCCTTGCTGTTGCGAATACGTTGCTTCGGCGGGACCCCCCCTTCTGCCCTTCACCGGGGAGGGGGAGGGACCGGGCCTTCACGGGCCCGGGCAGCGCCCGCCGGGGGACCGAACCAACTCTTTTTGTTAAACAATGCAGTCGGAGTACAACGTACATAATCAAATTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCACCAATCAAGCCCCGCTTGGTATTAGGCGATCCGGCCGGCCCCCCCGTGGCCGGCCCGCCCGAAATGCATCGGCGAGGCACCGACCCCCGGCGTGTTAGAATTTCTTTTAACGTCGGGAGCACCGGTGTACCTCCGCCGTGAAACCTTTCTATTTTTCTAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGA。

本发明的诱导葡萄痂囊腔菌产孢的方法，操作简单，能够稳定获得较多的葡萄痂囊腔菌分生孢子，以便用于筛选抗黑痘病的葡萄种质，为抗病育种和葡萄病理研究提供保障。

附图说明

图1是葡萄黑痘病菌的分离和鉴定。A图是从‘红地球’叶片病健交界处长出的菌落接种于新的PDA培养基上生长10天的形态；B图是黑痘病菌分生孢子在培养基上生长6天，长出单菌落的形态；C图是分离纯化后的葡萄黑痘病菌ITS扩增产物，大小为580bp；D图是葡萄黑痘病菌ITS序列与痂囊腔菌属内真菌ITS序列的系统进化分析。

图2是PDA培养皿和PDA培养瓶培养葡萄痂囊腔菌在不同天数的菌落形态图片。其中，A-C图为PDA培养皿上培养0天，10天，15天的形态，标尺为2cm；D图为PDA培养皿上生长25天的菌落形态，标尺为0.5cm；E-G图为PDA培养瓶中培养0，10，15天的菌落形态，标尺为1cm；H图为PDA培养瓶中培养25天的菌落形态，标尺为0.5cm。

图3是温度、光照、诱导时间和培养时间对葡萄痂囊腔菌产孢的影响图。其中，A图是PDA培养瓶中培养25天的葡萄痂囊腔菌分别放置在19℃，21℃，23℃，和25℃下24小时的产孢情况；B图是PDA培养皿和培养瓶中培养25天的葡萄痂囊腔菌分别在光照和黑暗下，21℃下诱导24小时的产孢情况；C图是PDA培养瓶培养25天的葡萄痂囊腔菌黑暗放置在21℃下，不同的诱导时间对产孢的影响情况；D图是PDA培养瓶培养20天，25天，30天和35天后的葡萄痂囊腔菌，黑暗放置在21℃下24小时的葡萄痂囊腔菌产孢情况。

图4是PDA培养瓶培养25天和35天后的菌落形态和诱导产孢的情况图。其中，A图是PDA培养瓶培养25天葡萄痂囊腔菌的菌落形态，标尺为0.5cm；B图是PDA培养瓶培养25天葡萄痂囊腔菌的菌落表面形态，标尺为50μm；C图是PDA培养瓶培养25天的葡萄痂囊腔菌放置在21℃下24小时的产孢情况，标尺为10μm；D图是PDA培养瓶培养35天葡萄痂囊腔菌的菌落形态，标尺为0.5cm；E图是PDA培养瓶培养35天葡萄痂囊腔菌的菌落表面形态，标尺为50μm；F图是PDA培养瓶培养35天的葡萄痂囊腔菌放置在21℃下24小时的产孢情况，标尺为10μm。

以下结合附图和发明人给出的实施例，对本发明作进一步详细说明。

具体实施方式

由于葡萄黑痘病病原菌为葡萄痂囊腔菌，生长缓慢，极难产孢，申请人通过研究培养方式、培养天数、温度和光照对产孢的影响，进而发现：

1)培养瓶培养比培养皿培养更容易产孢；

2)培养瓶培养25天后诱导效果最佳；

3)培养瓶培养25天后，21℃下黑暗诱导24小时，产孢效果最好。

本发明给出的诱导葡萄痂囊腔菌产孢的方法，为痂囊腔菌属真菌诱导产孢提供快速稳定的参考，同时为开展葡萄黑痘病相关研究提供基础。

选择的具体实验包括：

(1)培养方式的确定：由于PDA培养皿培养葡萄痂囊腔菌具有菌落形态的多样性，影响诱导产孢的稳定性，而通过PDA培养瓶培养的葡萄痂囊腔菌在形态上具有一致性，而且培养瓶的产孢量较培养皿大。

(2)培养时间的确定：葡萄痂囊腔菌生长比较缓慢，前期的菌落颜色为暗红色，但在后期菌落颜色变为灰绿色，通过在培养瓶上培养不同天数后进行诱导产孢发现培养25天的产孢量最大。

(3)温度调节产孢：葡萄痂囊腔菌的培养条件为25℃，而在此温度下的不同培养阶段都没有获得孢子。通过设置温度梯度观察对葡萄痂囊腔菌产孢的影响，结果发现在21℃下的葡萄痂囊腔菌产孢效果最好；进一步发现，在21℃下诱导24小时，葡萄痂囊腔菌产孢量最大。

(4)光照对产孢的影响：光照条件下，21℃诱导24小时后发现其产孢量比黑暗条件少，说明光照下不利于诱导葡萄痂囊腔菌产孢，因此黑暗下诱导葡萄痂囊腔菌产孢的效果更好。

以下的实施例中，所使用培养瓶为玻璃材质，塑料瓶盖上有0.22微米的微孔，能过滤微生物的透气膜，其规格为250毫升，口径、胸径和瓶高的尺寸分别为5.6厘米、6.9厘米和9.1厘米。

实施例1：葡萄黑痘病菌的分离和鉴定

采集‘红地球’葡萄发生黑痘病(带有葡萄黑痘病病原真菌)的叶片带回实验室，用手术刀将病健交界处切下，用剪刀剪成3mm×3mm的小块，将剪好的小块放入浓度为2.5％的NaClO溶液中表面消毒2min，再用无菌水漂洗3次。自然晾干后，放置于含50ng/mL链霉素的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上，马铃薯葡萄糖琼脂培养基的配方为：1000毫升纯水、200克马铃薯、20克葡萄糖、15克琼脂。25℃下黑暗培养。生长5天后将长出葡萄痂囊腔菌的菌落转移至新的PDA培养基中继续培养(图1A)。将分生孢子均匀涂布在PDA培养基上，生长6天可长出单菌落，挑取单葡萄痂囊腔菌的菌落接种于新的PDA培养基上(图1B)。利用CTAB法提取葡萄黑痘病菌DNA，通过ITS扩增(正向引物：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGGA-3’，反向引物：5’-TCCTACCTGATCCGAGGTCA-3’)，产物片段大小为580bp(图1C)，测序该产物片段的DNA序列是：

TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGAGGTAGGGTTCTCCTCCGGGAAGCCCGAACTCCCCACCCCTTGCTGTTGCGAATACGTTGCTTCGGCGGGACCCCCCCTTCTGCCCTTCACCGGGGAGGGGGAGGGACCGGGCCTTCACGGGCCCGGGCAGCGCCCGCCGGGGGACCGAACCAACTCTTTTTGTTAAACAATGCAGTCGGAGTACAACGTACATAATCAAATTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCACCAATCAAGCCCCGCTTGGTATTAGGCGATCCGGCCGGCCCCCCCGTGGCCGGCCCGCCCGAAATGCATCGGCGAGGCACCGACCCCCGGCGTGTTAGAATTTCTTTTAACGTCGGGAGCACCGGTGTACCTCCGCCGTGAAACCTTTCTATTTTTCTAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGA(如SEQ ID NO.1所示)。

所得序列在NCBI数据库中进行比对，结果与葡萄黑痘病菌的序列一致性最高，属于痂囊腔菌属中的葡萄痂囊腔菌(图1D)，因此命名为葡萄痂囊腔菌。

实施例2：培养方式对葡萄痂囊腔菌产孢的影响

首先挑取在PDA培养皿上生长15天的葡萄痂囊腔菌菌落边缘，接种于含有PDA培养基的培养皿和含有PDA培养基的培养瓶中(图2A和2E)，25℃下黑暗培养，菌落形态如图2所示，培养25天后，然后将培养皿和培养瓶放置在21℃下诱导24小时，用无菌手术刀刮取菌落表面组织，挤压成粉末状，然后放入无菌水中，震荡30秒，取上清液用血球计数板进行葡萄痂囊腔菌孢子计数，得到葡萄痂囊腔菌孢子。

采用培养瓶培养的葡萄痂囊腔菌的菌落，其产孢量可达5.3×10⁶个/mL，而培养皿每个葡萄痂囊腔菌的菌落在相同条件下的产孢量仅为1.3×10⁶个/mL(图3B)。说明用培养瓶的培养方式葡萄痂囊腔菌在产孢量上优于培养皿。

实施例3：培养时间对葡萄痂囊腔菌产孢的影响

由于葡萄痂囊腔菌生长比较缓慢，前期的葡萄痂囊腔菌的菌落颜色为暗红色，但在后期菌落颜色变为灰绿色，为了探讨培养时间对葡萄痂囊腔菌产孢的影响，对培养瓶培养20天，25天，30天和35天的葡萄痂囊腔菌进行诱导产孢，发现在培养瓶上培养25天，葡萄痂囊腔菌的产孢量最大，而35天的葡萄痂囊腔菌的产孢量仅为0.25×10⁶个/mL(图3D)，说明培养时间长并不利于葡萄痂囊腔菌的产孢。通过形态观察发现，培养35天葡萄痂囊腔菌的菌落表面有大量气生菌丝(图4E)，而且菌丝中产生大量的油胞(图4F)，诱导葡萄痂囊腔菌的产孢量低；而培养25天葡萄痂囊腔菌的菌落表面气生菌丝少(图4B)，未观察到油胞，能够诱导出较多的分生孢子(图4C)。说明培养瓶培养25天是葡萄痂囊腔菌最佳的诱导产孢时期。

实施例4：温度对葡萄痂囊腔菌产孢的影响

为了明确温度对葡萄痂囊腔菌产孢的影响，将培养瓶培养25天的葡萄痂囊腔菌，分别放置在19℃，21℃，23℃和25℃下诱导24小时，结果发现在21℃下诱导，葡萄痂囊腔菌的孢子量最大，达到5.0×10⁶个/mL(图3A)。为进一步确定21℃下需要诱导多长时间，效果最佳，将培养瓶培养25天的葡萄痂囊腔菌放置在21℃下诱导，分别在6小时，12小时，18小时，24小时，30小时后观察产孢量，结果发现21℃下24小时，葡萄痂囊腔菌的产孢量达到稳定(图3C)。

实施例5：光照对葡萄痂囊腔菌产孢的影响

大量的文献报道葡萄痂囊腔菌需要在黑暗条件下进行培养，为了明确光照葡萄痂囊腔菌产孢的影响，将培养瓶或培养皿培养25天的葡萄痂囊腔菌在光照条件下，21℃诱导24小时，结果发现黑暗条件下葡萄痂囊腔菌的产孢效果好于光照条件下(图3B)，说明光照下不利于诱导葡萄痂囊腔菌产孢。

核苷酸或氨基酸序列表

<110> 西北农林科技大学大学

<120>一种诱导葡萄黑痘病病原菌稳定产孢的方法

<160>

<210> 1

<211> 580

<212> SEQ ID NO. 1

<213> DNA

<220>

<400> 1

TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGAGGTAGGGTTCTCCTCCGGGAAGCCCGAACTCCCCACCCC

TTGCTGTTGCGAATACGTTGCTTCGGCGGGACCCCCCCTTCTGCCCTTCACCGGGGAGGGGGAGGGACCGGGC

CTTCACGGGCCCGGGCAGCGCCCGCCGGGGGACCGAACCAACTCTTTTTGTTAAACAATGCAGTCGGAGTACA

ACGTACATAATCAAATTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAT

GCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATT

CCGAGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCACCAATCAAGCCCCGCTTGGTATTAGGCGATCCGGCCGGCCC

CCCCGTGGCCGGCCCGCCCGAAATGCATCGGCGAGGCACCGACCCCCGGCGTGTTAGAATTTCTTTTAACGTC

GGGAGCACCGGTGTACCTCCGCCGTGAAACCTTTCTATTTTTCTAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGA

<210> 2

<211>25

<212>正向引物

<213> DNA

<220>

<400> 2

5’- TCCGTAGGTGAACCTGCGGA-3’

<210> 3

<211>25

<212>反向引物

<213> DNA

<220>

<400> 3

5’- TCCTACCTGATCCGAGGTCA-3’