桑树白粉病病原菌Phyllactinia mori的核糖体RNA序列及其应用

摘要

本发明首次公开了一种桑树白粉病病原菌Phyllactinia mori的核糖体RNA的全长cDNA序列及其应用。Phyllactinia mori的核糖体RNA的全长cDNA序列如如SEQ.ID.NO1所示，其序列上包含的2对引物序列如SEQ.ID.NO2～5所示。本发明将Phyllactinia mori的核糖体RNA的cDNA序列应用于检测Phyllactinia mori菌中，可同时得到定性及定量的结果。结果显示，在对桑树白粉病病叶上真菌的研究中，相对丰度最高真菌的为Phyllactinia属病原菌。此外，Phyllactinia mori的核糖体RNA的cDNA序列可应用于真菌种属分类方面的研究中。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种桑树白粉病病原Phyllactinia mori的核糖体RNA序列及其应用。

背景技术

现有的真菌研究方法中，常常通过核糖体DNA(ribosome DNA，rDNA)序列进行测序比对用于真菌的鉴定。核糖体在细胞中具有重要功能，rDNA编码的基因许多都与蛋白质合成的反应过程密切相关，在蛋白质的生物合成中起决定作用。rDNA序列分为转录区和非转录区，转录区由编码核糖体5.8S、18S、28S蛋白结构的基因和基因间的2个转录间隔区(Internal Tanscribed Spacer，ITS)ITS1、和ITS2组成，共同组成一个转录单位。

rDNA中编码5.8S、18S、28S的rDNA序列较为保守，可以用于分析自然界物种分类的科间或更高级阶元间的血系研究的分子标记。由于5.8SrDNA序列短、且高度保守，难以用于真菌的系统发育和分子鉴定；而18SrDNA的片段较长，片段中存在保守区和可变区，因此，现有研究中，通过选择不同的特异性扩增引物将某一结构域片段扩增后，经过测序以及对测序结果的分析比对，可用于真菌目、科、属等分类阶元的研究。但是，基于5.8S、18S、28S的rDNA序列难以对真菌种属的分类进行研究，不能确定病原真菌的种属，因此，需要利用rRNA的全长序列来进行研究。

发明内容

本发明的要解决的技术问题是弥补现有技术的空白，提供一种桑树白粉病病原菌Phyllactinia mori的核糖体RNA的全长cDNA序列。

本发明的另一个目的在于提供桑树白粉病病原菌Phyllactinia mori的核糖体RNA序列在定量检测桑树白粉病病原菌Phyllactinia mori的应用。

本发明的再一目的在于提供桑树白粉病病原菌Phyllactinia mori的核糖体RNA序列在定量检测桑树白粉病病原菌Phyllactinia mori应用的方法。

本发明的还一个目的在于提供桑树白粉病病原菌Phyllactinia mori的核糖体RNA序列在真菌种属分类方面的应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种桑树白粉病病原菌Phyllactinia mori核糖体RNA的全长cDNA序列，如SEQ.ID.NO1所示。

所述核糖体RNA的全长cDNA序列中包含2对引物序列，所述引物序列分别如SEQ.ID.NO2～SEQ.ID.NO5所示。

本发明还提供了所述桑树白粉病病原菌Phyllactinia mori核糖体RNA的cDNA序列在定量检测桑树白粉病病原菌Phyllactinia mori的应用。

本发明还提供了所述桑树白粉病病原菌Phyllactinia mori核糖体RNA的cDNA序列在定量检测桑树白粉病病原菌Phyllactinia mori应用的方法，包括以下步骤：

S1.收集桑树病叶；

S2.提取桑树病叶的总DNA；

S3.IlluminaDNA文库构建；

S4.Illumina高通量测序；

S5.去除测序数据中桑树基因组序列；

S6.组装微生物基因组序列；

S7.组装完整核糖体DNA序列；

S8.对比分析核糖体DNA序列；

步骤S3所述Illumina DNA文库构建的方法为：依照Illumina文库构建流程，将所述步骤S2中所述总DNA构建为片段大小400～600bp的双末端高通量测序文库；

步骤S5所述去除测序数据中桑树基因组序列的方法为：利用比对软件对步骤S4中所述高通量测序数据进行数据比对分析。选择比对算法，将所述测序数据与桑树参考基因组进行比对，并将比对上参考基因组的所述测序数据判定为桑树基因组序列。使用编写的计算机程序从所述测序数据中去除桑树基因组序列。

S5所述去除桑树的基因组DNA序列选用的参考基因组序列为：

桑属(Morus notabilis)全基因组序列(GCA_000414095.2)和叶绿体基因组序列(NC_027110.1)。

优选地，所述比对软件为bwa(0.7.12-r1039)软件；

优选地，所述比对算法为mem比对算法；

优选地，所述将测序数据与桑树参考基因组进行比对选用的是双末端比对方法和bwa(0.7.12-r1039)软件的默认参数；

优选地，所述编写的计算机程序是用python计算机语言编写。

步骤S6所述组装微生物基因组序列的方法为：使用组装软件对步骤S5所述已去除桑树基因组序列的测序数据进行组装。

优选地，所述组装软件为MetaVelvet(v1.2.01)。

步骤S7所述组装完整核糖体DNA序列的方法为：采用比对软件，对所述组装序列进行比对，根据比对结果从测序数据中获取双末端测序片段，使用组装软件对序列进行组装和延伸，经多个循环操作，直至获得完整的核糖体DNA序列；

优选地，所述比对软件为bwa(0.7.12-r1039)软件；

优选地，所述比对方法采用无错配0mismatch和无断裂0gap比对；

优选地，所述组装软件为MetaVelvet(v1.2.01)软件。

本发明的还提供了桑树白粉病病原菌Phyllactinia mori的核糖体RNA的cDNA序列在真菌种属分类方面的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明首次提供了所述桑树白粉病病原菌Phyllactinia mori的核糖体RNA的cDNA序列，基于所述序列建立了一种新的真菌种属分类方法，尤其是在定量检测桑树白粉病病原菌Phyllactinia mori具有良好的应用。

附图说明

图1验证核糖体组装结果的两对引物与两对通用引物ITS1/ITS4、ITS4/ITS5电泳图。

图2组装核糖体DNA序列组成与碱基GC比例分布。

图3桑叶白粉病斑叶片所检测到的真菌微生物分类树。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的应用方法。下述实施例和附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂原料为常规市购或商业途径获得的生试剂原料，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。

实施例1

在发病的桑园随机寻找到的具有典型白粉病病斑的叶片，收集，剪取桑叶中的病斑区域，剪下的病斑材料使用液氮充分研磨，提取桑树病叶的总RNA；提取的总RNA贮存于-80℃。将总RNA反转录成cDNA文库；设计引物序列和通用引物序列ITS1、ITS4、ITS5分别如SEQ.ID.NO2～SEQ.ID.NO8所示，见表1。以cDNA文库为模板进行PCR扩增；PCR反应体系见表2所示。

表1 PCR验证引物序列表

表2 PCR反应体系(20μL)

ITS1和ITS4引物组PCR程序：预变性94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min。

ITS4和ITS5引物组PCR程序：预变性94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min。

验证核糖体组装结果的P1-F/R引物组PCR反应体系(20μL)PCR程序：94℃5min；94℃1min，56℃1min，72℃2min30s，30个循环；72℃10min。

验证核糖体组装结果的P2-F/R引物组PCR反应体系(20μL)PCR程序：94℃5min；94℃1min，56℃1min，72℃3min30s，30个循环；72℃10min。

取3μLPCR扩增产物用1.2％的琼脂糖凝胶(EB染色)电泳检测。通过琼脂糖凝胶电泳回收大小对应的PCR产物片段，见附图1所示，图1中，M：Takara DL5000Marker；1.真菌通用引物ITS1和ITS4；2.真菌通用引物ITS4和ITS5；3.验证核糖体组装结果引物P1-F和P1-R；4.验证核糖体组装结果引物P2-F和P2-R；5.空白水对照。

将回收的片段进行Sanger测序；然后将测序结果与桑树白粉病病原菌Phyllactinia mori的核糖体RNA的全长cDNA序列进行比对，由此确定叶片上是否有桑树白粉病病原菌Phyllactinia mori，并可由此推测桑树白粉病病原菌Phyllactinia mori是否可能是致病菌。

由图1可知，泳道1和2的结果说明用真菌通用引物ITS1和ITS4扩增的模板DNA是属于真菌的DNA，但两对引物均能扩增桑树的DNA；而验证核糖体组装结果的P1引物组和P2引物组的PCR结果分别是见泳道3和4，均扩增到相应的目的条带，，进一步测序后的结果与组装的结果高度一致。

实施例2应用实验

在发病的桑园随机寻找到的具有典型白粉病病斑的叶片，收集，剪取桑叶中的病斑区域，剪下的病斑材料使用液氮充分研磨，总DNA的提取使用康为世纪真菌DNA提取试剂盒，具体按照其操作说明进行，提取后的总DNA保存于-20℃。依照Illumina文库构建流程，将总DNA构建为片段大小400～600bp的双末端高通量测序文库，使用Illumina Hiseq2500测序仪对构建好的DNA文库进行高通量测序，共测得16.20M对测序片段，测序读长为双末端125bp，总测序数据量4.05Gb。

由于DNA提取过程中包含叶片材料，为减少测序数据中桑树基因组数据对微生物序列组装的影响，在进行微生物序列组装前首先去除桑树的基因组DNA序列。选取已经公开的桑树Morus notabilis全基因组序列(GCA_000414095.2)和叶绿体基因组序列(NC_027110.1)作为参考基因组序列，采用bwa(0.7.12-r1039)比对软件进行数据比对分析。比对选择mem比对算法，使用双末端比对方法和软件的默认参数，将测序数据与桑树参考基因组进行比对，并将比对上参考基因组的测序片段判定为桑树基因组序列。使用python编写的计算机程序从fastq测序数据中去除桑树测序数据，然后再进入微生物序列组装。微生物序列的组装使用MetaVelvet(v1.2.01)组装软件进行。

真菌的核糖体DNA由18S区段，ITS1区段，5.8S区段，ITS2区段和28S区段组成，序列总长度约为5.5Kb。MetaVelvet(v1.2.01)初始组装的序列标签为断裂的核糖体标签，为得到完整的核糖体DNA序列，分析采用序列捕获和从头组装策略，以组装完整的核糖体DNA。选择包含目标病原菌ITS序列的核糖体DNA序列为参考序列，采用bwa(0.7.12-r1039)软件进行0mismatch和0gap比对，根据比对结果从测序数据中获取双末端测序片段，进一步采用MetaVelvet(v1.2.01)组装软件对序列进行组装和延伸，经多个循环操作，获取完整的核糖体DNA序列。

组装得到桑树白粉病病原菌Phyllactinia mori完整核糖体DNA序列，见附图2，长度5722bp(GC比例49.91％)。序列包含18S区域，ITS1区域，5.8S区域，ITS2区域，28S区域。其中18S区域长度1800bp(GC比例47.33％)，ITS1区域长度233bp(GC比例59.66％)，5.8S区域长度155bp(GC比例47.10％)，ITS2区域长152bp(GC比例62.50％)，28S区域长3382bp(GC比例50.18％)。18S区域和28S区域长度较大，占序列总长度的90.56％；而在GC比例上，ITS1区域(59.66％)和ITS2区域(62.50％)的平均GC比例则明显高于其他区域。

序列标签注释使用blastn(2.2.31+)序列比对分析软件，组装的序列标签序列与NCBI的nt数据库进行比对，blastn比对设定期望值<1e-20，根据比对结果对序列标签进行注释。核糖体DNA序列是细菌和真菌鉴定的重要的最常用的分子标记，因此物种分类鉴定和定量以核糖体DNA为主要分子标记。根据序列标签注释结果，选择核糖体DNA序列作为微生物鉴定与定量分析依据。使用bwa(0.7.12-r1039)+samtools(v1.2)分析软件，计算测序数据中核糖体DNA片段的平均测序深度，并以此作为该物种的丰度值。

结果显示，共鉴定出3种真菌，其中相对丰度最高的为Phyllactinia属病原菌。通过对序列标签注释结果的查询以及与桑树白粉病病原菌Phyllactinia mori核糖体RNA的全长cDNA序列的比对，发现相对丰度最高真菌的为Phyllactinia属病原菌，见附图3所示。

SEQUENCE LISTING

<110>华南农业大学

<120>桑树白粉病病原菌Phyllactinia mori 的核糖体RNA序列及其应用

<130>

<160>8

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>5722

<212>DNA

<213>Phyllactinia mori 核糖体RNA的全长cDNA序列

<400>1

acctggttga ttctgccagt agtcatatgc ttgtctcaaa gattaagcca tgcatgtcta 60

agtataagca aattataccg tgaaactgcg aatggctcat taaatcagtt atcgtttatt120

tgatagtatc tcactacttg gataaccgtg gtaattctag agctaataca tgctaaaagc180

cctgacgtca gaaggggtgt atttattaga ttaaaaacca atgcccttcg gggctcgatg240

gtgattcata ataacttaac gaatcgcatg gccttgtgcc ggcgatggtt cattcaaatt300

tctgccctat caactttcga tggtagtata tgggactacc atggtttcaa cgggtaacgg360

ggaattaggg ttctattccg gagagggagc ctgagaaacg gctaccacat ccaaggaagg420

cagcaggcgc gcaaattacc caatcccgac acggggaggt agtgacaata aatactgata480

cagggctctt ttgggtcttg taattggaat gagtacaatt taaatccctt aacgaggaac540

aattggaggg caagtctggt gccagcagcc gcggtaatac cagctccaat agcgtatatt600

aaagttgttg cagttaaaaa gctcgtagtt gaaccttggg cctggctggc cggtccgcct660

caccgcgtgc actggtccgg ccgggtcttt cctcctgggg agccgcatgc ccttcactgg720

gtgtgtcggg gaaccaggac ttttactttg aaaaaattag agtgttcaaa gcaggcctat780

gctcgaatac attagcatgg aataatagaa taggacgtgt ggttctattt tgttggtttc840

tcggaccgcc gtaatgatta atagggatag tcgggggcat cagtattcaa ttgtcagagg900

tgaaattctt ggatttattg aagactaact actgcgaaag catttgccaa ggatgttttc960

attaatcagc gaacgaaagt taggggatcg aagacgatca gataccgtcg tagtcttaac 1020

cataaactat gccgactagg gatcgggcga tgttattttt tttgactcgc tcggcacctt 1080

acgagaaatc aaagtctttg ggttctgggg ggagtatggt cgcaaggctg aaacttaaag 1140

aaattgacgg aagggcacca ccaggagtgg agcctgcggc ttaattcgac tcaacacggg 1200

gaaactcacc aggtccagac acaataagga ttgacagatt gagagctctt tcttgatttt 1260

gtgggtggtg gtgcatggcc gttcttagtt ggtggagtga tttgtctgct taattgcgat 1320

aacgaacgag accttaacct gctaaatagc caggctagcc ttggctggtc gccggcttct 1380

tagagggact atcggctcaa gccgatggaa gtttgaggca ataacaggtc tgtgatgccc 1440

ttagatgttc tgggccgcac gcgcgctaca ctgacagagc caacgagtat cttccttgtt 1500

cgagagatct gggtaatctt gttaaactct gtcgtgctgg ggatagagca ttgcaattat 1560

tgctcttcaa cgaggaattc ctagtaagcg caagtcatca gcttgcgctg attacgtccc 1620

tgccctttgt acacaccgcc cgtcgctact accgattgaa tggctaagtg aggctttcgg 1680

actggcccag ggagagtggc gacactcccc cagggccgga aagttgtcca aacttggtca 1740

tttagaggaa gtaaaagtcg taacaaggtt tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta 1800

ctgagcgtga agactctcgg tcccccgccc cattggtgca agccagtgcg aggggggagc 1860

atggccggag tcgaccctcc cacccgtgtc gataaaaacg tctgttgctt tggtaggccg 1920

gggcccgcct ggcggatccc gctggccttt gatggctgga gcgtgcctgc cagagaaagt 1980

tggacaactc gtgtgattga tgaagtctga gcaaccaagt gggaaattag ttaaaacttt 2040

caacaacgga tctcttggct ctggcatcga tgaagaacgc agcgaaatgc gataagtaat 2100

gtgaattgca gaatctagtg aatcatcgaa tctttgaacg cacattgcgc cccttggtat 2160

tccgaggggc atgcctgttc gagcgtcaaa acaacccctc aagtcgctct ggcttggtct 2220

tggggcccgc ccgcgacagc gtggcggccc ttaaatctag tggcggtgcc ggtggtgctc 2280

tccgtgtagt cacgttctcg cgacagggca gcactggacc cagccaaaag acaacctgtg 2340

cgtctgtcgc acgctatcta tggttgacct cgaatcaggt agggataccc gctgaactta 2400

agcatatcaa taagcggagg aaaagaaacc aaccgggatt accctagtaa cggcgagtga 2460

agcggtaaca gctcaaattt gaaatctggc tccctgcgga gtccgagttg taatttgtag 2520

aagatgcttt gggtgcttgg cccggcctaa gttccttgga acaggacgtc gtagagggtg 2580

agaatcccgt atgcggccag tgtcggcgcc cgtgtaaagc tctttcgacg agtcgagttg 2640

tttgggaatg cagctcaaaa tgggtggtaa atttcatcta aagctaaata tgggccagag 2700

accgatagcg cacaagtaga gtgatcgaaa gatgaaaagc actttggaaa gagagttaaa 2760

cagtacgtga aattgttgaa agggaagcgc ttgcaaccag acttgggcgt cgctgatcat 2820

ccaaagacac tctttggtgc actcgacgac gcacaggcca gcatcggttg gagtggtggg 2880

agaaaggttg ccggaacgtg gctcttttcg gagagtgtta tagccggcga cgcaataccg 2940

cctaccccga ccgaggaccg cgcttcggct aggatgctgg cgtaatggtt gtaagcgacc 3000

cgtcttgaaa cacggaccaa ggagtctaac atctatgcga gtgtttgggt gtgaaaccca 3060

tgcgcggaat gaaagtgaac gtaggtgaga acccttcgag ggggcatcat cgaccgatcc 3120

tgatgtcttc ggatggattt gagtaagagc atagctgttg ggacccgaaa gatggtgaac 3180

tatgcctgaa tagggtgaag ccagaggaaa ctctggtgga ggctcgcagc ggttctgacg 3240

tgcaaatcga tcgtcaaatt tgggtatagg ggcgaaagac taatcgaacc atctagtagc 3300

tggttcctgc cgaagtttcc ctcaggatag cagtgttgac ttcagtttta tgaggtaaag 3360

cgaatgatta gaggccttgg ggttgaaaca accttaacct attctcaaac tttaaatatg 3420

taagaagtcc ttgttactta attgaacgtg gacatccgaa tgtaccaaca ctagtgggcc 3480

atttttggta agcagaactg gcgatgcggg atgaaccgaa cgtgaagtta aggtgccgga 3540

atacacgctc atcagacacc acaaaaggtg ttagttcatc tagacagcag gacggtggcc 3600

atggaagtcg gaaaccgcta aggaatgtgt aacaactcac ctgccgaatg aactagccct 3660

gaaaatggat ggcgcttaag cgtgttaccc atacttcacc gccagggtag aaacgatgcc 3720

ctggcgagta ggcaggcgtg gaggtcagtg acgaagcctt gggagtgatc ctgggtcgaa 3780

cggcctctag tgcagatctt ggtggtagta gcaaatactc aaatgagaac tttgaggact 3840

gaagtgggga aaggttccat gtgaacagca gttggacatg ggttagtcga tcctaagaga 3900

tagggaaact ccgttttaaa gtgcgcactt gttgcgccgt ccctcgaaag ggaagccggt 3960

taatattccg gcacctggat gtggattctc cacggcaacg taactgaaag cggagacggc 4020

ggcgggggcc ctgggaagag ttctcttttc ttcttaacag cctctcaccc tgaaatcggt 4080

ttgtccggag ctagggttta acggttggta gagcctgaca cctctgtcag gtccggtgcg 4140

ctctcgacgt cccttgaaaa tccgctggag ggaatagttt tcacgccagg tcgtactcat 4200

aaccgcagca ggtctccaag gtgaacagcc tctagttgat agaacaatgt agataaggga 4260

agtcggcaaa atagatccgt aacttcggga aaaggattgg ctctaagggt tgggtgcgtt 4320

gggccttggt tgggaagtcc ttggagcagg tcgccactag cctcaccgcc ggcggcttcc 4380

agcatcgggg gtctgacggc cttggcagct ttcgggcgtc cggcgtacaa ttaacaacca 4440

acttagaact ggtacggaca aggggaatct gactgtctaa ttaaaacata gcattgcgat 4500

ggccagaaag tggtgttgac gcaatgtgat ttctgcccag tgctctgaat gtcaaagtga 4560

agaaattcaa ccaagcgcgg gtaaacggcg ggagtaacta tgactctctt aaggtagcca 4620

aatgcctcgt catctaatta gtgacgcgca tgaatggatt aacgagattc ccactgtccc 4680

tatctactat ctagcgaaac cacagccaag ggaacgggct tggcagaatc agcggggaaa 4740

gaagaccctg ttgagcttga ctctagtttg acattgtgaa aagacataga gggtgtagga 4800

taggtgggag cgcaagcgcc agtgaaatac cactaccttt atcgtttttt tacttattca 4860

atgaagcgga gctgggggtc aaagcccatt tctagcgtta aggtccttcg cgggctgatc 4920

cgggttgaag acattgtcag gtggggagtt tggctggggc ggcacatctg ttaaaccata 4980

acgcaggtgt cctaaggggg actcatggag aacagaaatc tccagtagaa caaaagggta 5040

aaagtcccct tgattttgat tttcagtgtg aatacaaacc atgaaagtgt ggcctatcga 5100

tcctttagtc cctcgaaatt tgaggctaga ggtgccagaa aagttaccac agggataact 5160

ggcttgtggc agccaagcgt tcatagcgac gttgcttttt gatccttcga tgtcggctct 5220

tcctatcata ccgaagcaga attcggtaag cgttggattg ttcacccact aatagggaac 5280

gtgagctggg tttagaccgt cgtgagacag gttagtttta ccctactgat gattgtcacc 5340

gcaatggtaa ttcagcttag tacgagagga accgctgatt cagataattg gttttggcgg 5400

ctgtctgacc aggcagtgcc gcgaagctac catctgctgg ataatggctg aacgcctcta 5460

agtcagaatc catgccagaa agcggcgatt acctcccaca catcgtagtc ggatacgaat 5520

aggcccctag ggccctgcat cttagctggt cggcatcggc cctcgcggag aagtctcgag 5580

ggctagctga cgtcttgcaa ttgaccatgc gtggggataa aacctttgca tacgacttag 5640

ttatatcagg cggtgctgta aatagtagag tagtcttgtt attacgatct attgaggctc 5700

agccgcgctg gtttagtttt gt5722

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>引物P1-F序列

<400>2

gccaaatgca ttgtgctgga 20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>引物P1-R序列

<400>3

atcgatgcca gagccaagag 20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>引物P2-F序列

<400>4

cagcttgcgc tgattacgtc 20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>引物P2-R序列

<400>5

gccacaagcc agttatccct 20

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>通用引物ITS1序列

<400>6

tccgtaggtg aacctgcgg19

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>通用引物ITS4序列

<400>7

tcctccgctt attgatatgc 20

<210>8

<211>22

<212>DNA

<213>通用引物ITS5序列

<400>8

ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg22